專利名稱：可高產復合酶的硫色曲霉及其誘變篩育方法和固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，特別涉及可高產復合酶的硫色曲霉及其誘變篩育方法和固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶的應用。
背景技術：
近幾十年來，由于人口的迅速增加和生活水平的不斷提高，對肉禽蛋的需求量也在逐年提高。飼料是畜禽的食物，如何提高飼料的利用率和動物的生長性能、如何保護環(huán)境、保障飼料工業(yè)和農牧業(yè)的持續(xù)、健康、穩(wěn)定發(fā)展已成為人類迫切需要解決的重要問題。
由微生物發(fā)酵生產的飼用復合酶是一類無毒、無害、無污染殘留的綠色飼料添加劑，在飼料中添加適量的與飼料日糧相匹配的酶制劑能明顯提高飼料利用率，減少對環(huán)境的污染。
微生物發(fā)酵生產酶制劑的關鍵技術主要由二條一是如何誘變篩選獲得高產酶的菌種；另一條是如何選擇合適的培養(yǎng)條件使菌種發(fā)揮最佳的生產性能。
本發(fā)明以選育飼用復合酶高產菌種為突破口，采用符合我國國情的固態(tài)發(fā)酵法進行規(guī)?；a；不僅提高經濟效益，同時也保護生態(tài)環(huán)境，推動我國畜牧業(yè)持續(xù)、健康、穩(wěn)定地發(fā)展。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是選育一種能高產木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶等復合酶的硫色曲霉；本發(fā)明的另一目的是提供一種誘變篩育可高產復合酶的硫色曲霉的方法；本發(fā)明的再一目的是將該可高產復合酶的硫色曲霉用于固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶中的應用。
本發(fā)明的技術方案如下本發(fā)明提供的可高產復合酶的硫色曲霉，其特征在于，該可高產復合酶的硫色曲霉為一種能高產木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶的曲霉菌，孢子呈灰紅色，其分類命名為硫色曲霉 Aspergillus sulphureus，于2001年8月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC No.0608。
本發(fā)明提供的可高產復合酶的硫色曲霉的誘變篩育方法，其特征在于，誘變選育過程為
1.出發(fā)菌種的篩選將從遼寧省錦州市太和郊區(qū)的大豆耕地中所取土樣制成濃度為10-5的菌懸液，接種在121℃下高壓滅菌15-20分鐘的固體馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，28-32℃下，恒溫培養(yǎng)2天，分離獲得1株曲霉菌；所述固體馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配比為去皮馬鈴薯100-130克、干酪素4-6克、小麥粉15-24克、瓊脂16-20克、蒸餾水1000ml、青霉素3-6ppm，pH6.8-7.0；2.以得到的該株曲霉菌為出發(fā)菌株進行下述步驟的誘變篩育(1)將得到的該株曲霉菌用無菌生理鹽水制備成孢子菌懸液，其孢子數(shù)在106-107個/ml之間，液層的厚度為0.3-0.5cm，進行二次紫外誘變，紫外誘變所用紫外燈功率為15W，照射距離為20cm；第一次紫外誘變的紫外照射時間為5分鐘，第二次紫外誘變的紫外照射時間為10分鐘，照射后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選30-50個單菌落，用于下一步γ射線誘變；(2)進行γ射線誘變γ射線來源于Co60，待處理菌懸液的孢子數(shù)在105-106個/ml，照射劑量為600-800居里；誘變后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選30-50個單菌落，用于下一步NTG藥物誘變劑處理孢子；(3)NTG藥物誘變劑處理孢子NTG藥物誘變劑的濃度為150-200ppm，待處理菌懸液的孢子數(shù)在105-106個/ml，作用時間為20-30分鐘，作用溫度為30-40℃；誘變后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選3040個單菌落；將挑選的該30-50個單菌落，分別做搖瓶試驗，并測定其酶活力，選擇2-3株產酶最高的菌株；再分別對其做搖瓶試驗，并測定其酶活力，選擇1株產酶最高的菌株；3.將步驟2中的步驟(3)得到的1株產酶最高的菌株作為出發(fā)菌株，3-5次循環(huán)重復進行與上述步驟3的(1)-(3)相同的誘變選育過程，最后得到一株本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉菌，該菌保存在固體斜面培養(yǎng)基上，該固體斜面培養(yǎng)基的配方為NaNO30.2-0.4％、KCl0.03-0.06％、KH2PO40.08-0.12％、FeSO40.001-0.002％、MgSO40.03-0.06％、蔗糖2.0-3.5％、瓊脂1.8-2.0％、pH值6.6-6.8，培養(yǎng)溫度28-30℃，培養(yǎng)時間5-6天；孢子呈灰紅色，斜面菌種在4℃條件下保藏，6個月轉接一次。
本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉，其分類命名為硫色曲霉Aspergillussulphureus；于2001年8月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCCNo.0608。
經測定分析，本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉(Mafic-001)固態(tài)發(fā)酵能同時產生酸性蛋白酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶，而且三種酶的活力都很高。
本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉應用于固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉為一種可產酸性蛋白酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶復合酶的高產酶，可用于固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶，配制畜禽飼料，能明顯提高飼料的利用率，增強畜禽抗病能力，降低養(yǎng)殖物的污染物排放，具有較好的經濟效益和積極的環(huán)保意義。
實施例2，用本發(fā)明提供的可高產復合酶的硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶的中試(日產200kg成曲)培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)溫度同上；發(fā)酵方式采用托盤式，托盤為0.45×0.30m2的長方形曲盤；料厚為0.015m；起始含水量為58％，成曲含水量為43％；在中試發(fā)酵室內，溫度和濕度的控制較三角瓶培養(yǎng)困難，水分的揮發(fā)比三角瓶料曲高，所以托盤中料曲的起始含水量較高。
中試生產過程的有關參數(shù)及注意事項中試生產采用托盤式發(fā)酵法，托盤為木框結構30×45cm，底部用金屬絲網；在110℃蒸料保溫60分鐘，然后冷卻，降溫至35℃時接入種曲；料曲的起始含水量為55-65％，過高會導致料層通風透氣困難，過低則會導致菌體過早衰老，從而影響產酶量；接種量在0.5-1.0％之間，充分翻拌，使種曲均勻地混合在大料中，大料接種后裝入托盤，平鋪均勻，曲料的厚度控制在1.5-2cm，曲房內托盤之間的高度間隔為15cm；發(fā)酵過程采用全進全出式。大曲接種后，保持曲房溫度在30℃左右，經過10-12小時以后，料曲開始升溫(即品溫上升)，表明菌體開始大量增殖，18-20小時后達到高峰，此時需要注意降溫，同時又要注意保持曲房內空氣有較高的相對濕度(一般控制在90％以上)，因為如果濕度降低，料曲的水分含量就要下降，菌體生長下降，甚至停止，從而導致酶活下降。最終成熟料曲的水分含量在30-40％之間；發(fā)酵進行到30小時以后，菌體的生長速度逐漸下降，發(fā)酵產熱也降低，菌體開始產生孢子，酶活開始急劇增加；發(fā)酵到48小時以后，酶活的增長速度逐漸下降，72小時以后酶活增加很少；曲房出料以后需要及時清洗，然后進行殺菌消毒，以確保下一批料正常發(fā)酵，不受污染；出曲后及時清洗托盤、在消毒液中浸泡24小時，然后曬干或在紫外燈下晾干。
實施例3，用本發(fā)明提供的可高產復合酶的硫色曲霉菌固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶的規(guī)模化(日產2噸成曲)生產培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)溫度同上，接種量為0.2-0.5％(重量比)，發(fā)酵方式采用托盤式，托盤為0.65×0.45m2的長方形曲盤；料厚為0.025m；起始含水量為56％，成曲含水量為45％由于料層加厚，發(fā)酵過程中曲溫的控制有一定的困難，需要及時通風散熱。但是通風容易導致水分散失，酶活下降。所以在生產過程中如何控制溫度，同時保持較高的相對濕度是獲得理想生產成績的關鍵之一。
上述三種固態(tài)發(fā)酵生產飼用復合酶的結果見表2；表2實驗室 中試規(guī)?；a酸性蛋白酶(u/g) 13000 11000 10000木聚糖酶(u/g)90000 82000 73000β-葡聚糖酶(u/g) 56000 48000 43000上述實施例制得的可高產復合酶的硫色曲霉菌，可用來固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶，配制畜禽飼料，能明顯提高飼料的利用率，增強畜禽抗病能力，降低養(yǎng)殖物的污染物排放，具有較好的經濟效益和積極的環(huán)保意義。
下面介紹酶活力的測定方法(一)β—葡聚糖酶的測定方法1.酶活定義β—葡聚糖酶酶活在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘內水解β-葡聚糖生成1μg葡萄糖所需要的酶量為1個酶活單位，以u表示。
2.試劑0.5％(w/w)β—葡聚糖底物稱取0.5克β—葡聚糖(Sigma公司)，用10ml乙醇濕潤。加入80ml蒸餾水，加熱、煮沸。繼續(xù)攪拌、加熱煮沸，直到β—葡聚糖溶解，獲得混濁液。冷卻混濁液到室溫。繼續(xù)攪拌，用蒸餾水定容至100ml。用玻璃纖維紙過濾。底物能立即使用。在冰箱中儲存，有效期為2天。
0.1M醋酸鈉緩沖液，pH5.0A液；用蒸餾水溶解8.2克無水醋酸鈉，定容至1000ml。
B液用蒸餾水溶解6.0克冰醋酸，定容至1000ml。
用A液調節(jié)B液至pH5.0DNS試劑用800ml蒸餾水溶解20.0克3，5——二硝基水楊酸，逐步加入300mlNaOH溶液(含32.0克NaOH)，同時不斷攪拌。水浴(溫度不超過48℃)，同時不斷攪拌，直到溶液透明清澈。再逐步加入600克酒石酸鉀鈉，水浴(溫度不超過48℃)，直到溶液清澈透明。用蒸餾水定容至2000ml，用燒結陶瓷玻璃過濾器過濾。室溫下存儲在棕色瓶中，有效期6個月。
3.標準曲線配制濃度為10mg/ml的標準溶液稱取1克無水葡萄糖，用pH5.0的緩沖溶液定容至100ml。標準葡萄糖溶液的濃度范圍在0.1-0.6mg/ml之間。
吸取1ml葡萄糖標準溶液、1ml緩沖液和3mlDNS溶液，加入到試管中，震蕩，精確煮沸5分鐘。然后在冷水中冷卻到室溫，在540nm時測定吸光度?？瞻讟邮且?ml緩沖液代替1ml葡萄糖溶液，每個數(shù)據(jù)做2個重復，取平均值。繪制葡萄糖濃度與吸光度的關系曲線。對每一次新配制的DNS試劑，都要重新繪制標準曲線。
4.測定步驟酶樣的制備在40℃用0.1MpH5.0的醋酸鈉緩沖液溶解酶樣，溶解稀釋到適當濃度。吸取1ml酶液，加入1mlβ—葡聚糖溶液。震蕩，在40℃精確保溫10分鐘。加入3mlDNS試劑，攪拌煮沸5分鐘。用冷水冷卻至室溫，以蒸餾水為對照在540nm處測定吸光度。
酶的空白對照吸取1mlβ—葡聚糖底物，在40℃精確保溫10分鐘。加入3mlDNS試劑和1ml酶液。攪拌煮沸，在試管中加入1mlβ—葡聚糖底物、3mlDNS試劑，加熱煮沸3分鐘。加入1ml經過適當稀釋的酶液(pH值5.0)，繼續(xù)煮沸2-3分鐘。冷卻至室溫，以蒸餾水為對照，在540nm處測定吸光度ODB值。為提高測量精度，ODE值和ODB值的差值應控制在0.3-0.7之間。
5.酶活計算A=[(ODE-ODB)×K+Co]×Dft×1000(u/g)]]>A樣品酶活，K標準曲線的斜率，Co標準曲線的截距，Df樣品酶的稀釋倍數(shù)，t反應時間(min)，ODE樣品的吸光度，ODB空白樣的吸光度。
(二)木聚糖酶活力的測定1.酶活定義木聚糖酶酶活在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘內水解木聚糖生成1μg木糖所需要的酶量為1個酶活單位，以u表示。
2.試劑0.1M醋酸——醋酸鈉緩沖液，pH5.0A液用蒸餾水溶解8g無水醋酸鈉，并定容至1000ml。
B液用蒸餾水溶解6.2g冰醋酸，并定容至1000ml。
用B液調節(jié)A液的pH值至5.0。
0.5％(w/w)木聚糖底物溶液用10ml濃度為0.5M的NaOH溶液溶解0.5g木聚糖(Sigma公司)，磁力攪拌30分鐘，再加入40ml醋酸——醋酸鈉緩沖液。用1M的醋酸溶液調節(jié)pH值至5.0，用醋酸——醋酸鈉緩沖液定容至100ml。
使用前適當搖勻。如果儲存在冷藏室，有效期為2天。
DNS試劑在800ml蒸餾水中溶解20.0g3，5——二硝基水楊酸，緩慢加入300mlNaOH溶液(內含NaOH32.0g)。加入時不斷攪拌，溫水浴(溫度不超過48℃)，直到溶液清澈。此時再緩慢加入300g酒石酸鉀鈉、5g重蒸酚和5g無水亞硫酸鈉，溫水浴(溫度不超過48℃)，并不斷攪拌，直到溶液清澈。加蒸餾水定容至2000ml，用燒結玻璃過濾器過濾，清液存儲在棕色瓶中，有效期6個月。
3.標準曲線稱取1g無水木糖，用pH5.0濃度為0.05M的醋酸鈉緩沖液溶解定容到100ml，制成濃度為10mg/ml的木糖儲備液。
適當稀釋10mg/ml的木糖儲備液，配制成濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6(單位mg/m1)的木糖溶液。分別在不同試管中各移取2ml上述6種不同濃度的木糖溶液，再分別添加DNS試劑5ml，沸水浴5分鐘，然后水浴中冷卻至室溫，加入2ml濃度為1.0％的木聚糖底物溶液，定容至25ml，在540nm處測定吸光度OD值。在空白樣中用2ml醋酸——醋酸鈉緩沖液替代2ml木糖溶液。以吸光度OD值為橫軸，木糖濃度為縱軸，繪制標準曲線。每次更換DNS試劑，標準曲線也需要重新繪制。
4.樣品酶活的測定酶與底物反應液的吸光度ODE值吸取2ml經過適當稀釋的酶液(用醋酸——醋酸鈉緩沖液平衡pH值至5.0)，40℃水浴5分鐘。加入2ml木聚糖底物溶液(事先已經過40℃水浴)，充分混合。在40℃精確保溫30分鐘。加入5mlDNS試劑，沸水浴5分鐘，然后冷卻至室溫，定容至25ml。以蒸餾水為對照，在540nm處測定反應液的吸光度ODE值。
空白值的吸光度ODB值在試管中加入2ml木聚糖底物、5mlDNS試劑，沸水浴3分鐘。加入2ml經過適當稀釋的酶液(pH值5.0)，繼續(xù)沸水浴2-3分鐘，冷卻至室溫，定容至25ml。以蒸餾水為對照，在540nm處測定吸光度ODB值。為提高測量精度，ODE值和ODB值的差值應控制在0.3-0.7之間。
5.酶活計算A=[(ODE-ODB)×K+Co]×Dft×1000(u/g)]]>A樣品酶活，K標準曲線的斜率，Co標準曲線的截距，Df樣品酶的稀釋倍數(shù)，t反應時間(min)。(三)酸性蛋白酶活力的測定1.酶活定義酸性蛋白酶酶活在40℃、pH3.0的條件下，每分鐘內水解酪蛋白溶液，產生1μg酪氨酸所需要的酶量為1個酶活單位，以u表示。
2.試劑福林試劑在2000ml磨口回流裝置內加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(NaMoO4·2H2O)25g，水700ml，85％的磷酸50ml，濃鹽酸100ml，文火回流10小時。加入硫酸鋰(Li2SO4)150g，蒸餾水50ml?；靹?，取去冷凝器，加入幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅逐殘溴及除去顏色，溶液應呈黃色。若溶液有綠色，需再加數(shù)滴液溴，再蒸沸除去。冷卻后定容至1000ml。過濾，置于棕色瓶中，使用時再加1倍蒸餾水稀釋。
0.4M的TCA溶液稱取65.4g三氯乙酸，加蒸餾水定容至1000ml0.8M的碳酸鈉溶液稱取無水碳酸鈉84.8g，加蒸餾水溶解，定容至1000mlpH3.0的醋酸緩沖液稱取10gNaAc·3H2O，加水800ml，溶解。再加入濃度為6M的醋酸溶液，調節(jié)pH至3.0，用蒸餾水稀釋定容至1000ml。
0.2％的酪蛋白溶液稱取酪蛋白(Merck公司)0.2g，置于燒杯中，用少量蒸餾水濕潤。然后加入50mlpH3.0的醋酸緩沖液。60℃磁力攪拌，溶解成透明狀液體。冷卻后再用醋酸緩沖液定容至100ml。
100μg/ml酪氨酸溶液精確稱取100mg酪氨酸，用醋酸緩沖液定容至1000ml。
3.繪制標準曲線分別吸取0、2、5、10、20、35、50ml濃度為100μg/ml的酪氨酸溶液，用醋酸緩沖液定容至100ml。獲得濃度分別為0、2、5、10、20、35、50μg/ml的酪氨酸溶液。
分別吸取上述酪氨酸溶液各2ml，再加入已經稀釋的福林試劑2ml和0.8M的碳酸鈉溶液10ml?；靹颍?0℃保溫20分鐘，然后在660nm處進行比色測定。以酪氨酸濃度為Y軸，以吸光度為X軸，繪制標準曲線。
4.樣品酶活的測定稱取酶粉2g，充分碾細，加蒸餾水100ml。磁力攪拌30分鐘，使酶蛋白充分溶出。過濾，濾液用醋酸緩沖液稀釋到適當倍數(shù)。
取濾液1ml，40℃水浴預熱2min，再加入經過同樣預熱的酪蛋白1ml。精確保溫10min。然后立即加入2mlTCA溶液以終止反應。繼續(xù)置水浴中保溫20min，使殘余蛋白質沉淀。然后離心分離或過濾，取濾液2ml，再加已經稀釋的福林試劑2ml和0.8M的碳酸鈉溶液10ml。混勻，在40℃保溫20分鐘，然后在660nm處進行比色測定。
5.酶活計算蛋白酶活力＝A×4×N/10A對照標準曲線得出的酪氨酸，44ml反應液取出1ml，N酶粉的稀釋倍數(shù)，10反應時間10min。
權利要求
1.一種可高產復合酶的硫色曲霉，其特征在于，其分類命名為硫色曲霉Aspergillus sulphureus，于2001年8月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏號為CGMCC No.0608。
2.按權利要求1所述的可高產復合酶的硫色曲霉，其特征在于，該可高產復合酶的硫色曲霉菌為一種能高產木聚糖酶、β-葡聚糖酶和酸性蛋白酶的曲霉，孢子呈灰紅色。
3.權利要求1所述可高產復合酶的硫色曲霉的誘變篩育方法，其特征在于，誘變選育過程為1)出發(fā)菌種的篩選將從遼寧省錦州市太和郊區(qū)的大豆耕地中所取土樣制成濃度為10-5的菌懸液，接種在121℃下高壓滅菌15-20分鐘的固體馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上，28-32℃下，恒溫培養(yǎng)2天，分離獲得1株曲霉菌；所述固體馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基配比為去皮馬鈴薯100-130克、干酪素4-6克、小麥粉15-24克、瓊脂16-20克、蒸餾水1000ml、青霉素3-6ppm，pH6.8-7.0；2)以得到的該株曲霉菌為出發(fā)菌株進行下述步驟的誘變篩育(1)將得到的該株曲霉菌用無菌生理鹽水制備的孢子菌懸液，其孢子數(shù)在106-107個/ml之間，液層的厚度為0.3-0.5cm，進行二次紫外誘變，紫外誘變所用紫外燈功率為15W，照射距離為20cm；第一次紫外誘變的紫外照射時間為5分鐘，第二次紫外誘變的紫外照射時間為10分鐘，照射后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選30-50個單菌落，用于下一步γ射線誘變；(2)進行γ射線誘變γ射線來源于Co60，待處理菌懸液的孢子數(shù)在105-106個/ml，照射劑量為600-800居里；誘變后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選30-50個單菌落，用于下一步的NTG藥物誘變劑處理孢子；(3)NTG藥物誘變劑處理孢子NTG藥物誘變劑的濃度為150-200ppm，待處理菌懸液的孢子數(shù)在105-106個/ml，作用時間為20-30分鐘，作用溫度為30-40℃；誘變后立即稀釋涂布在馬鈴薯固體瓊脂培養(yǎng)基上，在28-32℃恒溫培養(yǎng)2天，挑選30-50個單菌落；將挑選的該30-50個單菌落，分別做搖瓶試驗，并測定其酶活力，選擇2-3株產酶最高的菌株；再分別對其做搖瓶試驗，并測定其酶活力，選擇1株產酶最高的菌株；3)將步驟2)中的步驟(3)得到的1株產酶最高的菌株作為出發(fā)菌株，3-5次循環(huán)重復進行與上述步驟2)中的(1)-(3)相同的誘變篩育過程，最后得到一株本發(fā)明的可高產復合酶的硫色曲霉。
4.權利要求1所述的可高產復合酶的硫色曲霉應用于固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及的可高產復合酶的硫色曲霉菌為一種可高產復合酶的硫色曲霉菌,孢子呈灰紅色,其分類命名為硫色曲霉菌Aspergillus sulphureus,于2001年8月20日保藏于“中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”,其保藏號為CGMCC No.0608;是以遼寧省錦州市太和郊區(qū)的大豆耕地土樣中篩選分離獲得的1株曲霉菌為出發(fā)菌株,進行多次誘變選育得到的,可高產木聚糖酶、β—葡聚糖酶和酸性蛋白酶;可用于固態(tài)發(fā)酵制備飼用復合酶,配制畜禽飼料,能明顯提高飼料的利用率,增強畜禽抗病能力,降低養(yǎng)殖物的污染物排放,具有較好的經濟效益和積極的環(huán)保意義。
文檔編號C12Q1/04GK1338511SQ01141789
公開日2002年3月6日 申請日期2001年9月19日 優(yōu)先權日2001年9月19日
發(fā)明者李德發(fā), 范石軍, 陸文清, 邢建軍, 涂真 申請人:李德發(fā), 范石軍, 陸文清, 邢建軍, 涂真