專利名稱：生產(chǎn)異黃酮苷元的方法
發(fā)明的所屬領域本發(fā)明涉及生產(chǎn)異黃酮的方法，特別是涉及從豆科植物中提取異黃酮葡糖苷并使用植物來源的糖苷鍵水解酶由異黃酮葡糖苷轉化生產(chǎn)異黃酮苷元的方法。
發(fā)明的背景異黃酮是主要存在于豆科植物特別是大豆中的一類具有簡單的二苯環(huán)結構的植物化學物質。在植物中，異黃酮主要以下列幾種形式存在(1)苷元形式；(2)可通過β-葡糖苷鍵與糖部分(如葡萄糖)結合的糖苷配基形式；(3)糖苷形式+丙二酰部分；(4)糖苷形式+乙酰部分。其中葡糖苷形式是水溶性的并且是異黃酮在植物中便于運輸和儲存的主要存在形式。在植物細胞內(nèi)，β-葡糖苷酶裂解糖部分，產(chǎn)生具有更強生物學活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的異黃酮。
研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮作為一類植物雌激素，具有調節(jié)和緩解與女性內(nèi)源性雌激素水平降低或改變有關的癥狀(參見美國專利5,569,459、5,498,631、5,516528和WO99/48496)，另外，異黃酮還具有抗氧化(參見美國專利4,232122和4,366,082)、降低體內(nèi)膽固醇含量(參見Anthony et al.，J.Nutr.，125Suppl.3S803S-804S，1995)，維持和改善骨組織生長(參見美國專利6,369,200)，以及維持正常血管功能(Circulation，901259，1994)等活性。特別是最近的研究還顯示，植物材料如大豆中含有的異黃酮苷元(異黃酮糖苷配基)可以抑制乳腺癌和前列腺癌等人類腫瘤細胞的生長(Biochem.And Biophy.Reas.Commmun.1791，661-667，1991；The Prostate，22335-345，1993)。
異黃酮苷元是具有不含糖部分的游離二苯環(huán)結構的分子，主要包括比異黃酮糖苷具有更強活性的染料木黃酮(Gen)、大豆苷元(Den)和大豆黃素。從作為藥物和保健食品應用角度，異黃酮苷元的提取和制備已引起了人們的更大興趣。
將連接有糖苷基團的異黃酮結合物轉化為不含糖基的異黃酮苷元的一般方法是已知的(例如參見美國專利5,827,682、5,851,792和6,146,668；日本專利申請22258,669、日本專利89-345164/47以及國際專利申請PCT/US/94/10699)?，F(xiàn)有技術中，由天然存在的異黃酮糖苷或異黃酮結合物(即葡萄糖分子上連接有其他附加部分的異黃酮，例如6”-O-乙二酰染料木苷)轉化成異黃酮苷元的方法包括一是首先于低pH下加熱(80-100℃)處理大豆蛋白提取物，然后使之與能夠裂解分子中β-1，4-糖苷鍵的水解酶接觸。水解后，將不溶的植物材料與水相分離開，然后加入適當?shù)挠袡C溶劑，由此提取并分離得到所需的異黃酮苷元。所使用的水解酶可以是植物材料中天然存在的，或者是外加的。其中，外加的糖水解酶包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶等。在利用植物材料內(nèi)存在的天然酶活性的情況下，一般需要將植物材料(例如大豆粉)于45-55℃條件下加熱幾小時(參見日本專利89-345164/47)。但在僅僅利用內(nèi)源酶的情況下，只能達到大約50％的轉化率。
第二種方法是，首先將磨碎的植物(大豆)材料與水混合一定時間(幾天至幾小時)，使天然糖苷形式的異黃酮充分溶解于水相中。從水相中分離不溶性材料后，再使用上述酶水解方法將水相中的異黃酮轉化成其苷元形式，然后回收之。或者，亦可首先以離子交換樹脂吸附法從水相混合物中選擇性地除去苷元，然后使用水有機溶劑混合物從樹脂柱上洗脫異黃酮，蒸發(fā)濃縮后使用酶促消化或加熱/酸水解方法將異黃酮轉化成其苷元形式(參見日本專利95-272884/36)。
上述這些方法的均存在以下幾個方面的缺點(1)需要多個處理步驟；(2)需進行加熱和強酸或強堿處理；(3)異黃酮的產(chǎn)率較低；以及(4)所使用的水解酶的成本很高。因此，本領域有必要提供一種更為簡便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)應用，而且成本更低的生產(chǎn)異黃酮苷元的方法。
發(fā)明的目的本發(fā)明的一個目的是提供一種利用外源性糖苷鍵水解酶從豆科植物材料來源的異黃酮葡糖苷制備異黃酮苷元的方法，特征在于其中所說的糖苷鍵水解酶是植物來源的混合酶。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的豆科植物材料選自豆科植物種子、發(fā)芽種子、胚芽或脫脂大豆粕。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的豆科植物選自大豆和黑豆。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的混合酶是具有β-1，4-糖苷鍵水解活性的苦杏仁苷酶和櫻葉酶的混合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的混合酶的加入量約占底物重量的0.1-10％。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明涉及生產(chǎn)異黃酮的方法，特別是涉及從豆科植物中提取并使用植物來源的酶由異黃酮葡糖苷轉化得到異黃酮苷元的方法。
如前所述，天然狀態(tài)下異黃酮在植物體內(nèi)基本上是以異黃酮葡糖苷的形式存在的。在細胞內(nèi)的生化功能部位，內(nèi)源性β-葡糖苷酶裂解分子的糖部分，產(chǎn)生有更強生物學活性但基本上不溶于水的糖苷配基即苷元形式的異黃酮。
根據(jù)本發(fā)明，本領域技術人員可以按照任何一種已知的方法由豆科植物特別是大豆或黑豆中分離天然存在的異黃酮葡糖苷和其結合物，然后利用植物特別是苦杏仁來源的β-1，4-糖苷鍵水解酶，并在植物材料(特別是豆科植物胚芽或發(fā)芽的豆科植物種子)本身的內(nèi)源性酶的幫助下，以接近100％的轉化效率將異黃酮糖苷轉化成其苷元形式。
可以使用多種不同的方法從植物材料中分離并純化包括糖苷和苷元兩種形式的異黃酮。例如，可以用水與有機溶劑的混合物(例如60％乙醇)提取干燥的植物材料；將提取物與不溶性植物材料分離開并除去有機溶劑；然后濃縮含水相即得到所需的異黃酮(國際專利申請WO99/23069)?；蛘?，用水與有機溶劑的混合物(例如60％乙醇)提取預干燥的植物材料(例如紅花草)；除去不溶性的植物材料和有機溶劑并用其他有機溶劑如石油醚提取水相；除去有機溶劑并干燥水相后以HPLC法分離得到含芳族發(fā)色基團的異黃酮(國際專利申請WO99/43335)。或者，首先用水與有機溶劑的混合物(例如60％乙醇)提取干燥并磨碎的新鮮植物材料；分離提取物并除去有機溶劑；再用有機溶劑如石油醚、己烷或乙酸乙酯提取水相；然后除去有機溶劑并干燥水相即得到所需的異黃酮組合物(國際專利申請WO99/48496)?；蛘?，可以首先用pH值高于植物材料中蛋白質等電點的含水萃取劑提取含異黃酮和蛋白質的植物材料；然后分離含水提取物并在大約45-75℃和pH6-10條件下處理所說的提取物，以將異黃酮結合物轉化成異黃酮葡糖苷(參見美國專利5,726,034和6,015,785)。
總結上述這些方法，一個共同的特征是，在用有機溶劑提取異黃酮之前，最好首先用水或與水混溶的有機溶劑將(干燥的)植物材料浸漬足夠長的時間，以期使植物材料自身所含有的糖苷鍵水解酶盡可能地釋放出來，并在原位發(fā)揮作用，以將結合并不十分牢固的異黃酮-糖結合體分離開。其中所使用的水混溶性有機溶劑可以是含1-4個碳原子的醇(如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇)，以及乙二醇、丙二醇、丁二醇、乙酸乙酯和丙酮等。浸漬過程最好在大約25℃避光和惰性環(huán)境下完成，并且最好預先將被浸漬的植物材料磨碎。
因此，為了從豆科植物材料中得到有足夠高異黃酮(特別是異黃酮苷元)含量的提取物，可以首先用至少一種與水混溶的有機溶劑提取干燥的植物材料；分離除去不溶性的植物材料后，再用脂族烴(例如正庚烷)處理如上得到的溶液以除去油脂類物質；除去有機溶劑并干燥后，即得到含有較大量異黃酮特別是異黃酮苷元的固體殘留物。
然而，由于植物材料例如大豆粉或其提取物中內(nèi)源性葡糖苷水解酶的含量有限，再加上有機溶劑可能對酶造成的分解破壞，所以在工業(yè)化生產(chǎn)異黃酮苷元的實踐中，常常需要在得到以糖苷形式為主的異黃酮產(chǎn)物之后，再利用外源的β-1，4-糖苷鍵水解酶將異黃酮糖苷轉化成苷元形式的游離異黃酮。或者，在利用植物材料的內(nèi)源酶從植物材料中提取異黃酮苷元的過程中，加入適當量的外源性糖苷水解酶，以增加具有更強和更廣泛生物學活性的異黃酮苷元的產(chǎn)率。
如前所述，用于這一轉化的β-1，4-糖苷鍵水解酶包括但不只限于β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶和β-木聚糖酶等。然而，這些主要通過微生物(特別是某些真菌和細菌)發(fā)酵生產(chǎn)并純化的糖苷水解酶的價格都很貴，致使異黃酮苷元的生產(chǎn)成本提高，從而不利于其作為藥品和食品或飲料添加劑的廣泛使用。因此，本領域亟待提供一種來源廣泛、制備方便且成本低廉的用于上述轉化的β-1，4-糖苷鍵水解酶制劑。本發(fā)明人在使用豆科植物材料提取異黃酮苷元的實踐中發(fā)現(xiàn)，由某些植物材料例如苦杏仁中提取的酶組合物即是用于這一目的極好酶制劑。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種利用外源性水解酶由豆科植物材料來源的異黃酮葡糖苷制備異黃酮苷元的方法，特征在于其中所說的水解酶是植物特別是苦杏仁來源的包括苦杏仁苷酶和櫻葉酶的混合酶。
根據(jù)本發(fā)明，本領域技術人員可以選擇使用如前所述的任何一種已知的方法從植物材料中分離得到異黃酮糖苷或包括糖苷和苷元兩種形式的異黃酮提取物。然后，可在上述提取物中加入適當量植物來源的葡糖苷水解酶組合物，以接近100％的轉化率將異黃酮糖苷轉化成其苷元形式。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，其中用于提取異黃酮的豆科植物可以是大豆和黑豆。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所說的植物材料可以是豆科植物如大豆或黑豆的成熟種子、脫脂大豆粕、發(fā)芽大豆或黑豆種子或其胚芽(下胚軸部分)。
為了從苦杏仁中提取所需的酶組合物，可以首先使用乙醚處理干燥并粉碎的新鮮苦杏仁，以除去其中的油脂。然后用有機溶劑與水的混合物(例如氯仿的飽和水溶液)充分提取約8-32小時。過濾除去不溶物后用酸(例如冰醋酸)沉淀蛋白質。然后再次過濾，收集濾液并用體積過量的乙醇(90％以上)提取。收集提取物并反復用乙醇洗滌后，干燥即得到所需的酶組合物。如此得到的主要包括苦杏仁苷酶和桃葉酶的混合酶制劑，不需進一步純化即可直接用于上述由異黃酮糖苷變?yōu)楫慄S酮苷元的酶促轉化。
一般說來，按所述方法由植物材料中制備的苦杏仁酶制劑的回收率約為3-4％?？梢允褂每嘈尤受?100mg)作為底物，按照本領域已知的標準方法檢測如此得到的苦杏仁酶的糖苷水解活性。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，當用于將異黃酮糖苷轉化成異黃酮苷元時，酶促反應系統(tǒng)中所加酶制劑重量比約占底物(葡糖苷)干重的0.1-10％，并且最好約占5-8％(W/W)。我們的實驗結果證實，在pH大約為5-7和溫度大約為30-60℃的條件下，酶解反應4-8小時后，異黃酮糖苷變?yōu)楫慄S酮苷元的酶促轉化率不小于90％。因此可見，在異黃酮苷元的工業(yè)化生產(chǎn)中，使用從天然植物材料特別是苦杏仁來源的β-1，4-糖苷鍵水解酶完成由異黃酮糖苷變?yōu)楫慄S酮苷元的酶促轉化，不僅大大降低了生產(chǎn)成本，而且還可保有極好的轉化效率。
為了本發(fā)明的目的，通?？梢允褂孟率龇椒ㄓ纱蠖共牧现刑崛〔⒒厥罩饕受赵问降拇蠖巩慄S酮首先向大豆粉中加入3-4倍體積的水并將其pH調到約5-5.5。25-45℃下浸漬6-12小時后，加入相當于原料重量0.1％的如上制備的苦杏仁酶，并于30-60℃下酶解4-8小時。離心收集殘渣并依次用60％和80％的5-8倍過量乙醇各回流提取一次。合并濾液并放置過夜后減壓回收乙醇。用HCL將溶液的pH調到蛋白質等電點(6.7-9.7)并在升高的溫度(約75-85℃)下加熱處理1-2小時。離心收集上清并用水將其稀釋到原體積的10倍后，使用常規(guī)超濾裝置(截留分子量100,000)超濾。然后，收集濾液并過聚酰胺柱。使用乙醇梯度洗脫并在20-50％乙醇濃度段得到純度約80％并且有高染料木素含量的異黃酮苷元產(chǎn)物。
作為另一種可供選擇的簡化方法，也可以將植物材料、水、β-1，4-糖苷鍵水解酶或其組合物，以及有機溶劑合并在一起，形成分離相混合物包括其中含有酶和植物材料水相中，和分配有酶解后產(chǎn)生的異黃酮苷元的有機相。發(fā)生相分離后，即可從有機溶劑中分離得到所需的異黃酮苷元。
該一步提取方法中，用于裂解異黃酮糖苷使之轉化為苷元的酶是上述苦杏仁來源的混合酶制劑。所說的混合酶制劑的優(yōu)勢活性在于裂解異黃酮和其糖部分之間的葡糖苷鍵。在適當?shù)姆磻獥l件(30-60℃和pH5-7)下，酶制劑的相對活性(百分轉化率)不小于80％。特別是，在上述形成多試劑組合的方法中，所使用的含水有機溶劑(例如60％乙醇)并不能導致同時加入的酶制劑的失活。
所使用的植物材料是從豆科植物得到的，其中優(yōu)選的是有較高異黃酮含量的大豆、紅花草、黑豆、鷹嘴豆、兵豆和蠶豆。其中特別優(yōu)選的是粉碎成微細顆粒的大豆和黑豆。在某些情況下，為了獲得更多的內(nèi)源性糖苷水解酶和更高的異黃酮產(chǎn)量，也可使用脫皮加工中破出的有較高異黃酮和內(nèi)源性糖苷水解酶含量的大豆胚芽或發(fā)芽大豆。
異黃酮提取方法中所使用的溶劑包括具有1至6個碳原子的醇(如乙醇、丙醇和丁醇)、酯酸(如乙酸乙酯、磷酸二甲酯)、酮(如丙酮、乙基甲基酮)、醛和醚等。最好選擇毒性相對較小并且容易揮發(fā)除去的有機溶劑。用于本方法的水可以是蒸餾水、雙蒸水或去離子水。對混合提出液中水與有機溶劑的比例并沒有嚴格限制，但通常使用大約等體積水和有機溶液的混合物。
值得特別提到的是，由于可以在單一的反應步驟中完成酶促消化和溶劑提取兩個基本過程，所以該方法可以在不影響異黃酮產(chǎn)率的前提下大大降低生產(chǎn)成本。
可以使用減壓蒸發(fā)或蒸餾的方法除去有機溶劑，以從殘留物中回收異黃酮化合物。當除去有機相后，余留物中可能還會有小量富含異黃酮苷元的油。為此，必要時可以使用易溶解油但較難溶解異黃酮苷元的己烷或庚烷等溶劑除去這些油。另外，在酶消化異黃酮糖苷后，還有必要即時地除去殘留的豆科植物材料。
可以將如上制備的苷元形式的異黃銅與適當?shù)妮d體或賦形劑配合，制成適于口服的藥物組合物或食品、飲料等其他保健組合物。例如，可以按照制藥工業(yè)中已知的方法將含有異黃酮的藥物組合物制成片劑、膠囊劑、丸劑、粉末劑、栓劑以及溶液劑和懸浮劑。其中優(yōu)選的是適于經(jīng)胃腸道給藥的膠囊劑和片劑。在制備適于口服給藥的膠囊劑、片劑、丸劑和粉末劑時，可以使用蔗糖、乳糖、半乳糖、玉米淀粉、明膠、微晶纖維素、羧甲基纖維素等作為載體或賦形劑。另外，也可以使用制藥工業(yè)中已知的方法和輔助成分將所說的藥物組合物制成適于口服給藥的溶液劑和懸浮劑。為了制備適于胃腸道外途徑給藥的溶液劑或懸浮劑，可以使用蒸餾水、注射用水、等滲氯化鈉溶液或葡萄糖溶液，或者低濃度(例如1-100mM)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)作為載體或稀釋劑。必要時，可以在這些胃腸道外給藥的制劑中加入一種或多種其他輔助成分或添加劑，例如可使用抗壞血酸作為抗氧化劑，使用苯甲酸鈉等作為防腐劑。在這些劑型的制劑中，還可以含有其他適當?shù)脑鋈軇?、崩解劑、潤滑劑、著色劑、分散劑或表面活性劑?br> 下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發(fā)明。在不違背本發(fā)明的精神和原則的前提下，對發(fā)明個別技術步驟進行的任何改動和改變都將落入本發(fā)明待批權利要求范圍內(nèi)。
實施例實施例1苦杏仁酶的制備將生苦杏仁約50g放在沸水中浸泡2分鐘后，除去外皮并涼干。然后在乳缽中將其研成粉末并用乙醚提取以除去其中的油脂。進一步粉碎殘渣并加入氯仿飽和的蒸餾水約100ml，在乳缽中研和均勻后室溫放置24小時。過濾收集濾液并向其中加入冰醋酸10滴，以沉淀其中的蛋白質。然后再次過濾，收集澄清的濾液并在攪拌下加入2倍體積的95％乙醇。放置1小時后，棄去上層清液并真空過濾余留部分，用95％乙醇反復洗滌沉淀物后，真空干燥即得到約1.671g所需的酶制劑。
實施例2從大豆粉中提取并制備異黃酮苷元(1)取大豆粉1kg，向其中加入約4000ml水并將使用1N鹽酸將其pH調到5.5。30℃下浸漬8小時后，加入相當于原料重量1％的如上制備的苦杏仁酶(10g)，并于40℃下酶解6小時。離心收集殘渣并依次用5倍過量的60和80％乙醇各回流提取一次。合并濾液并冷沉過夜后取上清減壓回收乙醇，直到?jīng)]有乙醇味為止。然后在升高的溫度(約80℃)下加熱處理1小時。離心收集上清并用水將溶液稀釋到原體積的10倍后，使用PLHK型超濾儀(截留分子量100,000)超濾。然后，收集濾液并過聚酰胺樹脂(常州永慶化工廠)柱。依次用水、20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和95％乙醇梯度洗脫，并在20-50％乙醇濃度段收集得到異黃酮苷元產(chǎn)物。
聚酰胺薄層層析(展開劑苯/丁酮/甲醇＝3∶1∶1)分析結果表明，如上制備的產(chǎn)物以染料木素和大豆苷元。經(jīng)HPLC分析，產(chǎn)物中總異黃酮游離配基的含量約占88％(W/W)。
實施例3從脫脂豆粕粉中提取并制備異黃酮苷元(2)將50kg脫脂大豆粉放在含有50L去離子水和100g按實施例1所述方法制備的苦杏仁酶的不銹鋼容器內(nèi)。然后在水懸浮液的上面輕輕加入10L乙酸乙酯以得到兩相組合物。然后使用垂直螺漿式混合器持續(xù)攪拌以混合水相和有機相。此時，在水相和有機溶劑相接觸部分即有異黃酮苷元逐漸由水相移入有機溶劑相。其中持續(xù)攪拌水相可使水解的異黃酮盡可能地接觸到乙酸乙酯，而持續(xù)攪拌有機溶劑相則有助于在兩相間形成高的異黃酮濃度梯度，從而加快非水溶性異黃酮苷元在乙酸乙酯中的溶解速率。
大約20小時后，停止攪拌并使兩相分離。蒸發(fā)除去乙酸乙酯后，向未被蒸發(fā)的油(約200ml)中加入約2L己烷并攪拌混合約5分鐘。然后靜置過夜，以使含異黃酮苷元的顆粒材料下沉止容器底部。棄去己烷:油相后，向下層懸液(淤漿)中加入約50ml己烷以除去殘留的油。再次靜置該混合物以進一步沉淀顆粒材料，棄去己烷:油相，收集并干燥余留的半固體淤漿，即得到提取物。
高壓液相層析(HPLC)分析表明，所得材料中含有約60％(W/W)以上苷元形式的異黃酮，并且其中染料木黃酮、大豆苷元和大豆黃素的回收率均在80％以上。
權利要求
1，利用外源性糖苷鍵水解酶從豆科植物材料來源的異黃酮葡糖苷制備異黃酮苷元的方法，特征在于其中所說的糖苷鍵水解酶是植物來源的混合酶。
2，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的豆科植物材料選自豆科植物種子、發(fā)芽種子、胚芽或脫脂大豆粕。
3，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的豆科植物選自大豆和黑豆。
4，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的混合酶是具有β-1，4-糖苷鍵水解活性的苦杏仁苷酶和櫻葉酶的混合物。
5，根據(jù)權利要求1的方法，其中所說的混合酶的加入量約占底物重量的0.1-10％。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)異黃酮的方法，特別是涉及從豆科植物中提取異黃酮葡糖苷并使用植物來源的糖苷水解酶由異黃酮葡糖苷轉化生產(chǎn)異黃酮甙元的方法。
文檔編號C12P17/06GK1566352SQ03112420
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月12日 優(yōu)先權日2003年6月12日
發(fā)明者吳炳新, 孫筱林, 牛繼江, 褚新紅, 陳光芝 申請人:濟南三株藥業(yè)有限公司