專利名稱：：由匙葉紫菀地上部分制備預防和治療高脂血和肥胖的提取物的方法及含有該提取物的組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及由匙葉紫菀UW^^W/m/^//^)地上部分的提取物制備用于預防和治療高脂血癥和肥胖癥的提取物的方法以及含有所制備的提取物的組合物。由于匙葉紫菀地上部分的提取物在預防高血脂癥和肥胖癥方面有效，其可用于組合物或功能性食物中，以用于預防諸如動脈硬化、心血管疾病、腦血栓形成、肝病、血栓形成和高血脂癥的疾病，或幫助治療這些疾病。
背景技術：
：當能量攝取超過能量消耗時便發(fā)生肥胖癥，導致過多卡路里的能量在脂肪組織中積累以及長期的代謝失衡。肥胖癥對于諸如高血脂癥、高血壓、關節(jié)炎、膽石病、糖尿病、心肌梗塞、乳腺癌和脂肪肝等成人疾病是一種危險因素。在韓國，脂肪形式的卡路里攝取已經(jīng)從1970年的7.3%升至1995年的18.8%，并預計在2005年將達到25%。隨著脂肪攝取的增加，多種慢性病已增加，例如肥胖癥、中風、動脈硬化、高血壓和糖尿病等。尤其是心血管疾病有了顯著增加。韓國國家統(tǒng)計局公布的2001年數(shù)據(jù)顯示，死亡的主要原因是癌癥、腦血管疾病、心臟病、糖尿病和肝病。尤其是，諸如心血管疾病、腦血管疾病、動脈硬化和血栓形成等循環(huán)系統(tǒng)疾病逐漸成為死亡的主要原因?？紤]到42%的死于循環(huán)系統(tǒng)疾病的人超重，肥胖癥似乎與成人疾病密切相關。卡路里和脂肪的攝取增加似乎能升高血液膽固醇水平，導致動脈中斑塊沉積(plaqueaccumulation)的加速以及心血管疾病爆發(fā)的增加。因此對能降低血脂水平的藥物和天然食物進行了大量研究。隨著具有生理活性的功能性食物引起關注，積極進行旨在發(fā)現(xiàn)有效預防肥胖癥的植物材料的研究。匙葉紫菀是沿海岸生長的多年生草本植物。其屬于菊科，桔梗目，雙子葉植物。其莖相當程度的木質(zhì)化，并具有很多分枝。其傾斜地生長至30-60厘米。該植物的葉子厚，呈倒卵形，且為互生葉序。在莖的較低部位，長出許多葉子。葉子看上去是白色的，在其兩面濃密地布滿絨毛。葉邊緣是光滑的或葉端微凹，看起來像匙形物(spatula)。從七月到十一月在分枝的頂部開出淺紫色的花?？偘拾肭蛐?，皮孔為毛狀并排列為三行。果實在十一月份成熟，冠毛為淺褐色并具有刺毛。對匙葉紫菀的藥效沒有進行科學研究，但該植物的嫩葉已經(jīng)用作食物，整株己經(jīng)用于民間療法，例如治療糖尿病、膀胱炎等。由于該植物有能度過冬天的持久力以及木質(zhì)化的特點，其也被種植在花盆中作為矮化樹(DoosanWorldEncyclopediaEnCyber)。匙葉紫菀整株的萜烯糖苷(terpeneglycoside)包括半日花垸型-7，14-二烯-13(11)-醇-4-0-乙酰基-01丄-6-脫氧艾杜吡喃糖苷(deocyidopyranoside)和半日花烷型-7,14-二烯-13(R)-醇—a-L-6-脫氧艾杜吡喃糖苷和花的一些色素已經(jīng)被鑒定。但是，對匙葉紫菀的成分還幾乎沒有研究。
發(fā)明內(nèi)容技術問題本發(fā)明的發(fā)明人注意到這一事實，即匙葉紫菀的地上部分(和整株)作為民間療法被用于治療糖尿病。在分離匙葉紫菀的成分的過程中，他們確認了匙葉紫菀提取物可以有效預防和治療高脂食物誘導的肥胖大鼠的高血脂癥和肥胖癥。本發(fā)明的一個目的是提供一種制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，并提供了用于預防和治療心血管疾病和高血脂癥的組合物和功能性食物，其中所述的提取物在預防和治療高血脂癥和肥胖癥方面有效，所述的組合物和功能性食物包括作為活性成分的匙葉紫菀地上部分提取物。技術方案本發(fā)明提供了制備匙葉紫菀地上部分提取物(匙葉紫菀地上部分提取物，EASA或者AE-B)的方法，其包括如下步驟在室溫下用水洗滌匙葉紫菀地上部分的干燥粉末并干燥；將匙葉紫菀地上部分的粉末溶解與溶劑中獲得提取物。本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，該組合物包括從匙葉紫菀地上部分提取的萜烯化合物。本發(fā)明還提供了一種用于預防和治療高血脂癥、肥胖癥和心血管疾病的功能性健康食物，其包括用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，以及營養(yǎng)學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明還提供了匙葉紫菀地上部分提取物的用途，所述提取物包括用于預防和治療高血脂癥、肥胖癥和心血管疾病的萜烯化合物。根據(jù)分析，匙葉紫菀地上部分提取物含有至少80%的萜烯化合物，所述化合物包括大根香葉酮(germacron)、(x-菠菜甾醇和其糖苷、ct-和卩-香樹素(amyrin)、以及半日花烷-二烯醇(labdadienol)。包含這類萜烯化合物的匙葉紫菀地上部分提取物被證實在預防和治療高血脂癥和肥胖癥方面是有效的。因此，匙葉紫菀地上部分提取物能用作有助于預防和治療與高血脂癥和肥胖癥相關的動脈硬化、心血管疾病、腦血栓形成、肝病、血栓形成、糖尿病等的功能性食物。以下更詳細介紹制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法、用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物及其用途。本發(fā)明的制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法包括如下步驟在室溫下用水洗滌匙葉紫菀地上部分的干粉末并干燥；將匙葉紫菀地上部分的粉末溶解于溶劑中獲得提取物。更具體地說，在第一步中的洗滌可通過如下方式進行通過回流、超聲、滲濾等方式用水在室溫10(TC的溫度范圍，優(yōu)選在室溫下洗滌在室溫下干燥的匙葉紫菀地上部分粉末約5到20次，優(yōu)選10到15次，洗滌時間約為1至12小時，優(yōu)選2至3小時。尤其是，優(yōu)選用回流的方式洗滌，且洗滌過程重復1至5次，優(yōu)選2至4次。并且，第二步中所用的溶劑可以是如下的溶劑5-20重量份的醇、水和醇的混合溶劑(水/醇的體積比約為3/7至1/20)或n-己烷與醇的混合溶劑(n-己垸/醇約為1/1)，上述溶劑均是相對于100重量份的在第一步中洗滌和干燥的匙葉紫菀地上部分粉末。優(yōu)選地，醇為90%的乙醇。在第二步中，匙葉紫菀地上部分提取物通過如下方式獲得在室溫100。C下，優(yōu)選85100。C下使用溶劑通過回流冷卻l-12小時，優(yōu)選2-5小時，或通過滲濾l-7天。優(yōu)選地，提取步驟重復l-5次，優(yōu)選3-4次。第二步之后，優(yōu)選對提取物進行處理(第三步)，所述處理包括過濾、減壓下濃縮以及干燥，以獲得純化品。那些對預防或治療高血脂癥和肥胖癥無效的物質(zhì)，包括咖啡?；鼘幩?caffeoylquinicacid)及其衍生物、單寧和鹽等在第二步和第三步中大部分被去除。第二步中獲得的提取物可被用作預防和治療高血脂癥和肥胖癥的活性成分。所獲得的提取物具有如下特征，即預防和治療高血脂癥和肥胖癥有效成分的含量較高，而易于變質(zhì)的化合物的含量較低，這些成分作為鹽對預防和治療高血脂癥和肥胖癥無效且能引起不良反應。具體地，通過上述方法獲得匙葉紫菀產(chǎn)物在預防和治療高血脂癥和肥胖癥方面是有效的，這似乎是由于從匙葉紫菀分離出的萜烯化合物而導致。本文所述的萜烯化合物包括大根香葉酮(以下簡稱為AE-1)、a-菠菜甾醇l-O-P-D-吡喃型葡萄糖苷(以下簡稱為ABP)、(x-和P-菠菜甾醇、a-和P-香樹素、半日花垸型萜烯(例如半日花烷-7，14-二烯-13(R)-醇-P-巖藻吡喃糖苷(新化合物))等。萜烯化合物的量是匙葉紫菀提取物的80.0-99.6wt%。除了萜烯化合物，還可包括少于0.3%屬于咖啡?；鼘幩狨セ衔锏?,5-二咖啡?？鼘幩岷?，5-二咖啡?；鼘幩峒柞?。并且，包含少于0.1%的可引起不良反應的鹽。下面將要說明的是，匙葉紫菀地上部分提取物適于用作預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物的活性稱分。當含有至少一種從匙葉紫菀地上部分提取的萜烯化合物時，就能達到預防和治療高血脂癥和肥胖癥的效果，所述萜烯化合物選自大根香葉酮;(x-菠菜甾醇l和其糖苷;a-或p-香樹素；以及半日花烷-二烯醇糖苷。在本發(fā)明的另一實施方式中，本發(fā)明提供了用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的功能性健康食物，其包括通過前述方法獲得的、作為活性成分的匙葉紫菀地上部分提取物，以及營養(yǎng)學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或芳香劑。本發(fā)明制備的匙葉紫菀地上部分提取物被證實在改善高脂肪食物誘導的肥胖小鼠的高血脂癥和肥胖癥方面是有效的。這意味著匙葉紫菀地上部分提取物可用作功能性食物，以預防和治療諸如高血脂癥、高血壓、關節(jié)炎、膽石癥、糖尿病、心肌梗塞、脂肪肝等的成人疾病，上述疾病是由過量卡路里在脂肪組織中積累造成的長期代謝失衡而導致的。并且，由于匙葉紫菀地上部分提取物無毒性和副作用，其可長期地安全用于預防目的。在本發(fā)明的用于改善肥胖癥和高血脂癥的功能性食物中，匙葉紫菀地上部分提取物的含量優(yōu)選為組合物總重量的0.1-60Wt。/。。如果匙葉紫菀地上部分提取物的含量更低，則改善高血脂癥和肥胖癥的效果不充分。相反，如果含量更高，則會面臨可溶性的問題。另外，改善高血脂癥和肥胖癥的效果并不能通過所述提取物的進一步增加而得到顯著提升?？捎糜诒景l(fā)明的功能性食物中的載體、賦形劑或稀釋劑為乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藻糖醇、麥芽糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、無定形纖維素、聚乙烯吡咯酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石和硬脂酸鎂。功能性食物可通過常規(guī)方法制備成口服劑型，包括散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、混懸劑、乳劑和糖漿等，優(yōu)選為片劑。稀釋劑或賦形劑，諸如填充劑、擴張劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等可加至制劑中。用于口服的固體制劑包括片劑、丸劑、散劑、顆粒、膠囊等，除了包含匙葉紫菀地上部分提取物之外，其可包含至少一種賦形劑，例如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖、明膠等。除了加入簡單的賦形劑之外，可加入諸如硬脂酸鎂和滑石的潤滑劑。用于口服的液體制劑包括混懸劑、內(nèi)科藥物(internalmedicine)、乳劑、糖漿等，該制劑可包含各種賦形劑，例如濕潤劑、增甜劑、芳香劑、防腐劑等作為簡單稀釋劑。非口服的制劑包括消毒的水溶液、非水溶液、混懸劑、乳劑、凍干制劑和栓劑。雖然施用劑量隨著服藥者的年齡、性別和體重而有所變化，但本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物的一般劑量為0.01-500mg/kg/天，優(yōu)選為0.1-100mg/kg/天。可以一次施用和分成幾個部分進行施用。當然，匙葉紫菀地上部分提取物的施用劑量可隨著施用途徑、疾病的嚴重程度、性別、體重、年齡等而提高和降低。因此，前述的施用劑量對本發(fā)明的任何方面都不構成限制。可將本發(fā)明的功能性食物施用至哺乳動物，包括小鼠、大鼠、家畜和人。由于本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物無毒性和副作用，其可長期地、安全地用于預防目的。有益效果本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物被證實在預防和治療飼喂高脂肪食物小鼠的高血脂癥和肥胖癥方面有功效。其顯著地降低身體脂肪量、高血脂癥和肝脂肪水平、總膽固醇、游離脂肪酸、血清痩素水平、胰島素等，并促使PPARY和UCP基因的mRNA表達。用于制備本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物的方法簡單且節(jié)省成本。萜烯或活性成分的含量可顯著升高，這是因為除去了多數(shù)大量包含在匙葉紫菀地上部分提取物的鹽、不穩(wěn)定的且易氧化的酚類物質(zhì)、和粘液物質(zhì)。本發(fā)明的包含作為活性成分的匙葉紫菀地上部分提取物的組合物可用于功能性食物中，有助于預防和治療與高血脂癥和肥胖癥相關的心血管疾病、動脈硬化、腦血栓形成、肝病、血栓形成、糖尿病等。圖1說明從匙葉紫菀地上部分提取物中分離活性成分的方法。圖2顯示測試實施例4中獲得的白脂肪細胞(whiteadiposities)。圖3顯示測試實施例4的腹部脂肪和內(nèi)臟脂肪的磁共振圖像(MRI)。圖4顯示測試實施例4的總血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、HDL-膽固醇(HDL-C)水平和HDL-C/TC比率。圖5顯示測試實施例5的腹部脂肪和內(nèi)臟脂肪的磁共振圖像(MRI)。圖6顯示測試實施例5的肝UCP2mRNA的表達水平。圖7顯示測試實施例5的肝PPARYmRNA的表達水平。本發(fā)明的最佳實施方式實施例l匙葉紫菀提取物的制備洗滌匙葉紫菀的地上部分將匙葉紫菀(于十月份至十二月份在韓國的Jeju島采集)干燥、粉末化，并在通過a#4濾網(wǎng)過濾后使用。將10kg的干粉末懸浮于100L水中，搖動并過濾所得混懸液，然后將其用于制備本發(fā)明的提取物。重復洗滌步驟兩次，直至濾液中的氯化物濃度小于10ppm。匙葉紫菀地上部分提取物的制備將上述洗滌過的匙葉紫菀粉末懸浮于100L含水乙醇(H20/乙醇=1:10)，在85-100。C下加熱2-5小時，并用濾紙進行過濾。上述提取步驟進行兩次以上，然后用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在40。C下濃縮合并的濾液，從而獲得503g匙葉紫菀地上部分提取物(EASA)。實施例2劑型的制備散劑的制備將20mg實施例1中獲得的匙葉紫菀地上部分干粉末與100mg乳糖和10mg滑石混合。將所得混合物裝入密封袋中，以獲得散劑。片劑的制備將20mg實施例1中獲得的匙葉紫菀地上部分干粉末與100mg玉米淀粉、10mg乳糖和2mg硬脂酸鎂相混合。通過常規(guī)方法將所得混合物制成片劑。膠囊的制備將20mg實施例1中獲得的匙葉紫菀地上部分干粉末與100mg玉米淀粉、100mg乳糖和2mg硬脂酸鎂相混合。通過常規(guī)的方法將所得混合物裝至明膠膠囊中，從而制得膠囊。溶液的制備將20mgof山梨糖醇，10mgCMC和少許檸檬香料加至200mg實施例1中獲得的匙葉紫菀地上部分干粉末中。然后，加入純水至總體積為1000mL。將所得溶液裝至棕色瓶中，并進行消毒，從而獲得溶液制劑。測試實施例1從匙葉紫菀提取物中分離化合物收集實施例1中第一次過濾時的濾液IOL。通過旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀在60°C下將所收集的濾液濃縮至0.5L，并最終凍干獲得棕色粉末形式的95g匙葉紫菀地上部分提取物(EASA)。將如此獲得的粉末填滿(choked)在IL的甲醇中并過濾。過濾該混合物，并蒸干濾液，從而獲得17g粉末。干燥濾餅(不溶性物質(zhì))得到76g由氯化鈉和粘液物質(zhì)組成的物質(zhì)。通過硅膠柱層析(使用混合溶劑氯仿/甲醇/H205:1:0.1)純化可溶于甲醇的物質(zhì)(17g)，從而獲得0.98g4,5-二咖啡?；鼘幩峒柞ズ?.06g4,5-二咖啡?？鼘幩??；衔?(4,5-二咖啡酰基奎寧酸甲酯)EI-MSm/z:530(C26H26O12);[a]25D=-213;IR(KBr)D腿(cm國1):3368,1701;^-NMR(CDCl3):2.08(1H，dd,J=13.8,6.6Hz,2-CH2e)，2.32(1H,dd,J=13.8,3.6Hz,2-CH2a)，4.34(1H，ddd,J=6.6,3.6,3.3Hz,3-CH),5.01(1H，dd,J=8.1,3.3Hz,4-CH),5.53(1H,dt，J=8.1,5.4Hz,5-CH),2.182.32(2H,m,6-CH2),3.71(3H,s,7-OCH3),7.02(1H,d,J=2.1Hz,2'-CH),7.00(1H,d,J=2.1Hz,2"畫CH)，6.75(2H,d,J=8.4Hz,5'-,5"-CH)，6.92(1H,dd,J=8.4，2.1Hz,6'-CH),6.91(1H，dd，J=8.4,2.1Hz,6"-CH),7.60(1H,d.J=15.9Hz,7'畫CH),7.50(1H,d，J=15.9Hz,7"-CH),6.29(1H，d,J=15.9Hz，8'-CH),6.16(1H,d,J=15.9Hz,8"-CH).化合物2(4,5-0-二咖啡?？鼘幩?EI國MSm/z:516(C25H24012);mp192-194°C;[a]25D=-170;IR(KBr)D醒(cm"):3400,1700,1610，1530,1290，990,820;!H-NMR(CDC13):2.10(1H,dd,J=14.4,4.2Hz，2-CH2e),2.29(1H,dd,J=14.4，3.0Hz,2-CH2a),4.36(1H,ddd,J=4.2，3.3,3.0Hz,3-CH)，5.11(1H,dd，J=9,0,3.3Hz，4國CH),5.61(1H,dt,J=9.0,5.1Hz.5-CH),2.182.23(2H,m,6-CH2),7.02(1H,d,J=2.1Hz,2'國CH),7.00(1H,d,J=2.1Hz,2"國CH),6.73(1H，d,J=8.4Hz，5'國CH),6.74(1H,d,J=8.4Hz，5"-CH),6"0(1H,d，J=8.4,2.1Hz,6'-CH),6.91(1H,dd,J=8.4,2.1Hz,6'畫CH),6.91(1H,dd,J=8.4,2.1Hz,6"隱CH),7.59(1H,d，J=15.9Hz,7'-CH)，7,51(1H,d,J=15.9Hz，7"-CH),6'28(1H,d,J=15.9Hz,8'畫CH)，6.18(1H，d，J=15.9Hz,8"-CH).測試實施例2從匙葉紫菀地上部分提取物中分離活性成分將匙葉紫菀地上部分提取物懸浮于氯仿中，并在室溫下過夜。過濾該混懸液，并且用小部分氯仿將不溶于氯仿的部分過濾3次，并干燥以獲得不溶性組分(ABP)和可溶性組分(AE-C)。濃縮合并的濾液并對其進行重復的硅膠柱層析(裝有200g硅膠)，并使用氯仿作為洗脫液，依次獲得AE-l(1.8g)、AE-2(20mg),AE-3(200mg)、AE-4(10mg)和AE-5(350mg)(圖1)。用混合溶劑(氯仿/甲醇=50:1)沖洗該柱，然后將沖洗液濃縮，得到純的ABP(1.25g)。2-l.ABP的化學結構((x-菠菜甾醇3-0-P-D-卩比喃型葡萄糖苷)Mp:292-294°C;EI畫MSm/z:574(]^國(:35115806),395(M^C6Hu06);IR(KBr)D腿(cm"):3389,1074,1032，970,829;^-NMR(CDCl3+CD30D)5:0.57(3H,s,18-CH3),0.71(3H,s,19-CH3)，0.84(3H,d，J=6.3Hz,29-CH3),0.88(3H,d,J=7.2Hz,26-CH3),0.89(3H,d，J=6.6Hz),L06(3H,d，J=6.6Hz,21-CH3),5.02(1H,d,J=7.5Hz,異頭H).2-2.AE-l(大根香葉酮)Mp:51-52°C;[a]25D-24(c=l,甲醇)；EI-MSm/z:218(M+,C15H120);IR(KBr)Dmax(cm-1):1672，1443,1385,1289,1178,1134,858,812;UV(MeOH)Wnax腿(logs):217.5(4.03);'H-麗R(CDCl3)S:4.97(1H,dd,J=10.5,10Hz,2-CH)，2.35(1H,m，3-CH2)，2.08(1H,m,3-CH2),2.10(2H,m,4-CH2),4.70(1H,ddd,J=10.5,3.0，1.0Hz,6畫CH)，2.卯(2H,m,7-CH2),2.95(1H,d,10-CH2O)，3.40(1H,d,J=10.5Hz，10-CH2O),1.76(3H,s,12-CH3),L71(3H,s,13-CH3),1.61(3H,t-like,14-CH3),L42(3H,t-like，15-CH3).2-3.AE-2的化學結構(a/(3-香樹素)Mp:168°C;[a]20D,8.8(c=0.2,甲醇)；EI-MSm/z:426(M+，C30H50O);IR(KBr)D麗(cm"):3293,1650,1385,1359,1036;^畫畫R(CDC13)5:3.20(2H,m,3-CH),5.13(1H，t,J=3.3Hz,a畫香樹素12-CH),5.18(1H,t,J=3.6Hz,卩畫香樹素12-CH).2-4.AE-3的化學結構(ot-菠菜甾醇)Mp:169-170°C;[a]20D,15.2(c=l,甲醇)；EI-MSm/z:412(M+,C29H480);IR(KBr)D麗(cm"):3418，1664,1041,970;1H-NMR(CDC13)S:0.54(3H,s，18-CH3),0.79(3H,s,19-CH3),L02(3H，d,J=6.9Hz,21-CH3),0.81(3H，d，J=7.2Hz,26-CH3),0.84(3H,d,J=6.3Hz,27-CH3),0.80(3H，t,J=6.8Hz,29-CH3).2-5.AE-4的化學結構(半日花垸-7,14-二烯-13(R)-醇-l3-L-脫氧艾杜吡喃糖苷)油狀；[a]20D，-61.0(c=l,甲醇)；EI-MSm/z:436(M+,C26H4405);!H-雇R(CD30D)S:4.79(1H,d,J=3.6Hz,l'-CH),3.35(1H，dd,J=6.0,3.6Hz,2'-CH),3.66(1H，J=6.0Hz,3'-CH),3.46(1H，dd,J=6.0,3.6Hz,4'國CH),4.23(1H,dq，J=6.9,3.6Hz，5'國CH),l.即H,d,J=6.9Hz,6'-CH3).2-6.AE-5的化學結構(半日花垸-7,14-二烯-13(R)-醇-卩-L-巖藻吡喃糖苷),新化合物。[a]25D,8(c=0.1，甲醇)；EI畫MSm/z:436(M^C26H4405);iH-NMR(CD30D)S:0.75(3H,s，20-CH3),0.85(3H,s,18-CH3),0.88(3H,s,19-CH3)1.21(3H，d,J=6.6Hz,6'-CH3),L32(3H,s,16-CH3),1.66(3H,s,17-CH3)，3.42(1H,d,J=3.3Hz.2'-CH),3.43(1H,d，J=1.8Hz,3'-CH),3.50(1H,dq,J=1.2,6.6Hz,5'-CH),3.56(1H,dt，J=1.8,1.2Hz,4'-CH),4.23(1H，d，J=7.8Hz，l'-CH),5.16(1H,dd,J=10.8，1.2Hz,15-CH2),5.17(1H,dd，J=17.7,1.2Hz,15-CH2),5.35(1H，m,7-CH),6.04(1H,dd,J=10.8,1.2Hz,14-CH);13C-NMR(CD3OD)S:39.1(1-CH2),18.5(2-CH2)，42.1(3-CH2),32.7(4國C),50.3(5誦CH)，23.5(6-CH2),121.6(7-CH),135.3(8國C),55.5(9國CH)，37.2(10-C),21.2(11-CH2),43.5(12-CH2)，80.4(13-C)，143.0(14-CH),113.5(15-CH2)，21.7(16-CH3),21.4(17-CH3),32.4(18-CH3),20.9(19-CH3)，12.7(20-CH3),98.1(1'-CH),71.0(2'畫CH),73.9(3'-CH)，71.5(4'-CH),70.2(5'國CH),15.5(6'-CH3).測試實施例3:匙葉紫菀地上部分提取物中的萜烯的定量準確稱取30mg實施例1中得到的匙葉紫菀地上部分提取物(AE-B;樣品)和30mga-菠菜甾醇吡喃型葡萄糖苷(ABP;標準)，將其分別溶于40mL二甲基亞砜(DMSO)中。然后，加入40Q/。(v/v)乙醇至總體積為lOOmL，從而獲得樣品溶液和標準溶液。將80mg香草醛溶于10mL乙醇，并制備72%(w/w)的硫酸溶液?？傒葡┖繌臉悠啡芤汉蜆藴嗜芤褐芯鶞蚀_地取lmL并置入大試管中(直徑15mmx長度180mm)。加入0.4mL0.8%的香草醛-乙醇溶液，并且將5mL在冰水浴中冷卻的72%硫酸溶液緩慢地加入試管中。然后劇烈搖動試管。所得混合物溶液在60。C下加熱60分鐘，然后冷卻至室溫，并在540nm下測量光吸收值。樣品中萜烯的含量是通過(x-菠菜甾醇吡喃型葡萄糖苷標準溶液的標準曲線而確定的。下述制備的溶液作為空白溶液將0.4mL0.8%香草醛-乙醇溶液加至lmL樣品溶液中，緩慢地將在冰水浴中冷卻的5mL72%硫酸溶液加至試管中，劇烈搖動試管?？傒葡┖客ㄟ^下述公式計算。公式l:總萜烯含量(％)=(樣品溶液的吸光值-空白溶液的吸光值)/(標準溶液的吸光值)x100分析結果顯示，實施例1中制備的匙葉紫菀地上部分提取物含有少于0.1%的鹽(其原來在匙葉紫菀中的含量豐富)、少于0.3%的4，5-二咖啡酰基奎寧酸酯(4,5-dicaffeoylquinate)(其是酚類物質(zhì)，對預防和治療高血脂癥和肥胖癥沒有效果)及其甲酯，以及幾乎不存在的粘液物質(zhì)。萜烯化合物或活性成分(包括大根香葉酮、a-和卩-香樹素、a-菠菜甾醇及其糖苷、半日花烷二烯醇等)的總含量至少為80.0%。實驗4動物、飲食、體重變化和食物效能比從Samtaco(首爾，韓國)購得6周齡的、體重為170180gSprague-Dawley雄性小鼠。當給予所述動物標準實驗室食物1周后，將他們分為兩組，用兩種食物詞喂每一組，其中一種食物為標準食物(ND，n=10)，另一種為高脂食物(HFD,n=50)。6周后，HFD組被分為5小組。對他們進行口服施用匙葉紫菀地上部分提取物，每天一次，持續(xù)6周。HFD組高脂食物+0.5%羧甲基纖維素HFD+AE-B組高脂食物+AE-B125mg/kgHFD+AE-C組高脂食物+AE-C100mg/kgHFD+AE-1組高脂食物+AE-l10mg/kgHFD+ABP組高脂食物+ABP1.5mg/kg實驗食物包含普通脂肪(11.7%的脂肪卡路里，AIN-76Adiet#100000,DyetsInc.,Bethelhem,PA,USA)或包含高脂肪(40。/。的脂肪卡路里，AIN-76Ahighfatdiet#100496,DyetsInc.,Bethelhem,PA,USA)(表1)。在實驗期間，每周兩次測定食物的攝取和體重。食物功效比通過下述方式計算，即，用該期間的體重增加量除以食物攝取量。結果如表2所述。表1實驗食物的組成(g/kg食物)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2.飼喂高脂食物的小鼠中，匙葉紫菀地上部分提取物對體重、食物攝取和食物功效比(FER)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>六周后，ND和HFD-C組的體重分別為422.40士15.32g和458.40士19.32g。而且，與HFD-C相比，ND組的體重顯著下降。12周后，與HFD-C組相比，EASA組的體重顯著下降。在表2中，字母(多個字母)不同的上標表明組間的通過鄧肯多重范圍檢驗的顯著性差異(p<0.05)。白脂肪細胞和脂肪組織重量的光學顯微變化圖2顯示白脂肪細胞組織的組織學形態(tài)和大小。A是ND組，B是HFD-C組，C是HFD+AE-B組，D是HFD+AE-C組，E是HFD+AE-1組，F(xiàn)是HFD+ABP組。ND組中的脂肪細胞的大小顯著小于HFD組的脂肪細胞。當飼喂小鼠EASA時，脂肪細胞的大小與HDF-C的相比大大減小。12周后，小鼠用乙醚麻醉并在禁食14小時后處死。從肝靜脈中采集血液樣本并離心(在4。C和3,000rpm下離心IO分鐘)。血清在-70。C下冷凍，以用于生化分析。立即稱量附睪及腹部脂肪墊的重量，并用顯微鏡測量脂肪細胞的大小。脂肪細胞的重量如表3所示。HFD-C組中附睪及腹部脂肪的重量的增加高于ND和EASA組(表3)。ND組和HFD+EASA-C組的附睪脂肪重量不存在差異。EASA顯著降低了脂肪細胞大小和脂肪組織重量。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>用MRI測定身體脂肪12周后，用戊巴比妥鈉麻醉小鼠(30mg/kg，i.p.)。在處死的前一天使用MRI(磁共振成像系統(tǒng))觀察小鼠腹部脂肪的分布(圖3)。通過MRI，可以觀察到HFD小鼠內(nèi)臟和皮下脂肪的沉積，然而在ND小鼠的腹部有很少的脂肪。EASA治療降低了腹部內(nèi)脂肪的積聚。血清脂質(zhì)和肝脂質(zhì)的濃度使用運用商業(yè)試劑盒(AsanDiagnostics,Seoul,Korea)的比色法測定血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)和HDL-膽固醇(HDL-C)水平。TG或HDL-C水平不存在顯著差異，盡管EASA治療組傾向于低于HFD-C組(圖4)。與ND組相比，HFD-C組的血清TC顯著升高144.1%，并且由于EASA治療而顯著降低(P<0.05)。HFD-C組顯著降低了血清HDL-C/TC水平。通過Folch等人設計的方法提取肝脂質(zhì)，并用與血清分析相同的技術檢測其含量。取決于匙葉紫菀提取物的肝脂質(zhì)含量在表4中給出。與正常食物組相比，高脂肪食物組呈現(xiàn)出兩倍的肝甘油三酯(TG)水平。但是，施用匙葉紫菀的組呈現(xiàn)出顯著的下降。膽固醇被觀察到具有類似的趨勢。肝游離脂肪酸(FFA)水平不存在顯著差異。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>血清痩素、胰島素和葡萄糖的濃度分另U通過使用Linco痩素分析試齊U盒(LincoresearchImmunoassay,St.Louis:MO)的RIA和胰島素標準物(LincoresearchImmunoassay,St.Louis,MO)來測量血清瘦素和胰島素(圖5)。表5.匙葉紫菀地上部分提取物對飼喂高脂肪食物小鼠的血清痩素、胰島素和葡萄糖水平的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>瘦素在脂肪組織中產(chǎn)生后，其被分泌到血液中，并通過痩素受體而被轉(zhuǎn)運至腦部，從而控制食物攝取，食欲和能量平衡，以降低體重。高脂肪食物增加小鼠中的血液瘦素，這表現(xiàn)為身體脂肪增加。痩素水平也與身體脂肪量和脂肪細胞的大小相關。在本發(fā)明的研究中，HFD組中痩素的血清水平是ND組的兩倍高，且EASA組與ND組相似。EASA組中血清葡萄糖水平低于HFD組。特別地，AE-C和AE-B組顯著低于HFD組。HFD組的胰島素水平是ND組的2.5倍，但與HFD組相比，EASA組顯著降低。胰島素水平與葡萄糖水平平行，并與痩素水平和身體脂肪量相關，據(jù)推測這是由肥胖癥造成的胰島素敏感性的變化以及血液葡萄糖水平的變化導致的。急性毒性-口服將ICR小鼠(重量為25士5g)和Sprague-Dawley雄性(230土10g)分成4組(n=10)。每天將IOO、500、1000和2000mg/kgp.o.匙葉紫菀地上部分提取物施用至大鼠，并持續(xù)14天。只給予對照小鼠1XCMC。通過胃注入給藥的形式將5、10、20、40、80和160倍的臨床劑量施用至小鼠，并觀察22小時。結果顯示，所有組中無小鼠死亡，體重變化和食物攝取也表現(xiàn)正常。實驗5動物、食物、體重變化和食物功效比從Samtaco(首爾，韓國)處購買體重為170180g的6周齡Sprague-Dawley雄性大鼠。所述動物被給予1周標準實驗室食物后被分成兩組。飼喂每組大鼠兩種食物標準食物組(ND，n=8)和高脂肪食物組(HFD,1^88)。6周過后，HFD再被分為11組(n=8)。通過口服的形式對它們詞喂匙葉紫菀地上部分提f，每天一之欠，持續(xù)6周。HFD組高脂肪食物AE-B250組:高脂肪食物+AE-B250mg/kgAE-B125組:高脂肪食物+AE-B125mg/kgAE-B62.5組:高脂肪食物+AE-B62.5mg/kgAE-C200組:高脂肪食物+AE-C200mg/kgAE畫C100組:高脂肪食物+AE-C100mg/kgAE-C50組高脂肪食物+AE-C50mg/kgAE-120組高脂肪食物+AE-l(大根香葉酮)20mg/kgAE-110組高脂肪食物+AE-l(大根香葉酮)10mg/kgAE-15組高脂肪食物+AE-l(大根香葉酮)5mg/kg陽性對照組高脂肪食物+西部曲明(Sibutramine，陽性對照)7.5mg/kg實驗食物如同實驗4中表1所示。食物攝取、體重變化和食物功效比顯示在表6中。表6.食物攝取、體重變化和食物功效比<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>12周后，HFD組的體重大于ND組。EASA治療組與HFD組比較而言體重減輕。HFD組的FER顯著高于EASA和ND組。EASA組與ND組間不存在顯著差異。脂肪細胞重量的變化脂肪細胞重量由實驗5中的方法所測定。脂肪細胞的重量顯示在表7中。與HFD組比較而言，EASA治療組以劑量依賴的方式降低了白脂肪細胞表7<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>使用MRI測定身體脂肪附睪脂肪和腹部脂肪的重量顯示在表5中。與HFD組比較而言，EASA治療組降低了腹部脂肪的重量。表5中，A為ND組，B為HFD組，C為西部曲明(Sibutramine)組，D為AE-B250組，E為AE-C200組，F(xiàn)為AE-110組.肝脂質(zhì)和血清脂質(zhì)水平血清中TG、TC和HDL-C水平如表8所示。對于TG水平，HFD組和ND組具有相似的值。與HFD組比較而言，EASA治療組降低了TG水平。HFD組的TC顯著高于ND組。與HFD和ND組比較而言，EASA治療組降低了TC水平。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>血清中TG、TC和HDL-C水平顯示在表9中。與ED組比較而言，HFD組的TG和TC顯示出具有較高值的傾向。EASA治療組顯示了顯著降低的TC值。HFD中的FFA水平顯著高于EASA中的FFA水平。[表9]<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>痩素和胰島素的血清水平血清瘦素和胰島素的測定是通過與測試實施例4相同的方式進行的。結果如表10所示。痩素是脂肪細胞分泌的激素，其與身體的脂肪量成正比。瘦素和胰島素與能量體內(nèi)穩(wěn)態(tài)密切相關。痩素增加誘導高胰島素血癥，反過來，高胰島素血癥直接剌激脂肪細胞中瘦素mRNA。由于這個原因，盡管HFD組顯示了比正常組高得多的血清瘦素和胰島素水平，但是施用匙葉紫菀提取物的組顯示了比HFD組低的水平。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>白脂肪組織中UCP2和PPARy的表達對參與白脂肪組織中能量代謝調(diào)控的幾種蛋白的mRNA水平進行了分析。對白脂肪組織中PPARY和UCP2的基因表達進行了測量(圖6、圖7)。由于EASA大幅度地降低了白脂肪墊的量(whitepadmass)，因此有時難以獲得足夠量的RNA以測量基因表達。EASA對脂肪組織中PPARymRNA的功效通過定量RT-PCR評定。WATUCP2mRNA表達受高脂肪食物的影響，并且以劑量依賴的方式被EASA的施用誘導。PPARY主要在脂肪組織中表達，在結腸、免疫系統(tǒng)和視網(wǎng)膜中有較低程度的表達。UCP是線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運體，該質(zhì)子轉(zhuǎn)運體通過驅(qū)散跨膜質(zhì)子梯度而使氧化磷酸化解偶聯(lián)，該活性已被建議用于影響產(chǎn)熱以及肥胖癥的發(fā)生?？赡艿氖?，UCP的表達增加將會提高能量消耗，并有助于抑制身體脂肪的積累。高脂肪食物使WATPPARymRNA表達降低，而，施用EASA會使WATPPARymRNA表達增加。工業(yè)實用性已證實，本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物顯著降低體重、身體脂肪量、血清脂質(zhì)和肝脂質(zhì)水平、總膽固醇、游離脂肪酸水平、血清瘦素水平、胰島素等，并促進被給予高脂肪食物的大鼠中PPARy和UCP基因的mRNA的表達。因此，本發(fā)明的匙葉紫菀地上部分提取物可用于功能性食物，以幫助預防和治療高血脂癥、肥胖癥、心血管疾病、動脈硬化、腦血栓形成、肝病、血栓形成、糖尿病等。而且，由于很容易通過本發(fā)明的方法去除大多數(shù)原來富含在匙葉紫菀中的鹽、不穩(wěn)定且易于氧化的酚類物質(zhì)、以及粘液物質(zhì)，本發(fā)明可顯著地提高萜烯或活性成分的含量，并降低生產(chǎn)成本。權利要求1.一種制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，該方法包括如下步驟在室溫下用水洗滌匙葉紫菀地上部分的干粉末并干燥；將所得到的匙葉紫菀地上部分的粉末溶于醇、醇與水的混合溶劑、或n-己垸與醇的混合溶劑中，從而獲得提取物。2.根據(jù)權利要求1所述的制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，其中，第一步的洗滌是通過回流或超聲進行1-12小時，而且在第二步中，在85至100。C下，使用醇、醇與水的混合溶劑、或n-己烷與醇的混合溶劑，通過回流提取1-12小時或滲濾1-7天而獲得匙葉紫菀地上部分提取物。3.根據(jù)權利要求2所述的制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，其中，第一步的洗滌是通過如下方式進行的，即在20°C-100°C下通過回流、超聲或滲濾，用5-20重量份水洗滌100重量份在室溫下干燥的匙葉紫菀地上部分粉末，且重復洗滌1-5次。4.根據(jù)權利要求2所述的制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，其中，第二步中所用的溶劑如下5-20重量份的醇、水/醇的體積比為3/7至1/20的水與醇的混合溶劑、或n-己垸/醇體積比為1/0.5至1/1.5的n-己垸與醇的混合溶劑，上述溶劑均是相對于100重量份的匙葉紫菀地上部分粉末而言的。5.根據(jù)權利要求1-4任一項所述的制備匙葉紫菀地上部分提取物的方法，其進一步包括過濾第二步中獲得的提取物，在減壓下濃縮濾液并干燥的步驟。6.用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，該組合物包含匙葉紫菀地上部分提取物，其中匙葉紫菀地上部分提取物含有天然的萜烯化合物。7.根據(jù)權利要求6所述的用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，其中所述萜烯化合物選自由下列物質(zhì)組成的組中的至少一種大根香葉酮；a-菠菜甾醇及其糖苷;oi-或p-香樹素；和半日花垸-二烯醇糖苷。8.根據(jù)權利要求6所述的用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，其中，匙葉紫菀地上部分提取物通過如下方式獲得在室溫下用水洗滌匙葉紫菀地上部分的干粉末并干燥，并將其溶解于醇中，或溶解于醇和水的混合溶劑中，或溶解于n-己烷和醇的混合溶液中。9.根據(jù)權利要求6所述的用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，其中，匙葉紫菀地上部分提取物進一步包括少于匙葉紫菀地上部分提取物總重量的0.3wtc/。的咖啡?；鼘幩狨ァ?0.根據(jù)權利要求7所述的用于預防和治療高血脂癥和肥胖癥的組合物，其中，萜烯化合物的量為匙葉紫菀地上部分提取物的80wt。/。至99.6wt%。11.一種用于預防和治療肥胖癥、高血脂癥和心血管疾病的功能性健康食物，其包括匙葉紫菀地上部分提取物以及營養(yǎng)學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。12.根據(jù)權利要求11所述的功能性健康食物，其形式為散劑、顆粒劑、片劑、膠囊、混懸劑、乳劑或糖漿，且其包含總重量的0.1wt^-60wt^的匙葉紫菀地上部分提取物。全文摘要本發(fā)明涉及制備在預防和治療高脂血癥和肥胖癥方面有效的匙葉紫菀地上部分提取物的方法，以及含有該提取物的組合物。由于大多數(shù)原來富含在匙葉紫菀中的鹽、不穩(wěn)定且易于氧化的酚類物質(zhì)、以及粘液物質(zhì)很容易通過本發(fā)明的方法而去除，所以本發(fā)明可顯著地提高萜烯或活性成分的含量，并降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明的組合物可用于功能性食物中，以有助于預防和治療與高血脂癥和肥胖癥相關的動脈硬化、心血管疾病、腦血栓形成、肝病、血栓形成、糖尿病等。文檔編號A23L1/29GK101146458SQ200680008949公開日2008年3月19日申請日期2006年3月20日優(yōu)先權日2005年3月19日發(fā)明者丁世榮申請人:丁世榮