專利名稱：大毛霉液態(tài)發(fā)酵含果膠的廢渣制備果膠酶的制作方法
果膠酶是一種工業(yè)用酶制劑，它的主要性質(zhì)是降解果膠物質(zhì)。果膠酶這一性質(zhì)主要應(yīng)用于果汁加工和果酒釀造。此外，果膠酶用于桔子脫囊衣，麻料脫膠，木材防腐以及反芻動(dòng)物的飼料添加劑也有報(bào)道。
產(chǎn)果膠酶的菌種主要有兩類，即真菌和細(xì)菌。真菌主要有曲霉屬，青霉屬和鐮孢屬以及克魯維氏酵母等。目前國(guó)外仍多自黑曲霉，根霉和盾殼霉中提取此酶。本發(fā)明以大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630)為生產(chǎn)菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)果膠酶。該方法主要特點(diǎn)如下1.以麩皮為碳源；2.以無機(jī)氮作為氮源；3.以含果膠的廢渣作為誘導(dǎo)物；4.接種大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630)，在接觸空氣條件下，于溫度30-32℃，三角瓶裝料旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)60-72小時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰；5.發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液即果膠酶液；6.經(jīng)還原糖法測(cè)定酶活力，果膠酶產(chǎn)率(酶單位數(shù)/毫升發(fā)酵液)達(dá)到3.2單位/毫升發(fā)酵液。該方法制備果膠酶所用原料價(jià)廉，發(fā)酵周期短，過程容易控制，具有工業(yè)化開發(fā)價(jià)值。
本發(fā)明所述的果膠酶制備方法內(nèi)容如下1.大毛霉(Mucor mucedo)是毛霉屬中一個(gè)種，分布廣泛，多出現(xiàn)在獸畜的糞便上，能產(chǎn)琥珀酸，3-羥基丁酮，脂肪酶。MIYAZAWA等人報(bào)道應(yīng)用大毛霉進(jìn)行樟腦醌的生物轉(zhuǎn)化。CERTIK等人報(bào)道大毛霉生產(chǎn)γ-亞麻酸。本發(fā)明所用大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630)經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基訓(xùn)化獲得。該菌種保存于PDA培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基組成如下馬鈴薯提取液1.0升，葡萄糖20.0克，瓊脂15.0克。
2.產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成比例(W/V)如下麩皮5％，氮3％，含果膠廢渣3％。
3.液態(tài)發(fā)酵操作方法如下按2所述的原料比配置培養(yǎng)基。培養(yǎng)基被分裝于500ml的三角瓶中，每瓶50ml于0.1Mpa壓力下蒸氣滅菌30分鐘，取出降至室溫，接種1所述方法制備的菌種，在接觸空氣條件下，于溫度30-32℃，旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵液離心，所得的上清液即為果膠酶。
4.果膠酶測(cè)定采用還原糖法，測(cè)定方法如下吸取1.6ml 0.25％柑橘果膠溶液(用0.05M，pH4.2檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液配制)，加入稀釋一定倍數(shù)的酶液0.4ml，在40℃恒溫水浴中反應(yīng)25分鐘，用3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定其酶活力。此方法即利用3，5-二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺的程度成一定比例關(guān)系，可用于比色測(cè)定。酶活力單位定義在pH4.2，溫度40℃條件下每分鐘生成1μmol的半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。
實(shí)施例1不同菌種液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)黑曲霉、溜曲霉兩個(gè)菌種都能固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)果膠酶，并且產(chǎn)酶較高。因此用大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630，以下省略菌種保藏中心登記號(hào))、黑曲霉、溜曲霉三個(gè)菌株進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。
液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)500ml三角瓶每瓶加入麩皮2.5克，葵盤粉1.5克，硫酸銨1.5克，水50ml，0.1Mpa壓力下蒸汽滅菌30分鐘，取出降至室溫后，分別接種大毛霉PE315、黑曲霉、溜曲霉，在接觸空氣條件下，于溫度30-32℃，旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵液離心，所得的上清液即為果膠酶，所測(cè)得的酶活性結(jié)果如下表(表1)表1菌種 酶活力(單位/毫升發(fā)酵液)大毛霉PE315 3.19黑曲霉2.86溜曲霉2.64實(shí)施例2不同氮源對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響菌種大毛霉PE315保存于冰箱內(nèi)4℃ PDA培養(yǎng)基，半年轉(zhuǎn)接1次，使用前轉(zhuǎn)接到新配制的斜面。
液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)麩皮，無機(jī)氮，誘導(dǎo)物添加量為5％(W/V)，3％(W/V)，3％(W/V)。500ml三角瓶每瓶加入麩皮2.5克，葵盤粉1.5克，無機(jī)氮1.5克，水50ml。所用氮源有硫酸銨、氯化銨。0.1Mpa壓力下蒸汽滅菌30分鐘，取出降至室溫后，接種大毛霉PE315，在接觸空氣條件下，于溫度30-32℃，旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵液離心，所得的上清液即為果膠酶，所測(cè)得的酶活性結(jié)果如下表(表2)表2氮源 酶活力(單位/毫升發(fā)酵液)硫酸銨 3.21氯化銨 3.14實(shí)施例3不同誘導(dǎo)物對(duì)產(chǎn)果膠酶的影響菌種大毛霉PE315保存于冰箱內(nèi)4℃ PDA培養(yǎng)基，半年轉(zhuǎn)接1次，使用前轉(zhuǎn)接到新配制的斜面。
液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)麩皮，無機(jī)氮，誘導(dǎo)物添加量為5％(W/V)，3％(W/V)，3％(W/V)。500ml三角瓶每瓶加入麩皮2.5克，硫酸銨1.5克，誘導(dǎo)物1.5克，水50ml。所用誘導(dǎo)物有葵盤粉，甜菜渣，桔皮，香蕉皮。0.1Mpa壓力下蒸汽滅菌30分鐘，取出降至室溫后，接種大毛霉PE315，在接觸空氣條件下，于溫度30-32℃，旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，發(fā)酵液離心，所得的上清液即為果膠酶，所測(cè)得的酶活性結(jié)果如下表(表3)表3誘導(dǎo)物酶活力(單位/毫升發(fā)酵液)葵盤粉3.19甜菜渣3.08桔皮 2.84香蕉皮2.69
權(quán)利要求
1.以麩皮作為碳源，以無機(jī)氮作為氮源，以含果膠的廢渣作為誘導(dǎo)物，接種經(jīng)訓(xùn)化的大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630)，在一定的溫度、通風(fēng)條件下進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液即果膠酶液。
2.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，大毛霉PE315(菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC 0630)為產(chǎn)果膠酶的唯一菌種，該菌種自大毛霉Mucor mucedo(Linnaeus)Fresenius3.15經(jīng)產(chǎn)酶培養(yǎng)基訓(xùn)化獲得，其發(fā)酵產(chǎn)酶效率因原料不同、控制條件不同而變化。
3.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，作為制備果膠酶的微生物發(fā)酵誘導(dǎo)物是指葵花盤粉末、甜菜渣和果渣，它們經(jīng)研碎后過40目篩。所述的葵花盤粉末是向日葵去掉葵花子后加工成含水12％以下的粉末；甜菜渣是指甜菜糖生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢渣(又稱甜菜廢粕或顆粒粕)，加工成含水12％以下的顆粒狀態(tài)；果渣是指水果(如桔子，香蕉等)加工過程產(chǎn)生的廢渣(即桔皮，香蕉皮等)，加工成含水12％以下的顆粒狀態(tài)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)物占培養(yǎng)基總重量的3％(W/V)。
4.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，輔加的無機(jī)氮源指硫酸銨，氯化銨。在發(fā)酵培養(yǎng)基中，氮的含量占培養(yǎng)基總重量的3％(W/V)。
5.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，碳源為麩皮，在發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源的含量占培養(yǎng)基總重量的5％(W/V)。
6.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，液態(tài)發(fā)酵的溫度為30-32℃，搖床轉(zhuǎn)速為240轉(zhuǎn)/分。
7.在權(quán)利要求第1項(xiàng)所述的方法中，發(fā)酵液經(jīng)離心后，上清液即為果膠酶液制品。另根據(jù)使用要求，該酶液可于40℃之下減壓濃縮成高濃度果膠酶產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明為一種用大毛霉液態(tài)發(fā)酵制備果膠酶的方法,屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域。發(fā)明以麩皮作為碳源,以無機(jī)氮作為氮源,以含果膠的廢渣作為誘導(dǎo)物,接種大毛霉PE315((菌種保藏中心登記號(hào)CGMCC0630),在接觸空氣條件下,于溫度30－32℃,三角瓶裝料旋轉(zhuǎn)搖床240轉(zhuǎn)/分振蕩培養(yǎng)60－72小時(shí)達(dá)到產(chǎn)酶高峰。發(fā)酵液經(jīng)離心,上清液即果膠酶液。經(jīng)還原糖法測(cè)定酶活力,果膠酶產(chǎn)率(酶單位數(shù)/毫升發(fā)酵液)達(dá)到3.2單位/毫升。(酶活力單位定義為:在pH4.2,溫度40℃條件下每分鐘生成1μmol的半乳糖醛酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。)
文檔編號(hào)C12N9/00GK1343771SQ01141778
公開日2002年4月10日 申請(qǐng)日期2001年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月19日
發(fā)明者顧紅燕, 張洪勛, 齊鴻雁 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心