專利名稱：在人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中具有表達(dá)差異的基因nspl1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一個(gè)在人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤與正常神經(jīng)系統(tǒng)中具有明顯表達(dá)差異的基因/蛋白，人的類神經(jīng)內(nèi)分泌特異蛋白1的基因及其編碼蛋白，(human neuroencocrine specific proteinlike gene/protein，hNSPL1/hNSPL1)，涉及生物醫(yī)學(xué)高技術(shù)中新基因、新蛋白的開發(fā)與應(yīng)用領(lǐng)域。
第一個(gè)RTN家族的成員C1-13是在成年鼠的腦cDNA文庫(kù)中被發(fā)現(xiàn)。經(jīng)過Northern雜交證實(shí)，C1-13只在神經(jīng)系統(tǒng)非膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。隨后，在人的腦cDNA文庫(kù)中又克隆出與鼠的C1-13高度同源的基因NSP(neuroendocrine-specific protein)，總共具有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本NSP-A、NSP-B、NSP-C，大小分別為3.4kb、2.3kb、1.8kb，編碼具有776、356、208個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)。其核酸序列的3’端十分保守，因此，它們所編碼的蛋白在羧基端同源性也很高，并且在這個(gè)區(qū)域內(nèi)含有兩個(gè)很大的疏水區(qū)。通過定點(diǎn)突變目前認(rèn)為，此區(qū)域是蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相互作用的關(guān)鍵。而蛋白N端的氨基酸多為特異的，無保守性可言，且富含絲氨酸，可作為潛在的磷酸化位點(diǎn)。而大量的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在不同的生理狀態(tài)下，這些磷酸化位點(diǎn)的確處于不同程度的磷酸化，但這些不同的磷酸化水平與各項(xiàng)生理功能的具體關(guān)系還沒有具體的文獻(xiàn)報(bào)道。Northern雜交顯示，NSP只在神經(jīng)內(nèi)分泌特異的組織中表達(dá)，例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)、胰島、腎上腺髓質(zhì)或小細(xì)胞肺癌組織等(而NSP-B只在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H82中表達(dá))。在免疫細(xì)胞化學(xué)的研究中發(fā)現(xiàn)，NSP蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。然而，隨后對(duì)此家族中新發(fā)現(xiàn)的另一種基因(RTN-2)的表達(dá)譜分析卻顯示，該基因不僅僅在神經(jīng)內(nèi)分泌特異的組織細(xì)胞中表達(dá)，在骨骼肌、小腸、周圍血細(xì)胞中也有較強(qiáng)的信號(hào)。因?yàn)榻M織表達(dá)譜分析已經(jīng)超越了神經(jīng)內(nèi)分泌特異組織的范圍，而這些基因又都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，因此被易名為RTN-1、RTN-2。而目前我實(shí)驗(yàn)室克隆到的這個(gè)cDNA全長(zhǎng)屬于RTN-3，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他組織，故命名為NSPL1(neuroendocrine specific protein like)。
就現(xiàn)有的研究狀況而言，對(duì)于此基因家族的具體功能機(jī)制，特別是這其中在神經(jīng)內(nèi)分泌組織中具有特異表達(dá)的基因，如何對(duì)某些或某類神經(jīng)因子或其他分泌性蛋白的分泌、加工起作用還不能正確認(rèn)識(shí)。但有關(guān)NSP基因文獻(xiàn)報(bào)道NSP基因表達(dá)量與神經(jīng)元的分化，慢性酒精中毒后的行為改變有關(guān)，NSP-C基因還能調(diào)節(jié)Bcl-2、Bcl-XL的功能，并且它還可以作為腫瘤向神經(jīng)內(nèi)分泌方向分化的重要標(biāo)志。而最新研究表明RTN家族中的RTN4可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后再生的抑制因子。
發(fā)明目的克隆在在人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤與正常神經(jīng)系統(tǒng)中具有明顯表達(dá)差異的基因NSPL1，表達(dá)其編碼蛋白，闡明NSPL1蛋白在神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)因子等神經(jīng)系統(tǒng)分泌蛋白的相互關(guān)系，以及從分子水平上闡明其表達(dá)差異在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中機(jī)理，從而為干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖提供可能的抑癌基因和新藥篩選的靶分子。內(nèi)容與要求本發(fā)明的內(nèi)容是應(yīng)用基因組信息學(xué)原理、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、cDNA文庫(kù)篩選、分子克隆、DNA序列測(cè)定技術(shù)克隆神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)基因NSPL1，并用Northern雜交及原位雜交技術(shù)進(jìn)行了組織細(xì)胞與病理表達(dá)分析。
該基因/蛋白達(dá)到的技術(shù)指標(biāo)為1.人NSPL1全長(zhǎng)cDNA為2559bp，其閱讀框架為708bp，編碼236個(gè)氨基酸。人NSPL1全長(zhǎng)cDNA為2559bp，其閱讀框架為708bp，編碼236個(gè)氨基酸2.該基因所編碼的蛋白C端與RTN家族中的其他成員有較高的同源性，并且在此區(qū)域中有兩個(gè)疏水區(qū)，研究表明，這是與細(xì)胞膜相互作用的區(qū)域。
3.人NSPL1基因在成人與胎兒神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)。在小鼠中存在NSPL1的同源基因，其表達(dá)譜要廣泛的多。原位雜交顯示其在大、小鼠的大腦皮層，海馬，齒狀回，腦干的多種神經(jīng)核團(tuán)及脊髓前后角神經(jīng)元細(xì)胞中高度表達(dá)；在正常膠質(zhì)細(xì)胞中無明顯信號(hào)。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的原位雜交及免疫組化顯示膠質(zhì)細(xì)胞瘤中有明顯信號(hào)。
4.該基因及其編碼蛋白與神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的維持及腫瘤發(fā)生等生命現(xiàn)象密切相關(guān)，可用于腦發(fā)育相關(guān)疾病，腫瘤發(fā)生的基因診斷和基因治療，還可用于新藥的設(shè)計(jì)與開發(fā)。
步驟歸納如下鋪板 轉(zhuǎn)膜 雜交 放射自顯影 單克隆的環(huán)化 測(cè)序循環(huán)2-3次2.組織Northern雜交及分區(qū)膜Northern雜交載有心、腦、腎、肺、肝、胎盤、骨骼肌、胰腺M(fèi)ultiple Tissue Northern(MTNTM)Blot購(gòu)自Clontech公司。將陽性克隆用HindIII切下的436個(gè)bp作為探針。探針標(biāo)記使用Promega標(biāo)記試劑盒，室溫標(biāo)記α-32P-dCTP1小時(shí)。雜交液采用Clontech公司的ExtressHybTMHybridization Solution。按照Clontech公司雜交使用手冊(cè)雜交過夜。雜交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用雙面增感屏，-70℃曝光。
載有腦組織分區(qū)及其他非腦組織的RNA Master BlotTM購(gòu)自Clontech公司。陽性克隆用Noc I切下的近500bp作為雜交探針，用上述方法標(biāo)記探針。雜交液采用Clontech公司的ExtressHybTM Hybridization Solution。65℃預(yù)雜交30min，后加入標(biāo)記的變性探針及用于封閉的30ugC0t-1 DNA、150ug ssDNA及50ul 20×SSC，65℃雜交6小時(shí)。雜交后用2×SSC，1％SDS及0.1×SSC，0.5％SDS洗膜。用雙面增感屏，-70℃曝光。3.小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)切片原位雜交利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與該基因高度同源的小鼠的EST(unigene237377)，并以此設(shè)計(jì)引物，上游ACAAGGCCCTCAAACTCATTATTC，下游CTTCTTGCTTCACGTGCTTATTCT。在小鼠腦的cDNA文庫(kù)中PCR得到相應(yīng)的鼠EST，連接到T-easy載體中，分別用Sal1/T7、Nco1/Sp6酶切，作為原位雜交正反義探針模板。使用Promega的DIG標(biāo)記RNA探針試劑盒，作體外轉(zhuǎn)錄，并引入DIG-C，從而合成地高辛標(biāo)記的RNA雜交探針。同時(shí)用多聚甲醛灌流固定小鼠，取小鼠腦及脊髓組織進(jìn)行切片，以制備好的正反義探針按照原位雜交手冊(cè)行漂染雜交。4.利用融合綠色熒光蛋白進(jìn)行細(xì)胞定位分析此cDNA克隆所編碼的蛋白序列序列，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道的將蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的錨定基序(retention motif)KXKXX，故將此基因從核酸112-840位(包括翻譯起始位點(diǎn)及前面的Kozat序列)融合到綠色熒光蛋白的N端，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞定位。設(shè)計(jì)上下游引物并分別引入Kpn1、BamH1的酶切位點(diǎn)，上游GGGTACCTTTTCACCCTTCTCCCACCCTCG，下游CGGGATCCGCCTTTTTTTTGGCGATTCCAGG，將PCR獲得的片段連于N-EGFP載體中，構(gòu)建能夠表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，48小時(shí)后獲得高效的瞬時(shí)表達(dá)。在共聚焦顯微鏡下觀察定位結(jié)果。5.蛋白的原核表達(dá)、純化及動(dòng)物免疫與多克隆抗體的獲得設(shè)計(jì)引物，上游GAAGATCTCTCATTTTCAGTGTCCCGATTGTC，下游GCGTCGACTGGGGCAGGAAGATAGGATTTGAG，以擴(kuò)增NSPL1蛋白C端。按正確讀碼框架插入本室構(gòu)建的可表達(dá)26kDa二氫葉酸脫氫酶融合蛋白的pET-30a-DHFR的原核表達(dá)載體中。將上述重組克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)宿主細(xì)胞BL21，1mMIPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白。
大量表達(dá)的融合蛋白NSPL1-DHFR為包涵體形式。采用Qiagen公司的Qiaexpress系統(tǒng)初步純化，得到洗脫后初步純化的蛋白。為進(jìn)一步純化目的蛋白，將初步純化后的產(chǎn)物再進(jìn)行SDS-PAGE電泳，割膠回收，并將回收的膠塊搗碎，在100mMTris-HCl中4℃浸泡48小時(shí)。
以純化后的目的蛋白免疫飼養(yǎng)的新西蘭純種大白兔(方法見分子克隆)。經(jīng)過一次基礎(chǔ)免疫和兩次加強(qiáng)免疫后，每次免疫后一周收集的抗血清并經(jīng)ELISA檢測(cè)抗體滴度。待達(dá)到所要求滴度，則頸動(dòng)脈放血，收集抗血清，分裝-70℃保存。6.組織蛋白的提取與Western雜交按照分子克隆的方法提取小鼠不同組織的蛋白。將所提取的蛋白質(zhì)定量后進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳。電泳完畢，以Bio-Rad公司的Mini-Cell電轉(zhuǎn)系統(tǒng)在含2.9‰甘氨酸，5.8‰Tris，0.37‰SDS和20％甲醇的電轉(zhuǎn)液中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將電轉(zhuǎn)后的硝酸纖維膜放入含5％脫脂奶粉，1％封閉用羊血清，0.1％Tween20的TBS封閉緩沖液中，室溫緩慢振蕩2hr以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。一抗以1∶8000稀釋于封閉液中，4℃振蕩孵育過夜。20ml TBS洗3次，每次10分鐘；將膜置于封閉緩沖液中振蕩30分鐘。1∶1000稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG室溫振蕩孵育2小時(shí)。TBS緩沖液洗3次，每次10分鐘。置于染色緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mM Tris-HCl PH9.5)5分鐘。將膜置于含BCIP/NBT的染色液中(同組織原位雜交)，于室溫下輕輕搖晃，使蛋白條帶逐漸顯色。7.免疫組織化學(xué)采用與原位雜交相同的方法灌流固定小鼠，并取材小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦、脊髓)，-20℃40-50um冰凍切片。在0.3％Triton-X-100的1×PBS中4℃預(yù)處理3-4天后，用封閉液(含1％BSA、1％羊血清、0.3％Triton-X-100的1×PBS)室溫震蕩封閉2小時(shí)。然后以適當(dāng)比例的封閉液稀釋一抗，4℃孵育過夜。用含有0.3％Triton-X-100的1×PBS漂洗3次后，1∶1000生物素標(biāo)記的二抗在含1％BSA，1％羊血清，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室溫震蕩2.5小時(shí)。再漂洗3次，然后1∶1000生物素-親和素-辣根過氧化物酶(預(yù)先混合半小時(shí))在含1％BSA，0.3％Triton-X-100的1×PBS中室溫震蕩2小時(shí)。漂洗后就可以利用辣根過氧化物酶的酶促反應(yīng)DAB-鎳顯色(顯色液配制46ml50mmol/L Tris-HCl，1ml 1％DAB，3ml 6.88％硫酸鎳銨，7.5μl 30％H2O2)。8.人NSPL1全長(zhǎng)cDNA和氨基酸序列1T TTT ATT CAG GTC CCG CCT CGG AGC AGG CGG AGT AAA GGG ACT TGA GCG AGC CAG TTG CCG GAT TAT TCT ATT TCC7677 CCT CCC TCT CTC CCG CCC CGT ATC TCT TTT CAC CCT TCT CCC ACC CTC GCT CGC GTA GCC ATG GCG GAG CCG TCG GCG 1541 M A E P S A 6155 GCC ACT CAG TCC CAT TCC ATC TCC TCG TCG TCC TTC GGA GCC GAG CCG TCC GCG CCC GGC GGC GGC GGG AGC CCA GGA 2327 A T Q S H S I S S S S F G A E P S A P G G G G S P G 32233 GCC TGC CCC GCC CTG GGG ACG AAG AGC TGC AGC TCC TCC TGT GCG GTG CAC GAT CTG ATT TTC TGG AGA GAT GTG AAG 31033 A C P A L G T K S C S S S C A V H D L I F W R D V K 58311 AAG ACT GGG TTT GTC TTT GGC ACC ACG CTG ATC ATG CTG CTT TCC CTG GCA GCT TTC AGT GTC ATC AGT GTG GTT TCT 38859 KT G F V F G T T L I M L L S L A A F S V I S V V S84389 TAC CTC ATC CTG GCT CTT CTC TCT GTC ACC ATC AGC TTC AGG ATC TAC AAG TCC GTC ATC CAA GCT GTA CAG AAG TCA 46685Y L I L A L L S V T IS F R I Y K S V I Q A V Q K S 110467 GAA GAA GGC CAT CCA TTC AAA GCC TAC CTG GAC GTA GAC ATT ACT CTG TCC TCA GAA GCT TTC CAT AAT TAC ATG AAT 544111 E E G H P F K A Y L D V D I T L S S E A F H N Y M N136545 GCT GCC ATG GTG CAC ATC AAC AGG GCC CTG AAA CTC ATT ATT CGT CTC TTT CTG GTA GAA GAT CTG GTT GAC TCC TTG 622137 A A M V H I N R A L K L I I R L F L V E D L V D SL162623 AAG CTG GCT GTC TTC ATG TGG CTG ATG ACC TAT GTT GGT GCT GTT TTT AAC GGA ATC ACC CTT CTA ATT CTT GCT GAA 700163K L A V F M W L M T Y V G A V F N G I T L L I L A E188701 CTG CTC ATT TTC AGT GTC CCG ATT GTC TAT GAG AAG TAC AAG ACC CAG ATT GAT CAC TAT GTT GGC ATC GCC CGA GAT 778189L L I F S V P I V YE K Y K T Q I D H Y V G I A R D 214779 CAG ACC AAG TCA ATT GTT GAA AAG ATC CAA GCA AAA CTC CCT GGA ATC GCC AAA AAA AAG GCA GAA TAA GTA CAT GGA 856215 Q T K S I V E K I Q A K L P G I A K K K A E236857 AAC CAG AAA TGC AAC AGT TAC TAA AAC ACC ATT TAA TAG TTA TAA CGT CGT TAC TTG TAC TAT GAA GGA AAA TAC TCA 934935 GTG TCA GCT TGA GCC TGC ATT CCA AGC TTT TTT TTT AAT TTG GTG TTT TCT CCC ATC CTT TCC CTT TAA CCC TCA GTA 10121013 TCA AGC ACA AAA ATT GAT GGA CTG ATA AAA GAA CTA TCT TAG AAC TCA GAA GAA GAA AGA ATC AAA TTC ATA GGA TAA 10901091 GTC AAT ACC TTA ATG GTG GTA GAG CCT TTA CCT GTA GCT TGA AAG GGG AAA GAT TGG AGG TAA GAG AGA AAA TGA AAG 11681169 AAC ACC TCT GGG TCC TTC TGT CCA GTT TTC AGC ACT AGT CTT ACT CAG CTA TCC ATT ATA GTT TTG CCC TTA AGA AGT 12461247 CAT GAT TAA CTT ATG AAA AAA TTA TTT GGG GAC AGG AGT GTG ATA CCT TCC TTG GTT TTT TTT TGC AGC CCT CAA ATC 13241325 CTA TCT TCC TGC CCC ACA ATG TGA GCA GCT ACC CCT GAT ACT CCT TTT CTT TAA TGA TTT AAC TAT CAA CTT GAT AAA 14021403 TAA CTT ATA GGT GAT AGT GAT AAT TCC TGA TTC CAA GAA TGC CAT CTG ATA AAA AAG AAT AGA AAT GGA AAG TGG GAC 14801481 TGA GAG GGA GTC AGC AGG CAT GCT GCG GTG GCG GTC ACT CCC TCT GCC ACT ATC CCC AGG GAA GGA AAG GCT CCG CCA 15581559 TTT GGG AAA GTG GTT TCT ACG TCA CTG GAC ACC GGT TCT GAG CAT TAG TTT GAG AAC TCG TTC CCG AAT GTG CTT TCC 16361637 TCC CTC TCC CCT GCC CAC CTC AAG TTT AAT AAA TAA GGT TGT ACT TTT CTT ACT ATA AAA TAA ATG TCT GTA ACT GCT 17141715 GTG CAC TGC TGT AAA CTT GTT AGA GAA AAA AAT AAC CTG CAT GTG GGC TCC TCA GTT ATT GAG TTT TTG TGA TCC TAT 17921793 CTC AGT CTG GGG GGG AAC ATT CTC AAG AGG TGA AAG ACA GAA AGC CTT TTT TTC TTG ATC TTT TCC CGA GAT TCA AAT 18701871 CTC CGA TTC CCA TTT GGG GGC AAG TTT TTT TCT TCA CCT TCA ATA TGA GAA TTC AGC GAA CTT GAA AGA AAA ATC ATC 19481949 TGT GAG TTC CTT CAG GTT CTC ACT CAT AGT CAT GAT CCT TCA GAG GGA ATA TGC ACT GGC GAG TTT AAA GTA AGG GCT 20262027 ATG ATA TTT GAT GGT CCC AAA GTA CGG CAG CTG CAA AAA GTA GTG GAA GGA AAT TGT CTA CGT GTC TTG GAA AAA TTA 21042105 GTT AGG AAT TTG GAT GGG TAA AAG GTA CCC TTG CCT TAC TCC ATC TTA TTT TCT TAG CCC CCT TTG AGT GTT TTA ACT 21822183 GGT TTC ATG TCC TAG TAG GAA GTG CAT TCT CCA TCC TCA TCC TCT GCC CTC CCA GGA AGT CAG TGA TTG TCT TTT TGG 22602261 GCT TCC CCT CCA AAG GAC CTT CTG CAG TGG AAG TGC CAC ATC CAG TTC TTT TCT TTT GTT GCT GCT GTG TTT AGA TAA 23382339 TTG AAG AGA TCT TTG TGC CAC ACA GGA TTT TTT TTT TTT TTA AGA AAA ACC TAT AGA TGA AAA ATT ACT AAT GAA ACT 24162417 GTG TGT ACG TGT CTG TGC GTG CAA CAT AAA AAT ACA GTA GCA CCT AAG GAG CTT GAA TTT TGG TTC CTG TAA AAT TTC 24942495 AAA TTG ATG TGG TAT TAA TAA AAA AAA AAA AAA AAC ACA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AA 2559
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因NSPL1，其特征在于互補(bǔ)脫氧核苷酸(cDNA)全長(zhǎng)2559bp，含一個(gè)708bp的完整開放閱讀框，編碼236個(gè)氨基酸，分子量為30kDa的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利1要求所述之神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因NSPL1，其特征在于在神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)，在海馬，大腦皮層，腦干及其他部位的神經(jīng)核團(tuán)的神經(jīng)元細(xì)胞中高表達(dá)，在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中無明顯信號(hào)。
3.根據(jù)權(quán)利1、2要求所述之神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)的基因NSPL1，其特征在于所編碼蛋白屬于RTN家族，該蛋白的N端為特異性的，C端與家族其他成員相比為保守的，并且，在此區(qū)域中具有兩個(gè)大的疏水區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利1、2、3所述之人神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá)基因NSPL1，其特征在于該基因及其所編碼的蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤與正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)具有明顯差異。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)在人神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)的基因(NSPL1)，包括互補(bǔ)脫氧核苷酸(cDNA)序列和編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列。該基因編碼的蛋白質(zhì)定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，在正常神經(jīng)細(xì)胞元中高度表達(dá)，在正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)具有明顯差異。在維持神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能及某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生過程中可能具有重要的作用。
文檔編號(hào)C12N15/12GK1408868SQ0114144
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月25日
發(fā)明者袁建剛, 強(qiáng)伯勤, 彭小忠, 黃曉瑋 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所