專利名稱：：新型蛋白酶、生產(chǎn)該蛋白酶的微生物及其利用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及發(fā)揮優(yōu)異的血栓溶解作用的新型蛋白酶，生產(chǎn)該蛋白酶的蛋白酶生產(chǎn)菌，以及該蛋白酶的制造方法。進(jìn)而，本發(fā)明涉及含有上述蛋白酶的血栓溶解劑或食品，以及利用上述蛋白酶生產(chǎn)菌來制造的發(fā)酵食品。
背景技術(shù)：
：蛋白酶是將蛋白質(zhì)或肽中的肽鍵水解的一類酶，以前開發(fā)出來源于微生物或動植物的各種蛋白酶，在醫(yī)藥品或食品領(lǐng)域中被利用。例如，報(bào)告有根霉或根霉菌中含有的蛋白酶具有血栓溶解作用，作為血栓溶解劑是有用的(參照專利文獻(xiàn)l)。然而，對于醫(yī)藥品或食品領(lǐng)域中利用的蛋白酶來說，以往幾乎不知道從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定的物質(zhì)。在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定的蛋白酶，在食品或醫(yī)藥品等中的應(yīng)用是有用的。其中，在寬pH范圍內(nèi)穩(wěn)定且具有血栓溶解作用的的蛋白酶，作為用于治療或預(yù)防血栓癥的醫(yī)藥品或食品的有用性高，而盼望其的開發(fā)。專利文獻(xiàn)l:特開平3-277279號公報(bào)
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的在于提供從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的、具有優(yōu)異的血栓溶解作用的蛋白酶，生產(chǎn)該蛋白酶的蛋白酶生產(chǎn)菌，以及該蛋白酶的制造方法。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供含有上述蛋白酶的血栓溶解劑或食品，以及利用上述蛋白酶生產(chǎn)菌來制造的發(fā)酵食品。本發(fā)明人等為了解決上述課題，進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從使用木槿屬植物的葉制成的根霉中分離出的屬于鐮刀菌屬的絲狀菌(鐮刀菌sp.BLB林FERMBP-10493),可生產(chǎn)從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的、具有優(yōu)異的血栓溶解作用的新型蛋白酶。還發(fā)現(xiàn)上述蛋白酶能夠作為食品或醫(yī)藥品的原料使用。進(jìn)而，該微生物可以食用，利用該微生物使豆類或谷類發(fā)酵而得的發(fā)酵食品含有上述蛋白酶，作為治療或預(yù)防血栓癥用的食品或其他健康食品是有用的。本發(fā)明是基于這些認(rèn)識，通過進(jìn)一步反復(fù)改良而完成的。即，本發(fā)明涉及以下所述的蛋白酶、蛋白酶生產(chǎn)菌、蛋白酶的制造方法、血栓溶解劑、食品及發(fā)酵食品。第1項(xiàng).具有下述性質(zhì)的蛋白酶(1)作用/基質(zhì)特異性具有對纖維蛋白的分解活性，此外，具有對作為合成基質(zhì)的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及Bz-L-Arg-pNA的分解活性；(2)作用pH及最佳pH:至少在pH6.511.5下發(fā)揮作用，最佳pH為約8.5~9.5;(3)pH穩(wěn)定性在4X:、20小時(shí)的處理?xiàng)l件下，至少在pH2.5-11.5的范圍是穩(wěn)定的；(4)作用溫度及最佳溫度至少在3050"C發(fā)揮作用，最佳溫度為約45~50"C;(5)溫度穩(wěn)定性在pH5、10分鐘的處理?xiàng)l件下，至少到約55"C為止是穩(wěn)定的；(6)分子量利用SDS-PAGE進(jìn)行的推定分子量為約27000;(7)抑制特性不被0.01mg/ml的SBTI抑制，而被lmM的PMSF和O.lmM的DFP抑制。第2項(xiàng).如第l項(xiàng)所述的蛋白酶,其來源自屬于鐮刀菌屬的微生物。第3項(xiàng).以下(a)、(b)或(c)的任意一種蛋白質(zhì)(a)—種蛋白質(zhì)，其由序列號l表示的氨基酸序列構(gòu)成；(b)—種蛋白質(zhì)，其由在序列號1表示的氨基酸序列中，有l(wèi)個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成，且是具有第l項(xiàng)的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。第4項(xiàng).基因，其編碼第3項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。第5項(xiàng).基因，其由以下(i)或(ii)的DNA構(gòu)成(O—種DNA,其由序列號2表示的4^序列構(gòu)成；(ii)一種DNA,其在嚴(yán)*件下與由序列號2表示的#序列構(gòu)成的DNA和由與其相互補(bǔ)的磁J^序列構(gòu)成的DNA雜交，且編碼作為具有1的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶的蛋白質(zhì)。第6項(xiàng).基因，其編碼以下(a)、(b)或(c)的任意一種蛋白質(zhì)(a)—種蛋白質(zhì)，其由序列號l表示的氨基酸序列構(gòu)成；(b)—種蛋白質(zhì)，其由在序列號1表示的氨基酸序列中，有l(wèi)個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成，且是具有第l項(xiàng)的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。(c)一種蛋白質(zhì)，其與序列號l表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性，且是具有第1項(xiàng)的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。第7項(xiàng).重組載體，其含有第4項(xiàng)~第6項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的基因。第8項(xiàng).轉(zhuǎn)化體，其含有第7項(xiàng)所述的重組栽體。第9項(xiàng).蛋白酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)第8項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，并從培養(yǎng)物中回收蛋白酶。第10項(xiàng).蛋白酶生產(chǎn)菌，其屬于鐮刀菌屬，生產(chǎn)第l項(xiàng)所述的蛋白酵。第11項(xiàng).如第10項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，其特征在于，(iii)具有由序列號3表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的ITS-5.8SrDNA,或者(iv)具有由序列號4表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的28SrDNA。第12項(xiàng).如第10項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，其為鐮刀菌sp.BLB(Fusariumsp.BLB)(FERMBP-10493)。第13項(xiàng).蛋白酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)第10項(xiàng)~第12項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，并從培養(yǎng)物中回收蛋白酶。第14項(xiàng).血栓溶解劑，其含有第l項(xiàng)所述的蛋白酶或第3項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。第15項(xiàng).血栓癥的治療或預(yù)防方法，其包括如下工序?qū)ρòY患者或者有必要預(yù)防血栓癥的人，以治療或預(yù)防血栓癥的有效量給予第1項(xiàng)所述的蛋白酶或第3項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。第16項(xiàng).如第l項(xiàng)所述的蛋白酶或第3項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)的用于制造血栓溶解劑的使用。第17項(xiàng).食品，其含有第l項(xiàng)所述的蛋白酶或第3項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)。第18項(xiàng).發(fā)酵食品，將第10項(xiàng)~第12項(xiàng)中任一項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌接種于食品原料并使其發(fā)酵。本發(fā)明的蛋白酶，由于具有優(yōu)異的血栓溶解作用，從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的，所以其工業(yè)應(yīng)用范圍廣，特別是，在食品或醫(yī)藥等領(lǐng)域中是有用的。此外，使用本發(fā)明的蛋白酶生產(chǎn)菌制成的發(fā)酵食品，由于基于該蛋白酶的作用而能夠發(fā)揮有用的生理活性，所以作為健康食品的價(jià)值高。圖1:表示本發(fā)明的蛋白酶(來源于鐮刀菌sp.BLB林)的作用溫度和最佳溫度的圖。圖2:表示本發(fā)明的蛋白酶(來源于鐮刀菌sp.BLB林)的pH穩(wěn)定性的圖。圖3:表示本發(fā)明的蛋白酶(來源于鐮刀菌sp.BLB林)的作用溫度和最佳溫度的圖。圖4:表示本發(fā)明的蛋白酶(來源于鐮刀菌sp.BLB林)的熱穩(wěn)定性的圖。具體實(shí)施方式以下，詳細(xì)+兌明本發(fā)明。1.蛋白酶以下，對本發(fā)明的蛋白酶的諸多酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行說明。(蛋白酶活性測定法-纖維蛋白平板法)將來源于牛血漿的纖維蛋白原(SIGMA公司制)溶解于pH7.2的0.1M磷酸緩沖液中，使得濃度達(dá)到0.5重量％。不溶物用濾紙(東洋濾紙，No.2)過濾。將該溶液以20ml分注于角2號培養(yǎng)皿(144x104x16mm)中，邊攪拌邊添加lOOjil的50U/ml凝血酶溶液。形成纖維蛋白并凝固后，在37"C下預(yù)孵育30分鐘。向該纖維蛋白平板(人工血栓)滴加樣品(蛋白酶溶液)30fd,在37t:測定4小時(shí)后的溶解面積(長徑x短徑)。將該面積與同樣測定的尿激酶相比，從而可以將該面積換算成尿激酶國際單位。(蛋白酶活性測定法—酪蛋白分解法)使用100mM的硼酸緩沖液(pH10)，以最終濃度為1重量％的方式調(diào)制/、"T^X^》氏酪蛋白溶液，在調(diào)制好的？、"T/l/只^》氏酪蛋白溶液1.5ml中添加樣品(蛋白酶溶液)0.5ml,在37t反應(yīng)10分鐘。添加0.44M三氯乙酸溶液2ml來停止反應(yīng)，放置20分鐘后，過濾沉淀物。在該濾液lml中依次加入0.44M碳酸鈉7JC溶液5ml和酚試劑(每100ml含有鴒酸鈉二水合物9.1g、鉬酸鈉二水合物2.3g、磷酸4.5ml、鹽酸9.1ml、石克酸鋰13.6g)lml，放置20分鐘后，測定吸光波長660nm處的吸光度。在上述的測定中，酶單位如下定義將在l分鐘內(nèi)把相對于ljig酪氨酸的酸可溶性蛋白質(zhì)分解物游離的酶量定義為1個(gè)單位。(蛋白酶活性測定法-合成基質(zhì)法)在200mM的各種緩沖液500^1中，添加50mM的合成基質(zhì)5ji1和樣品(蛋白酶溶液)455jil，在37C進(jìn)行10分鐘反應(yīng)，測定吸光波長405nm處的吸光度。在上述的測定中，酶單位如下定義將在l分鐘內(nèi)把1納摩爾的對硝基苯胺游離的酶量定義為1個(gè)單位。(1)作用和基質(zhì)特異性對纖維蛋白具有強(qiáng)的分解活性。以對于作為合成基質(zhì)的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA的分解活性設(shè)為100，將對于各種合成基質(zhì)的分解活性(相對活性(％))示于表i中。對于作為合成基質(zhì)的H畫D誦Ile國Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys國pNA及Bz-L-Arg-pNA具有分解活性。特別是，對H-D-Ile-Pro-Arg-pNA和H-D-Val-Leu-Lys-pNA具有強(qiáng)的分解活性。另一方面，對于作為合成基質(zhì)的Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA、Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA和Gle-Phe-pNA不具有分解活性。[表1<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>(2)作用pH和最佳pH用各種緩沖液(pH2-3甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH3.5-6醋酸緩沖液、pH6-8磷酸緩誶液、pH8-9TRIS-鹽酸緩沖液、pH9-12甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，測定Bz-L-Arg-pNA的分解活性，將其結(jié)果示于圖1。如圖1所示，至少在pH6.5~11.5下發(fā)揮作用，最佳pH為約8.5~9.5。在此，"發(fā)揮作用，，是指以最佳pH(pH9.5)的活性為100%時(shí)的相對活性顯示為30%以上。(3)pH穩(wěn)定性在50mM的各種緩沖液(pH2-3甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH3.5-6醋酸緩沖液、pH6-8磷酸緩—液、pH8-9TRIS-鹽酸緩沖液、pH9-12甘氨酸-氬氧化鈉緩沖液)中添加本蛋白酶，在4t:放置20小時(shí)。對于所述處理后的蛋白酶，4吏用作為合成基質(zhì)的Bz-L-Arg-pNA，用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.5)測定殘存活性(圖2)。如圖2所示，在4"C、20小時(shí)的處理?xiàng)l件下，至少在pH2.511.5的范圍內(nèi)是穩(wěn)定的。在此，"是穩(wěn)定的，，是指殘存活性為90%以上。(4)作用溫度及最佳溫度1吏用作為合成基質(zhì)的Bz-L-Arg-pNA，用100mM的醋酸緩沖液pH5.0測定30~60匸中的分解活性，將結(jié)果示于圖3。如圖3所示，至少在3050X:下發(fā)揮作用，最佳溫度為約45~50r!。在此，"發(fā)揮作用"是指以最佳溫度(50X:)的活性為100%時(shí)的相對活性顯示為30%以上。(5)溫度穩(wěn)定性在50mM的醋酸緩沖液pH5.0中添加本蛋白酶，在2080"C放置10分鐘。對于所述處理后的蛋白酶，使用作為合成基質(zhì)的Bz-L-Arg-pNA,用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH9.5測定殘存活性(圖4)。如圖4所示，在pH5、IO分鐘的處理?xiàng)l件下，至少到約55X:為止是穩(wěn)定的。在此，"是穩(wěn)定的"是指殘存活性顯示為卯％以上。(6)分子量用SDS-PAGE(Laemmli的方法)測定得到的推定分子量為約27000。(7)抑制特性使用50mM的醋酸緩沖液pH5，使其與各種蛋白酶抑制劑共存，在37"C下放置1小時(shí)后，用作為合成基質(zhì)的Bz-L-Arg-pNA測定活性。算出以不存在抑制劑的條件下的活性為100時(shí)的相對活性(％)，將結(jié)果示于表2。由表2可知，本蛋白酶被lmM的PMSF和O.lmM的DFP抑制。另一方面，本蛋白酶不被0.01mg/ml的SBTI抑制。而且，本蛋白酶也不被表2中示出的其他蛋白酶抑制劑抑制。[表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>本說明書中關(guān)于蛋白酶抑制劑的各縮寫標(biāo)記的意思如下。SBTI:大豆胰蛋白酶抑制劑、SSI:鏈霉菌屬枯草桿菌蛋白酶抑制劑、￡-ACA:￡-氨基己酸、PMSF:苯甲基磺酰氟、TPCK:N-甲苯磺?；?L-苯丙氨酰氯曱酮、DFP:二異丙基氟磷酸酯、EDTA:乙二胺四乙酸、E-64:t-環(huán)氧琥珀酰-L-亮氨酰胺(4-胍基)丁烷、SPI:鏈霉菌屬胃蛋白酶抑制劑。由以上的酶學(xué)性質(zhì)，本發(fā)明的蛋白酶雖然被認(rèn)為是胰蛋白酶型的絲氨酸蛋白酶的一種，但不被SBTI抑制，而且由于基質(zhì)特異性及較廣的pH穩(wěn)定性等，與以往的絲氨酸蛋白酶相比是明顯不同的新型蛋白酶。本發(fā)明的蛋白酶由于在寬pH區(qū)域內(nèi)是穩(wěn)定的，所以能夠在多個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用。例如，除了后述的作為血栓溶解劑、食品的應(yīng)用之外，還可以在難分解性蛋白質(zhì)的分解、食用肉的軟化、氨基酸的制造、能夠在醫(yī)藥或食品中應(yīng)用的生理活性肽的制造、面包的制造、發(fā)酵食品(例如奶酪等)的制造等中利用。進(jìn)而，從M斷列的觀點(diǎn)出發(fā)，本發(fā)明提供以下(a)、(b)或(c)的蛋白質(zhì)(a)—種蛋白質(zhì)，其由序列號l表示的氨基酸序列構(gòu)成；(b)—種蛋白質(zhì)，其由在序列號1表示的氨基酸序列中，有1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成，且是具有上述(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶；(c)一種蛋白質(zhì)，其與序列號l表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性，且是具有上述(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。序列號l表示的氨基酸序列，相當(dāng)于序列號2表示的堿基序列的開放閱讀框架(ORF)所編碼的氨基酸序列。對于上述(b)的蛋白質(zhì)，"1個(gè)或2個(gè)以上"的范圍沒有特別限定，是指例如1~50個(gè)，優(yōu)選1~25個(gè)，更優(yōu)選1~12個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選1~9個(gè)，特別優(yōu)選15個(gè)。在特定的氨基酸序列中，使1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸取代、缺失或添加的技術(shù)是公知的。對于上述(c)的蛋白質(zhì)，作為與序列號l表示的氨基酸序列的同源性，理想的是80%以上，優(yōu)選90%以上，特別優(yōu)選95%以上。氨基酸序列的同源性，可以用通過市售或電通信回路(因特網(wǎng))而能夠利用的解析工具來算出。具體而言，使用BLAST(J.Mol.Biol.,1^，403,1990)的解析軟件來計(jì)算。此外，對于上述(b)和(c)的蛋白質(zhì)，蛋白酶活性除了上述(1)及(7)欄所述的特性之外，優(yōu)選滿足上述(2)~(5)所述特性的至少任意之一，特別優(yōu)選滿足上述(2)~(5)所述的所有特性。2.蛋白酶生產(chǎn)菌進(jìn)而，作為生產(chǎn)上述蛋白酶的微生物(蛋白酶生產(chǎn)菌)，本發(fā)明提供屬于鐮刀菌屬的微生物。作為該蛋白酶生產(chǎn)菌，只要是屬于鐮刀菌屬、并能夠生產(chǎn)具有上述性質(zhì)的蛋白酶的菌，任何菌都可以。作為所述生產(chǎn)菌之一例，可舉出從使用木槿屬植物的葉制成的根霉中分離出的鐮刀菌sp.BLB林。該鐮刀菌sp.BLB林具有產(chǎn)生由序列號1表示的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白質(zhì)的能力。應(yīng)說明的是，確認(rèn)該鐮刀菌sp.BLB林沒有產(chǎn)生真菌毒素的能力。以下，示出鐮刀菌sp.BLB林的菌學(xué)性質(zhì)和遺傳學(xué)性質(zhì)。(i)菌學(xué)性質(zhì)接種于細(xì)菌用土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(BactoPotatoDextroseAgar;BECTONDICKINSON公司制)、細(xì)菌用燕麥瓊脂培養(yǎng)基(BactoOatmealAgar;BECTONDICKINSON公司制)和含有細(xì)菌用麥芽提取物的瓊脂培養(yǎng)基[含有2重量％的細(xì)菌用麥芽提取物(BactoMaltExtract;BECTONDICKINSON公司制)+1.5重量％的瓊脂]的各板，在25t:進(jìn)行最長6周的培養(yǎng)，顯示下述特性。(a)生長所有板中在25X:的生長都快，在培養(yǎng)10天以內(nèi)顯示出覆蓋直徑85mm板全部表面的生長。(b)菌絲菌絲為從天鵝絨狀(veltinous)到羊毛狀(Floccose)，表面色調(diào)從最初就顯示白色，看不到背面著色。觀察不到分生孢子附生所致的菌落表面的變化。(c)可溶性色素看不到可溶性色素(solublepigment)的產(chǎn)生。(d)分生孢子形成小分生孢子(microconidia)和大分生抱子(macroconidia)。小分生孢子為瓶梗型(phialidic),是Acremonium屬樣的分生孢子柄(cinidi叩here)的結(jié)構(gòu)。分生孢子柄幾乎為單生，大量形成較長的柄(stipe)。小分生孢子為1~2個(gè)細(xì)胞，具有粘性，從柄頂端形成塊狀(slimy),形狀為紡錘狀(fusiform),表面是平滑的(smooth)。大分生孢子在空氣中菌絲基部形成，為2~4個(gè)細(xì)胞，形成新月狀(hmiform)，表面是平滑的，具有足細(xì)胞(footcell)。大量形成大分生孢子的寬幅為中厚、長度為中等程度的大分生孢子。(ii)遺傳學(xué)性質(zhì)將鐮刀菌sp.BLB林的染色體DNA所含的ITS-5.8SrDNA區(qū)域(internaltranscriptionspacer區(qū)域和5.8S核糖體RNA基因)(以下稱為ITS-5.8SrDNA)的堿基序列示于序列表的序列號3。此外，將鐮刀菌sp.BLB林的染色體DNA所含的28S核糖體RNA基因(以下稱為28SrDNA)的堿基序列示于序列表的序列號4。這些ITS-5.8SrDNA和28SrDNA的堿基序列的確定可如下進(jìn)行從鐮刀菌sp.BLB林中提取基因組DNA,以該基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR，將ITS-5.8SrDNA和28SrDNA區(qū)域擴(kuò)增，根據(jù)常規(guī)方法確定其全長的堿基序列。應(yīng)說明的是，ITS-5.8SrDNA通過PCR進(jìn)行的擴(kuò)增中，使用引物ITS5和ITS4(White,T.J.,T.Bruns，S.Lee,andJ.W.Tayer.(1990)AmplificationanddirectsequencingoffungalribosomalRNAgeneforphylogenetics.InInnis,M.A.，Gelfand，D.H.,Sninsky,J.J.,andWhite,T.J.(eds)PCRprotocols,aguidetomothodsandapplications,AcademicPress,Inc.,NewYork,pp.315-322)，而且，28SrDNA通過PCR進(jìn)行的擴(kuò)增中，4吏用引物NLl和NL2(O，Donnell，K.(1993)Fusariumanditsnearrelatives.InReynolds,D.R.andTayor，J.W.(Eds)TheFungalHolomorph:Mitotic,MeioticandPleomorphicSpeciationinFungalSystematics,CABInternationalWallingford,UK,pp.225-233)。對于鐮刀菌sp.BLB林的ITS-5.8SrDNA和28SrDNA的堿基序列，進(jìn)行對GenBank數(shù)據(jù)庫的BLAST檢索，確i人鐮刀菌sp.BLB林是屬于鐮刀菌屬的種名不祥的菌林。該鐮刀菌sp.BLB林在平成17年1月20日，在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心(日本茨城縣筑波市東1-1-1中央6(郵編305-8566))，作為保藏編號FERMP-20370而保藏。而且，該菌林現(xiàn)在被移交到國際保藏，其保藏編號為FERMBP-10493。除了上述鐮刀菌sp.BLB林之外，作為該蛋白酶生產(chǎn)菌的具體例子，可列舉具有由序列號3表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的ITS-5.8SrDNA的絲狀菌；以及具有由序列號4表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的28SrDNA的絲狀菌。3.蛋白酶的制造方法本發(fā)明的蛋白酶的制造方法，可以通過培養(yǎng)上述蛋白酶生產(chǎn)菌，并從培養(yǎng)物中提取蛋白酶來實(shí)施。作為本發(fā)明的制造方法中使用的培養(yǎng)基，只要是該微生物良好生長并生產(chǎn)蛋白酶的適當(dāng)培養(yǎng)基就沒有特別限定，可以使用適當(dāng)?shù)奶荚?、氮源、無機(jī)鹽、含有其他營養(yǎng)源的合成培養(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。例如，作為培養(yǎng)基的碳源，可列舉葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、甘油、糊精、寡糖、淀粉、糖蜜、玉米漿、麥芽提取物、有機(jī)物等。此外，作為氮源，可列舉玉米漿、酵母提取物、各種胨、大豆粉、肉提取物、麥糠提取物、酪蛋白、氨基酸和尿素等有機(jī)氮源，硝酸鹽、銨鹽等無機(jī)氮源等。作為無機(jī)鹽類，可列舉鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鐵鹽及其他金屬鹽等。進(jìn)而，作為其他營養(yǎng)源，可列舉維生素類、氨基酸類、核酸類等。培養(yǎng)，可以是固體培養(yǎng)或液體培養(yǎng)的任意一種，可按照一般的微生物培養(yǎng)來進(jìn)行。優(yōu)選的是液體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)可以通過通氣攪拌培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)等來進(jìn)行。此外，液體培養(yǎng)時(shí)，對于培養(yǎng)方式，可以是分批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)的任意方式。培養(yǎng)條件(溫度、pH等)可以根據(jù)培養(yǎng)的蛋白酶生產(chǎn)菌的生長特性來適當(dāng)設(shè)定。作為培養(yǎng)溫度之一例，可列舉2035"C、優(yōu)選25~30匸。此外，作為pH條件之一例，可列舉pH48、優(yōu)選pH57。作為培養(yǎng)時(shí)間，隨培^方法、培養(yǎng)基的種類和量、溫度以及pH條件等而不同，不能一概地規(guī)定，通?？梢栽O(shè)為24~120小時(shí)、優(yōu)選6090小時(shí)左右。如此培養(yǎng)得到的菌體和培養(yǎng)上清中蓄積蛋白酶。為了從菌體內(nèi)溶出蛋白酶，可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。具體而言，可例示下述方法直接將培養(yǎng)液，或通過離心分離或過濾等將菌體分離后將其供給如下處理，即用超聲波、弗氏壓碎器或高壓均質(zhì)器等的機(jī)械破碎處理，用環(huán)己烷、甲苯或乙酸乙酯等進(jìn)行的處理，或用溶菌酶進(jìn)行的溶菌處理，從而使蛋白酶溶出到菌體外?？筛鶕?jù)需要將這樣得到的蛋白酶溶出液和含有蛋白酶的培養(yǎng)上清精制到目的純度和濃度。為了精制蛋白酶，可舉出單獨(dú)或以任意順序適當(dāng)組合來進(jìn)行如下處理，并回收蛋白酶活性部分的方法，所述處理為例如溶劑提取、各種樹脂(例如離子交換、吸附、分子篩等)處理、膜(例如膜濾器、超濾、精密過濾、反滲透等)處理、活性碳處理、超臨界流體提取處理、蒸餾處理、晶析或其他處理。此外，除了上述的制造方法之外，如后所述，可以通過培養(yǎng)導(dǎo)入有編碼該蛋白酶氨基酸序列的基因的轉(zhuǎn)化體來制造本發(fā)明的蛋白酶。4.編碼上述蛋白酶的基因、重組載體及轉(zhuǎn)化體基因本發(fā)明還提供編碼上述蛋白酶的基因。具體而言，作為本基因，例示有編碼上述(a)、(b)或(c)的任意一種蛋白質(zhì)的基因。如上所述，在特定的氨基酸序列中，取代、缺失或添加1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸的技術(shù)是公知的，編碼上述(b)的蛋白質(zhì)的基因的制造也可以使用市售的試劑盒等、根據(jù)公知的方法來實(shí)施。此外，作為其他方式，作為編碼上述蛋白酶的基因，具體而言，是由以下(0或(ii)的DNA構(gòu)成的聚核苷酸(i)一種DNA,其由序列號2表示的^序列構(gòu)成；(ii)一種DNA，其在嚴(yán)格條件下與由序列號2表示的^序列構(gòu)成的DNA和由與其相互補(bǔ)的g序列構(gòu)成的DNA雜交，且編碼具有對纖維蛋白、H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu國Lys-pNA及Bz-L畫Arg-pNA的分解活性，對Bz-L-Arg-pNA的分解活性不,皮0.01mg/ml的SBTI抑制的蛋白質(zhì)。在此，在上述(ii)的DNA中，所謂的嚴(yán)4NHt，是指例如在65匸下、在5xSSC溶液(1倍濃度的SSC溶液的組成是150mM氯化鈉、15mM檸檬酸鈉)中進(jìn)行雜交，進(jìn)而在含有0.1%的SDS的0.5xSSC溶液中于65r進(jìn)行清洗的條件。在嚴(yán)格條件下的雜交的各操作可通過"MolecularCloning(ThirdEdition)"(J.Sambrook&D.W.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2001)中記載的方法等用以往^>知的方法來進(jìn)行。通常，溫度越高，鹽濃度越低，嚴(yán)旨ft越高。在嚴(yán)格務(wù)fr下進(jìn)行雜交的DNA，通常與作為探針使用的DNA的#序列具有一定以上的同源性，該同源性可列舉例如70o/。以上、優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上、特別優(yōu)選95%以上。g序列的同源性可用能通過市售或電通信回路(因特網(wǎng))而能夠利用的解析工具來算出。具體而言，使用BLAST(J.Mol.Biol.，^1，403，19卯)的解析軟件來計(jì)算。本基因可如下獲得將由上述蛋白酶生產(chǎn)菌根據(jù)常規(guī)方法調(diào)制的全mRNA作為模板，使用設(shè)計(jì)成能夠擴(kuò)增本基因全長的引物，通過RT-PCR法來獲得。此外，本基因還可如下獲得將來源于上述蛋白酶生產(chǎn)菌的cDNA文庫作為模板，使用設(shè)計(jì)成能夠擴(kuò)增本基因全長的引物，通過PCR法來獲得。利用PCR法進(jìn)行的本基因的擴(kuò)增，通過在含有成為模板的cDNA、PCR緩沖液、引物對(正向引物和反向引物)、dNTP混合物(脫氧核糖核苷三磷酸的混合物)和DNA聚合酶的反應(yīng)液中，重復(fù)溫度升降的循環(huán)來實(shí)施。正向引物和反向引物，是基于例如位于本基因的5，末端或其周邊及3，末端或其周邊的任意的約10~40bp的核苷酸序列來設(shè)計(jì)的，根據(jù)常規(guī)方法合成。具體而言，作為該P(yáng)CR中使用的引物對，可例示TempeRTForedl引物(5，-CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT畫3，)和TempeRTRevesel引物(5，-AGTACCTAAGCCAAAATATGC畫3，)的引物對。PCR緩沖液，可以根據(jù)使用的DNA聚合酶等進(jìn)行適當(dāng)選擇，可以使用市售品。dNTP混合物和DNA聚合酶可以使用市售品。PCR的反應(yīng)可依照慣用的步驟或DNA聚合酶的說明書來進(jìn)行，可以根據(jù)需要，適當(dāng)改變反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)循環(huán)、反應(yīng)組成等來實(shí)施。作為PCR的條件，可列舉例如以在98K20秒(改性)、在55"C20秒(復(fù)性)、在68*C60秒(伸長)構(gòu)成的反應(yīng)工序?yàn)?個(gè)循環(huán)，將其進(jìn)行30次循環(huán)的條件。重組載體上述基因被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)妮d體中來使用。能夠在本發(fā)明中使用的載體，可以是獨(dú)立復(fù)制的載體(例如質(zhì)粒等)，還可以是導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)編入宿主細(xì)胞的基因組中、與所編入的染色體一起被復(fù)制的載體。作為該載體，具體而言，可列舉來源于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、病毒(例如桿狀病毒、乳多泡病毒、SV40、痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、假性狂犬病病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等)等的載體；來源于質(zhì)粒及噬菌體的遺傳學(xué)要素的載體(例如粘粒和噬菌粒等)。該栽體優(yōu)選為表達(dá)載體。表達(dá)載體中，本基因可功能性地連結(jié)轉(zhuǎn)錄所必需的要素(例如啟動子等)。含有上述基因的重組載體，可以將上述基因的序列與承擔(dān)復(fù)制和控制相關(guān)信息的序列(例如啟動子、核糖體結(jié)合部位、終止子、信號序列、增強(qiáng)子等)、選擇標(biāo)記基因的序列等作為構(gòu)成要素，通過公知的方法將它們組合來制作。上述基因，可以通過公知的方法插入到栽體DNA中。例如，可以使用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶將DNA和載體DNA在特定部位切斷，混合后通過連接酶再結(jié)合。此外，在上述基因上連接適當(dāng)?shù)倪B接體，即使將其插入到適于目的載體的多克隆位點(diǎn)上，也能夠得到重組載體。轉(zhuǎn)化體對于大腸桿菌、桿菌屬細(xì)菌等細(xì)菌，酵母，昆蟲細(xì)胞，動物細(xì)胞等公知的宿主細(xì)胞，用公知的方法導(dǎo)入編入有上述基因的重組栽體，從而可得到導(dǎo)入有上述基因的轉(zhuǎn)化體?；?qū)敕椒]有特別限制，優(yōu)選的是在染色體中的整合法。將上述重組載體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入，可根據(jù)宿主細(xì)胞的種類，適當(dāng)選擇公知的方法來進(jìn)行。作為將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法，具體而言，可列舉磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介質(zhì)轉(zhuǎn)染、微注射、陽離子脂質(zhì)介質(zhì)轉(zhuǎn)染、電穿孔等。通過培養(yǎng)導(dǎo)入有上述基因的轉(zhuǎn)化體，從培養(yǎng)物中回收本發(fā)明的蛋白酶，可以制造本發(fā)明的蛋白酶。培養(yǎng)，可以使用適于宿主的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)或分批培養(yǎng)。培養(yǎng)，可以以在轉(zhuǎn)化體內(nèi)外產(chǎn)生的蛋白酶的量為指標(biāo)，一直進(jìn)行到可獲得適量的本發(fā)明的蛋白酶。對于蛋白酶的回收方法，可以用與上述"2.蛋白酶的制造方法"欄中記載的方法相同的方法來實(shí)施。5.血栓溶解劑和食品上述蛋白酶的血栓溶解作用優(yōu)異，通過作為血栓溶解劑的有效成分使用，在治療和預(yù)防血栓癥方面是有用的。例如，可以直接使用上述蛋白酶，或?qū)⑸鲜龅鞍酌肝盎?，將其作為血栓溶解劑直接靜脈注射來使用。此外，可以根據(jù)常規(guī)方法將上述蛋白酶制成片劑、散劑、顆粒劑、膠嚢劑、液體制劑等形態(tài)，將其作為血栓溶解劑來口服使用。對于該血栓溶解劑的給藥量，根據(jù)給藥對象的性別及年齡、血栓癥的癥狀程度、該制劑的形態(tài)及給藥方法等的不同而異，例如通常，上述蛋白酶的給藥量每l天為0.001~20g、優(yōu)選為0.0110g的量。該血栓溶解劑優(yōu)選制劑成上述給藥量單位。此外，上述蛋白酶由于具有血栓溶解作用，且在寬pH區(qū)域是穩(wěn)定的，所以也能夠配合于各種形態(tài)的食品。這樣，含有上述蛋白酶的食品作為治療或預(yù)防血栓癥用的食品是有用的，除此之外，作為易吸收性食品、蛋白質(zhì)強(qiáng)化食品等也是有用的。對于含有上述蛋白酶的食品，該蛋白酶的含有比例可根據(jù)食品的形態(tài)等進(jìn)行適當(dāng)設(shè)定，通常為0.0001~20重量％，優(yōu)選0.001~10重量％。此外，作為該食品每l天的攝取量，根據(jù)食品的形態(tài)、攝取者的性別及年齡等的不同而異，例如換算成上述蛋白酶的攝取量，相當(dāng)于每l天為0.001~20g，優(yōu)選為0.01~10g的量。6.發(fā)酵食品上述蛋白酶生產(chǎn)菌，由于在安全性上沒有問題，對人體無害，所以可以直接食用，因此可以將該菌用于發(fā)酵食品的制造。即，本發(fā)明還提供通過將上述蛋白酶生產(chǎn)菌進(jìn)一步接種于食品原料并使其發(fā)酵而得到的發(fā)酵食品。作為該發(fā)酵食品的制造中使用的食品原料，可列舉例如大豆、花生、小豆、蠶豆等豆類，米、麥等谷類，可可，豆腐渣等。該發(fā)酵食品中，作為優(yōu)選的物質(zhì)，可列舉使用豆類作為食品原料而制成的物質(zhì)。該發(fā)酵食品可如下制造在食品原料中加入水，使得水分含量為30~70重量％，根據(jù)需要進(jìn)行滅菌之后，接種上述蛋白酶生產(chǎn)菌，在2035X:下培養(yǎng)24~72小時(shí)。此外，根據(jù)需要，還可以預(yù)先在食品原料中添加促進(jìn)蛋白酶生產(chǎn)菌生長的物質(zhì)(例如淀粉等)。該發(fā)酵食品由于含有上述蛋白酶，所以基于該蛋白酶的作用而發(fā)揮以血栓溶解作用為代表的各種生理作用，因此作為健康食品是有用的。此外，使用上述蛋白酶生產(chǎn)菌制成的大豆發(fā)酵食品與使用以往的根霉菌制成的根霉相比，呈現(xiàn)不同的風(fēng)味，具有新的喜好性，并且在基于上述蛋白酶的作用而發(fā)揮優(yōu)異的生理作用這一點(diǎn)上是優(yōu)異的。實(shí)施例以下，基于實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些例子。實(shí)施例1蛋白酶的制造將從使用木槿屬植物的葉制成的根霉中分離出的鐮刀菌sp.BLB抹(FERMBP-10493)用1個(gè)接種環(huán)接種于30ml的液體培養(yǎng)基(含有脫脂大豆粉末2重量％、葡萄糖2重量％、聚胨0.5重量％、酵母提取物0.2重量％、KH2P040.1重量。/。和MgS040.05重量o/。)，在28C振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，將其作為前培養(yǎng)液。接著，將15ml的前培養(yǎng)液接種于1.5L的液體培養(yǎng)基(含有脫脂大豆粉末4重量％、葡萄糖3重量％、酵母提取物0.2重量％、KH2PO40.1重量o/。、K2HPO40.1重量％、MgSO40.05重量％和硅0.03重量％),在發(fā)酵罐中，在通氣量為0.5VVM、28"C的條件下培養(yǎng)72小時(shí)。用壓濾器將所得培養(yǎng)液固液分離。根據(jù)上述酪蛋白分解法測定所得培養(yǎng)上清的蛋白酶活性，結(jié)果為68.2單位/ml。而且，根據(jù)上述纖維蛋白平板法測定所得培養(yǎng)上清的蛋白酶活性，結(jié)果為1500IU/ml。實(shí)施例2蛋白酶的精制在實(shí)施例l所得的培養(yǎng)上清3500ml中以達(dá)到70%飽和的方式添加疏酸銨，將蛋白質(zhì)鹽析。將通過離心分離得到的沉淀物溶解于100ml的20mM醋酸緩沖液(pH5.0)中，用相同緩沖液進(jìn)行透析脫鹽。進(jìn)而，將透析內(nèi)液350ml通過經(jīng)相同緩沖液平衡化的CM-TOYOPEARL色鐠柱(4.5x30cm、TOSOH^^司制)，使蛋白質(zhì)吸附在色譜柱上，用直線濃度梯度法將所吸附的蛋白質(zhì)溶出，所述直線濃度梯度法使用直到0.5MNaCl濃度的相同緩沖液?；厥绽业鞍缀屠w維蛋白分解活性部分l卯ml，向其中添加硫酸銨，使得再次達(dá)到70%飽和，將蛋白質(zhì)鹽析。將通過離心分離得到的沉淀物溶解于含有0.2MNaCl的相同緩沖液3ml，<吏用Superdex75色^普柱(AmershamBioscience公司制)進(jìn)4亍凝膠過濾，回收酪蛋白和纖維蛋白分解活性部分。在如此得到的部分(最終精制物)中，確認(rèn)了具有如下特性的蛋白酶被精制(l)對于最終精制物，確認(rèn)其作用和基質(zhì)特異性后，獲得上述表l所示的結(jié)果。最終精制物的蛋白酶活性用酪蛋白分解法測定，結(jié)果為634U/mg。(2)對于最終精制物，確i人其作用pH和最佳pH后，獲得圖l所示的結(jié)果。(3)對于最終精制物，確認(rèn)其pH穩(wěn)定性后，獲得圖2所示的結(jié)果。U)對于最終精制物，確認(rèn)其作用溫度和最佳溫度后，獲得圖3所示的結(jié)果。(5)對于最終精制物，確認(rèn)其溫度穩(wěn)定性后，獲得圖4所示的結(jié)果。(6)對于最終精制物，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，顯示單一的帶(推定分子量約27000)。(7)對于最終精制物，確認(rèn)抑制劑的影響后，獲得上述表2所示的結(jié)果。此外，如此得到的最終精制物，通過使用小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了安全性。而且，對于該最終精制物，還確認(rèn)了突然變異誘發(fā)性為陰性。實(shí)施例3蛋白酶的氨基酸序列和編碼其的堿基序列的鑒定<編碼實(shí)施例2所得蛋白酶的基因組DNA序列的鑒定〉對于上述在實(shí)施例2中得到的蛋白質(zhì)，解析N末端側(cè)的氨基酸序列。已知在上述實(shí)施例2中所得蛋白質(zhì)的N末端側(cè)的氨基酸序列對來源于Fusariumoxysporum、PhaeosphaerianodorumSNP1和Verticilliumdahliae的胰蛋白酶具有同源性。因此，考慮到這些信息，設(shè)計(jì)引物對A(5，誦GGCGACTTTCCCTTCATCGTGAGCAT畫3，和5，-TCACCCTGGCAAGAGTCCTTGCCACC-3，)。4吏用該引物對A,以鐮刀菌sp.BLB林(FERMBP-10493)的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)中使用LATaq聚合酶(TaKaRa公司)。使用ISOPLANT(NIPPONGENE公司)從鐮刀菌sp.BLB林中提取基因組DNA。其結(jié)果，約600bp的DNA片段被擴(kuò)增。接著，對該擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)新的引物對B(5，-ACCATTCCCATTGTCTCTCGCGCCACTT-3,和5，-GGCGTTAAGAAGGGTACCACCGCACCAA-3，)。另一方面，將鐮刀菌sp.BLB林的基因組DNA進(jìn)行Sail消化之后，使其自身伸長(selfligation)。以其為模板，使用引物對B進(jìn)行反向PCR反應(yīng)，結(jié)果約2.5Kbp的DNA片段擴(kuò)增了。進(jìn)而，對得到的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，設(shè)計(jì)新的引物對C(5，-CTTGCCAGGGTGACAGCGGTGGCCC-3，和5，-CAAGGATCAGCATCCCGATGAGGAAAGT-3，)。另一方面，將鐮刀菌sp.BLB林的基因組DNA進(jìn)行SacI消化之后，使其自身伸長(selfligation)。以其為模板，使用引物對C進(jìn)行反向PCR反應(yīng)，結(jié)果約4Kbp的DNA片段擴(kuò)增。對該擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，明確了編碼本發(fā)明蛋白酶的1740bp的基因組堿基序列(序列號5)。另外，此處的基因操作所用的試劑使用TaKaRa公司制的試劑。而且，DNA測序中使用BigDyeTerminatorv3.1CycleSequencingKit(AppliedBiosystems公司)。<編碼實(shí)施例2所得蛋白酶的cDNA序列和氨基酸序列的鑒定〉上述鑒定的基因組堿基序列(序列號5)中存在內(nèi)含子，所以為了確定編碼實(shí)施例2所得蛋白酶的區(qū)域，有必要鑒定cDNA的堿基序列。因此，；限據(jù)以下的方法，進(jìn)行編碼實(shí)施例2所得蛋白酶的cDNA序列和氨基酸序列的鑒定。首先，4吏用鐮刀菌sp.BLB林的培養(yǎng)液和FastRNAProKit(BIO101公司)，獲得全RNA。進(jìn)而，使用SuperScriptlllFirst-StrandSystem(Invitrogen7>司)和OligodT引物，由所得全RNA調(diào)制cDNA文庫。另外制作TempeRTForedl引物(5'CCTTCGCCTGTTCTTCATCAT國3，)和TempeRTRevesel引物(5，畫AGTACCTAAGCCAAAATATGC-3，)。使用該引物對、LATaq(TaKaRa公司)和上述得到的cDNA文庫，通過PCR法擴(kuò)增目的cDNA。PCR反應(yīng)條件為(98"C20秒、55"C20秒、68"C60秒)進(jìn)行30次循環(huán)。對擴(kuò)增得到的約800bp的DNA片段進(jìn)行測序，結(jié)果明確編碼實(shí)施例2所得蛋白酶的cDNA序列(序列號2)和實(shí)施例2所得蛋白酶的氨基酸序列(序列號l)。明確了，實(shí)施例2所得蛋白酶的氨基酸序列(序列號1)與來源于Fusariumoxysporum的胰蛋白酶具有76%的同源性，與來源于PhaeosphaerianodorumSNP1的胰蛋白酶具有62%的同源性。實(shí)施例4發(fā)酵食品的制造將lkg大豆在3L的1.0重量％乳酸水溶液中浸漬一夜，將皮去除。然后，將去除皮的大豆浸漬在1.0重量％乳酸水溶液中，蒸煮30分鐘。接著，在蒸煮后的大豆中添加20g淀粉進(jìn)行混合，接種鐮刀菌sp.BLB林的前培養(yǎng)液3ml，在28"C培養(yǎng)48小時(shí)，制造大豆發(fā)酵食品(根霉)。明確了如此得到的大豆發(fā)酵食品(根霉)，與使用以往的根霉菌(Rhizopus)制成的根霉相比，釀造出不同的風(fēng)味，是具有新的喜好性的大豆發(fā)酵食品。此外，將上述得到的大豆發(fā)酵食品lg添加到4ml的生理鹽水中，在28t:攪拌3小時(shí)后，通過離心分離回收上清。根據(jù)上述纖維蛋白平板法測定所得上清的蛋白酶活性。此外，為了比較，使用以往的根霉菌(Rhizopus)來代替鐮刀菌sp.BLB林，用與上述相同的方法制作大豆發(fā)酵食品(根霉)，同樣地測定蛋白酶活性。其結(jié)果，使用鐮刀菌sp.BLB抹制成的大豆發(fā)酵食品時(shí)，其溶解面積為150mm2,與此相對，使用以往的才艮霉菌制成的才艮霉為70mm2。由以上結(jié)果可確認(rèn)，通過使用鐮刀菌sp.BLB林制造大豆發(fā)酵食品(根霉)，與使用以往的根霉菌的情況相比，可以提供血栓溶解性高的發(fā)酵食品。此外，上述得到的大豆發(fā)酵食品通過使用小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了安全性。權(quán)利要求1、一種蛋白酶，具有下述性質(zhì)(1)作用/基質(zhì)特異性具有對纖維蛋白的分解活性，此外，具有對作為合成基質(zhì)的H-D-Ile-Pro-Arg-pNA、H-D-Val-Leu-Lys-pNA及Bz-L-Arg-pNA的分解活性；(2)作用pH及最佳pH:至少在pH6.5~11.5發(fā)揮作用，最佳pH為約8.5~9.5;(3)pH穩(wěn)定性在4"C、20小時(shí)的處理?xiàng)l件下，至少在pH2.5-11.5的范圍是穩(wěn)定的；(4)作用溫度及最佳溫度至少在30501C發(fā)揮作用，最佳溫度為約45~50"C;(5)溫度穩(wěn)定性在pH5、10分鐘的處理?xiàng)l件下，至少到約55"C為止是穩(wěn)定的；(6)分子量利用SDS-PAGE進(jìn)行的推定分子量為約27000;(7)抑制特性不被0.01mg/ml的SBTI抑制，而被lmM的PMSF和O.lmM的DFP抑制。2、如權(quán)利要求l所述的蛋白酶，源自屬于鐮刀菌屬的微生物。3、一種蛋白質(zhì)，是以下(a)、(b)或(c)的任意一種蛋白質(zhì)(a)蛋白質(zhì)，由序列號l表示的氨基酸序列構(gòu)成；(b)蛋白質(zhì)，由在序列號l表示的氨基酸序列中，有1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成，且是具有權(quán)利要求1的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。4、一種基因，編碼權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。5、一種基因，由以下(i)或(ii)的DNA構(gòu)成(i)DNA，由序列號2表示的堿基序列構(gòu)成；(ii)DNA，在嚴(yán)格務(wù)降下與由序列號2表示的g序列構(gòu)成的DNA和由與其相互補(bǔ)的g序列構(gòu)成的DNA雜交，且編碼作為具有權(quán)利要求1的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶的蛋白質(zhì)。6、一種基因，編碼以下(a)、(b)或(c)的任意一種蛋白質(zhì)(a)蛋白質(zhì)，由序列號l表示的氨基酸序列構(gòu)成；(b)蛋白質(zhì)，由在序列號1表示的氨基酸序列中，有1個(gè)或2個(gè)以上的氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列構(gòu)成，且是具有權(quán)利要求l的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。(c)蛋白質(zhì)，與序列號1表示的氨基酸序列具有80%以上的同源性，且是具有權(quán)利要求l的(1)和(7)欄中所述特性的蛋白酶。7、一種重組載體，含有權(quán)利要求4~6中任一項(xiàng)所述的基因。8、一種轉(zhuǎn)化體，含有權(quán)利要求7所述的重組載體。9、一種蛋白酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求8所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，并從培養(yǎng)物中回收蛋白酶。10、一種蛋白酶生產(chǎn)菌，屬于鐮刀菌屬，生產(chǎn)權(quán)利要求l所述的蛋白酶。11、如權(quán)利要求10所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，其特征在于，(iii)具有由序列號3表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的ITS-5.8SrDNA，或者(iv)具有由序列號4表示的堿基序列或與其有98%以上同源性的堿基序列構(gòu)成的28SrDNA。12、如權(quán)利要求10所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，為鐮刀菌sp.BLB(FERMBP-10493)。13、一種蛋白酶的制造方法，其特征在于，培養(yǎng)權(quán)利要求10~12中任一項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌，并從培養(yǎng)物中回收蛋白酶。14、一種血栓溶解劑，含有權(quán)利要求1所述的蛋白酶或權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。15、一種血栓癥的治療或預(yù)防方法，包括如下工序?qū)ρòY患者或者有必要預(yù)防血栓癥的人，以治療或預(yù)防血栓癥的有效量給予權(quán)利要求1所述的蛋白酶或權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。16、權(quán)利要求1所述的蛋白酶或權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)的用于制造血栓溶解劑的使用。17、一種食品，含有權(quán)利要求1所述的蛋白酶或權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)。18、一種發(fā)酵食品，將權(quán)利要求10~12中任一項(xiàng)所述的蛋白酶生產(chǎn)菌接種于食品原料并使其發(fā)酵。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的、具有優(yōu)異的血栓溶解作用的蛋白酶，生產(chǎn)該蛋白酶的蛋白酶生產(chǎn)菌以及該蛋白酶的制造方法。通過培養(yǎng)屬于鐮刀菌屬的新型絲狀菌(鐮刀菌sp.BLB株)，在培養(yǎng)物中生成蓄積從酸性到堿性區(qū)域的寬pH范圍內(nèi)是穩(wěn)定的、具有優(yōu)異的血栓溶解作用的蛋白酶，并將其回收。文檔編號C12N9/58GK101146908SQ20068000914公開日2008年3月19日申請日期2006年3月22日優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日發(fā)明者中村拓壬申請人:素出藥株式會社