專(zhuān)利名稱(chēng)：癌癥起始細(xì)胞的線粒體活性抑制劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療腫瘤的化合物。更具體而言，本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的腫瘤的方法。本發(fā)明還提供一種包含本發(fā)明的抑制劑的藥物組合物，以及一種識(shí)別本發(fā)明的抑制劑的篩選方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)膠質(zhì)瘤是成人中最常見(jiàn)的一種腦部腫瘤。神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性形式，IV級(jí)，也稱(chēng)為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)，是眾所周知地難以治療。在大多數(shù)情況下這種腫瘤都會(huì)復(fù)發(fā)，而實(shí)際上與包括手術(shù)、放療和化療的目前所有的治療方法無(wú)關(guān)。存活率非常低，例如， 14. 6個(gè)月，即使在結(jié)合了化療與放療的情況下。還沒(méi)有環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)因素被確認(rèn)，而且關(guān)于這些腦部腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)機(jī)制，了解的也非常少。奧托-瓦爾堡(Otto Warburg) 1930年提出，當(dāng)非腫瘤細(xì)胞在以下兩個(gè)連續(xù)階段之后采用無(wú)氧代謝時(shí)，癌癥會(huì)發(fā)生，所述兩個(gè)連續(xù)階段為(1)呼吸作用的不可逆損傷；(2)醣酵解成功取代呼吸作用的不可挽回的損失。根據(jù)這個(gè)理論，大多數(shù)的癌細(xì)胞被認(rèn)為在有氧環(huán)境下會(huì)優(yōu)先通過(guò)由葡萄糖產(chǎn)生乳酸來(lái)生產(chǎn)能量，這種現(xiàn)象通常被稱(chēng)為“有氧糖酵解”并被稱(chēng)為瓦爾堡效應(yīng)(Warburg's effect) 0因此，針對(duì)這種有氧糖酵解代謝途徑開(kāi)發(fā)癌癥治療在最近幾十年中受到越來(lái)越多的關(guān)注，這種途徑可以允許代謝過(guò)程向有效呼吸的重建和通過(guò)線粒體產(chǎn)生能量。一些出版物提出，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的線粒體是癌癥化療的潛在靶點(diǎn)(Daley等， 2005, Biochemical and Biophysical Research Communications,328 (2) :623-632; Pilkington 等，2008，Seminars in cancer biology England, 18(3) :226-235)。這些出版物公開(kāi)了無(wú)需進(jìn)一步化療或手術(shù)的治療，所述治療涉及作為線粒體復(fù)合物III抑制劑的氯丙咪嗪或常規(guī)三環(huán)化合物和用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)的潛在化學(xué)療法。所述抑制劑通過(guò)激活線粒體途徑即通過(guò)釋放細(xì)胞色素C和激活胱天蛋白酶-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這種療法是可能的，因?yàn)樯窠?jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)具有與正常細(xì)胞不同的代謝。WO 2008/031171 (格里菲斯大學(xué))也公開(kāi)了一些抗癌化合物和治療或預(yù)防癌癥的方法。具體而言，公開(kāi)了促氧化劑抗癌化合物，例如維生素E的助氧化劑形式，其選擇性地與癌細(xì)胞中線粒體呼吸鏈的復(fù)合物II (琥珀酸-泛醌氧化還原酶)相互作用，產(chǎn)生活性氧并誘導(dǎo)這些細(xì)胞的凋亡。然而，這種治療策略假定了每一個(gè)單獨(dú)的癌細(xì)胞(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)的生物學(xué)和代謝是相似的，不幸的是，這種治療策略沒(méi)有在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中提供顯著進(jìn)步。盡管神經(jīng)膠質(zhì)瘤確切的細(xì)胞起源仍不清楚，人們認(rèn)為，只有一部分具有干細(xì)胞性質(zhì)的癌細(xì)胞，通常被稱(chēng)為癌癥干細(xì)胞(CSC)，才具有真正致瘤的可能性，并構(gòu)成神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的腫瘤起始細(xì)胞的離散儲(chǔ)存庫(kù)。最近在許多人類(lèi)癌癥如急性骨髓性白血病(AML)、乳腺癌、卵巢癌和腦癌中類(lèi)似干細(xì)胞的細(xì)胞(SC)的識(shí)別，重新喚起了對(duì)癌癥可能來(lái)源于成人干細(xì)胞/祖細(xì)胞的體細(xì)胞突變這一假設(shè)的興趣。稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腦部腫瘤癌癥起始細(xì)胞最初被識(shí)別為CD133+ 細(xì)胞，但最近的研究證明這個(gè)標(biāo)志特異性相對(duì)不足。這些細(xì)胞是具有不同致瘤能力的異質(zhì)細(xì)胞群體，某些腫瘤細(xì)胞具有出眾的腫瘤發(fā)生和繁殖能力。神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生和復(fù)發(fā)的原因。具有干細(xì)胞性質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的作用還沒(méi)有被充分地研究。這些細(xì)胞表現(xiàn)出典型的干細(xì)胞特征，包括在單細(xì)胞層面上的自我更新能力、具有星形膠質(zhì)跡象的多潛能性、在體外的神經(jīng)元和少突神經(jīng)膠質(zhì)分化和在在體內(nèi)的致瘤性。 像其他人類(lèi)癌癥那樣，神經(jīng)膠質(zhì)瘤包括多個(gè)細(xì)胞層次，在所述細(xì)胞層次的頂端具有干細(xì)胞性質(zhì)的腫瘤起始和繁殖細(xì)胞(稱(chēng)為癌癥干細(xì)胞-csc)似乎控制腫瘤的生長(zhǎng)。這種較少兩的類(lèi)似癌癥干細(xì)胞的細(xì)胞GIC只占腫瘤細(xì)胞(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的約5%的GIC可能代表著腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的來(lái)源，從而決定腫瘤的生物學(xué)行為，包括增殖、生長(zhǎng)以及隨后的對(duì)治療的響應(yīng)。標(biāo)靶神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞仍然具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)檫@些細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)罕見(jiàn)且不穩(wěn)定， 并且缺乏有效的追蹤試劑。到目前為止，沒(méi)有針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的治療顯示完全根除神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)，或在任何常位異種移植和/或轉(zhuǎn)基因小鼠模型中沒(méi)有復(fù)發(fā)。已經(jīng)證明了神經(jīng)膠質(zhì)瘤衍生的腫瘤起始細(xì)胞對(duì)常規(guī)放療的抵抗性(Bao等，2006 ；Clement等，2007)。 例如眾所周知，神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞抵抗化療藥物如替莫唑胺。這些數(shù)據(jù)可以解釋神經(jīng)膠質(zhì)瘤不可避免的復(fù)發(fā)，并且將神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞定義為新型靶點(diǎn)以克服這種疾病中對(duì)常規(guī)療法的抵抗性。到目前為止，還沒(méi)有針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的有效治療。仍然需要找到特別是針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的有效治療。但是，在識(shí)別任何針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的有效分子以及在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中獲得任何重大進(jìn)展之前，更好并更深入地了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的細(xì)胞和分子機(jī)制是至關(guān)重要的。

發(fā)明內(nèi)容
出乎意料地，本申請(qǐng)人已經(jīng)證明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞具有與其他癌細(xì)胞如神經(jīng)膠質(zhì)瘤不同的代謝方式。因此，本發(fā)明提供一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA 循環(huán)活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時(shí)間里，GIC的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，GIC的恢復(fù)低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC產(chǎn)生
能量°此外，本發(fā)明提供一種用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和
6/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物含有至少一種本發(fā)明所述的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑，以及一種或多種可藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體。本發(fā)明的另一目的是一種在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/ 或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，所述方法包括施用有效量的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時(shí)間里GIC的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段期間，GIC的恢復(fù)低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑期間以及之后， 正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC產(chǎn)生
能量°此外，本發(fā)明提供一種用于識(shí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使從腫瘤細(xì)胞樣本中分離的FLl+細(xì)胞和正常腦細(xì)胞與待篩選的抑制劑接觸，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的恢復(fù)低于0. 2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間以及之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。本發(fā)明還包括一種用于篩選神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性抑制劑的試劑盒，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的恢復(fù)低于0. 2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間以及之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的；所述試劑盒用于治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的腫瘤，其中所述試劑盒含有原代 CIC培養(yǎng)物、原代黏附性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞以及線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)或復(fù)合物(III)活性的至少一種標(biāo)準(zhǔn)抑制劑，所述標(biāo)準(zhǔn)抑制劑選自魚(yú)藤酮和抗霉素A。


圖1表示哺乳動(dòng)物細(xì)胞的厭氧和有氧途徑的示意圖。(修改自Lemire等，2008， PLoSONE, 3 (2)卷，el250)圖2表示指示癌癥干細(xì)胞中線粒體活性的參數(shù)。A :FLl+(具有黑色短劃線的白色背景)和FL1°細(xì)胞群(白色)中Mito+細(xì)胞(通過(guò)在加入M75-13染料后通過(guò)對(duì)FL3陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量定量來(lái)確定)的百分比以及通過(guò)FACS中的FLl-H和FL3-H通道檢測(cè)的FLl+細(xì)胞(黑色)中FLl自體熒光的水平。圖3示出了與FL1°、原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦細(xì)胞相比的FLl+細(xì)胞降低的糖酵解活性。A =FLl+和FLl0細(xì)胞的代謝水平(LAC 乳酸(lactate)，PYR 丙酮酸(pyruvate)， GLUC 葡萄糖)。B和C 乳酸(LAC)增加對(duì)相差成像的FLl+細(xì)胞形態(tài)(B)和FLl0細(xì)胞百分含量(C)的影響。未處理的(NT)；比例尺150μΜ。D 在純化的FLl+和FL1°細(xì)胞中活性乳酸脫氫酶的水平(以UI/L表達(dá)的LD)。圖4示出了 DCA或草酸鹽處理對(duì)FLl+細(xì)胞的影響，所述影響基于用上述試劑處理的樣品中與處理載體對(duì)照的樣品中死亡的FLl+細(xì)胞百分比的比值。A :DCA處理(氧化途徑的活化劑)。B 草酸鹽處理(細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)的乳酸脫氫酶3-5 (LDH3-5)的抑制劑)。圖5示出了實(shí)施例2中描述的用于測(cè)試抗癌癥干細(xì)胞試劑的方案。A 治療及恢復(fù)期間的實(shí)驗(yàn)操作。B 用有效的(黑色粗線)抗SCS試劑或無(wú)效的(黑色粗虛線)抗SCS試劑處理CIC之后的存活響應(yīng)曲線的示意圖。Tx代表處理了 χ時(shí)間的期間，例如10天(TlO)、 20天(T20)，R代表特定時(shí)間期間的恢復(fù)階段，如10天(RlO)和20天(R20)。圖6示出了實(shí)施例2所描述的體外復(fù)發(fā)分析中藥物的效果，用存活的處理過(guò)的 FLl+百分含量與存活的對(duì)照FLl+百分含量的比(1)，或者存活的處理過(guò)的細(xì)胞的百分含量與存活的對(duì)照細(xì)胞的百分含量的比⑵來(lái)表示。A:25Gy的Y-射線。Β:25μΜ的替莫唑胺(TMZ)。C :5 μ M 的魚(yú)藤酮(Rot) ；D :5 μ M 的抗霉素 A(AA)。E :5 μ M 的寡霉素 A/B (Oligo A)。F 氯丙咪嗪，又稱(chēng)為氯米帕明(anfranil) (10 μ M)。Tx代表處理了 χ時(shí)間的期間，例如 10天(TlO)、20天(Τ20)，R代表特定時(shí)間期間的恢復(fù)階段，如10天(RlO)和20天(R20)。圖7示出了用不同抑制劑處理的細(xì)胞的體內(nèi)致腫瘤性。曲線圖示出了在用原代 GBM-2細(xì)胞注射之后的所有無(wú)病癥小鼠總數(shù)的百分比，所述原代GBM-2細(xì)胞在植入前用不同分子在體外處理了 10天。對(duì)照小鼠在植入4周后出現(xiàn)病癥并被處死。組織學(xué)分析表明有塊狀腫瘤的存在。植入有用ΑΑ、魚(yú)藤酮或氯米帕明處理的細(xì)胞的小鼠仍然存活并沒(méi)有病癥。實(shí)驗(yàn)在植入后17周停止。組織學(xué)分析表明沒(méi)有可見(jiàn)的腫瘤。
具體實(shí)施例方式盡管與本文描述的方法或材料相似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但是下面描述合適的方法與材料。本文提到的所有出版物、專(zhuān)利申請(qǐng)、專(zhuān)利和其參考文獻(xiàn)都通過(guò)弓丨用并入它們的全部?jī)?nèi)容。提供本文所討論的出版物和申請(qǐng)僅是針對(duì)其在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩暗墓_(kāi)。本文并不被解釋為承認(rèn)本發(fā)明無(wú)權(quán)憑借在先發(fā)明而這些出版物。 此外，材料、方法和實(shí)施例都只是說(shuō)明性的，并不是為了限定。在有沖突的情況下，本說(shuō)明書(shū)，包括定義，將作為標(biāo)準(zhǔn)。 除非另有定義，本文所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本領(lǐng)域技術(shù)人員的通常理解一致。當(dāng)在本文中使用時(shí)，為了方便理解本發(fā)明，提供以下定義。術(shù)語(yǔ)“含有” 一般用于表達(dá)包含的意思，即是說(shuō)允許存在一個(gè)或多個(gè)特征或組分。除非上下文中另外清楚地表述，當(dāng)在本說(shuō)明書(shū)與權(quán)利要求書(shū)中使用時(shí)，單數(shù)形式 “一個(gè)”、“一種”和“所述”包括有復(fù)數(shù)的含義。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“受試者”或“患者”是本領(lǐng)域中公知的，在本文可交替地用于表示哺乳動(dòng)物，包括狗、貓、大鼠、小鼠、猴子、牛、馬、山羊、綿羊、豬、駱§它，以及最優(yōu)選地，人。在某些實(shí)施方案中，所述受試者是需要治療的受試者，或患有疾病或病癥的受試者， 所述疾病或病癥例如癌癥，優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)瘤。然而，在其他實(shí)施方案中，受試者可以是正常受試者或已經(jīng)經(jīng)過(guò)治療的受試者，所述治療例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的前期移除。這一術(shù)語(yǔ)不表示具體年齡或性別。因此，成熟和新生受試者，無(wú)論雄性或雌性，都將被覆蓋。在治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的癌癥中有用試劑例如抑制劑的識(shí)別，是指運(yùn)用可靠的篩選方法識(shí)別、分離并表征整個(gè)癌癥起始細(xì)胞(CIC)庫(kù)。優(yōu)選使用由一般從常規(guī)干細(xì)胞生物學(xué)(Burdsal等，1995，Cytometry, 21,145-152)外推得到的任意標(biāo)記物(如作為干性的讀出的CD133)確定的癌細(xì)胞系例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系的方法被認(rèn)為是有偏差的。因此，本申請(qǐng)人采用在國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/IB2008/0M872中描述的他們近期所開(kāi)發(fā)的方法來(lái)分離和富集表現(xiàn)出自我更新和腫瘤起始性質(zhì)的亞群。這種方法依賴(lài)于來(lái)源于人樣本的原代細(xì)胞培養(yǎng)物并依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞的簡(jiǎn)單、強(qiáng)大的表型特征，并且允許從非致瘤性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(被稱(chēng)為FLltl細(xì)胞)中快速的識(shí)別和分離癌癥起始細(xì)胞(CIC)(在本方法中被稱(chēng)為FLl+細(xì)胞)，而不依賴(lài)于任何細(xì)胞表面標(biāo)記，例如CD133。本申請(qǐng)人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，癌癥起始細(xì)胞(CIC)，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞，(更具體而言，本文使用的FLl+細(xì)胞群)確實(shí)使用有氧途徑(TCA循環(huán)/氧化磷酸化-電子轉(zhuǎn)移鏈)來(lái)產(chǎn)生它們的能量、分裂以及存活。本申請(qǐng)人還出乎意料地發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞 (GIC)與來(lái)自腫瘤實(shí)體的其他神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(癌細(xì)胞)相比，具有不同的代謝方式，腫瘤實(shí)體優(yōu)先使用有氧糖酵解(Warburg’ s效應(yīng))。本申請(qǐng)人確實(shí)得到了一個(gè)有趣且出乎意料的的發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ll+細(xì)胞(GIC)富有NADH、活性線粒體和活性LD。此外，與FLltl細(xì)胞相比，F(xiàn)Ll+ 細(xì)胞具有較低的乳酸水平，這表明FLl+細(xì)胞可能優(yōu)先于采用有氧-線粒體途徑來(lái)產(chǎn)生ATP。PCT/IB2008/054872所述方法有以下步驟(a)提供腫瘤細(xì)胞樣品；(b)在培養(yǎng)基中任選地培養(yǎng)在步驟(a)中提供的細(xì)胞；(c)在亞樣品中從根據(jù)步驟(a)或(b)提供的細(xì)胞中分離表現(xiàn)自發(fā)熒光發(fā)射的細(xì)胞(FLl+細(xì)胞)，當(dāng)通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選的方法用波長(zhǎng)為或約為488納米的激光束激發(fā)時(shí)，在FLl通道中檢測(cè)所述自發(fā)熒光發(fā)射。(d)在另一亞樣品中通過(guò)熒光活化細(xì)胞分選法分離在步驟(C)中沒(méi)有熒光性的細(xì)胞(FL1°細(xì)胞)以及在FL3和/或FL4通道中檢測(cè)的熒光中表現(xiàn)出微小正偏移的細(xì)胞；(e)從根據(jù)步驟(C)和(d)獲得的每個(gè)分離細(xì)胞亞樣品中排除死細(xì)胞；(f)在根據(jù)步驟(e)處理之后匯集根據(jù)步驟(C)得到的細(xì)胞亞樣品；(g)在根據(jù)步驟(e)處理之后匯集根據(jù)步驟(d)得到的細(xì)胞亞樣品。FLl+和FLltl神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞群之間的體外和體內(nèi)的表型和行為差異由進(jìn)一步的表征支持，所述表征證明FLl+細(xì)胞富有干性相關(guān)基因、是多能性的、能夠產(chǎn)生FLltl細(xì)胞并且是超長(zhǎng)時(shí)間保持長(zhǎng)期自我更新能力的原因。因?yàn)樵醋訤Lltl的培養(yǎng)物不產(chǎn)生任何FLl+細(xì)胞的培養(yǎng)基，其進(jìn)一步證明FL1°細(xì)胞來(lái)源于FLl+細(xì)胞群，保持存活若干代，但一旦它們從FLl+ 狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)镕Lltl狀態(tài)它們就不能重新獲得自發(fā)熒光的性質(zhì)。因此，這種方法和這種分離出的細(xì)胞群提供了用于測(cè)試試劑如抑制劑的可靠的技術(shù)，所述試劑可以用于治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的癌癥。采用篩選他們?cè)O(shè)計(jì)的抗GIC試劑的特異性的新型體外復(fù)發(fā)分析法，本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，標(biāo)靶氧化性細(xì)胞能量制造過(guò)程的試劑如抑制劑表現(xiàn)出了可靠的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的根除CICs 的功效。因此，防止NADH在線粒體復(fù)合物I或III中轉(zhuǎn)化為細(xì)胞ATP并誘導(dǎo)H2O2生成的抑制劑，可以被認(rèn)為是針對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的新型的特異性治療策略。采用上述用于識(shí)別GIC的強(qiáng)大的技術(shù)，本申請(qǐng)人還開(kāi)發(fā)了一種強(qiáng)大且可靠的篩選工具來(lái)識(shí)別特異性的和有效的抗GIC試劑。
通過(guò)利用本申請(qǐng)人的上述技術(shù)和他們?cè)O(shè)計(jì)用于測(cè)試和驗(yàn)證特異性的抗CSC試劑 (抗癌癥干細(xì)胞試劑)的體外分析法，本申請(qǐng)人證明，阻止通過(guò)有氧途徑產(chǎn)生的能量制造足以殺死整個(gè)CIC細(xì)胞群(所述殺死通過(guò)餓死CIC而不是通過(guò)凋亡來(lái)完成)。干擾電子傳輸鏈如在復(fù)合物I和III水平上線粒體的電子傳輸鏈的抑制劑表現(xiàn)出在體外和體內(nèi)殺死每個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的特殊能力。由于復(fù)合物I和III的抑制劑會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì) (ROS)和自由基，所以CIC也很有可能由于ROS的堆積或解毒系統(tǒng)的飽和而被殺死。與其他優(yōu)先利用腫瘤細(xì)胞系和干細(xì)胞標(biāo)記如CD133作為干性讀出的方法相比，本申請(qǐng)人的技術(shù)依靠來(lái)源于人樣本的原代細(xì)胞培養(yǎng)物以及依賴(lài)于獨(dú)立于任何標(biāo)記物的使用的簡(jiǎn)單且無(wú)偏差的CIC檢測(cè)。因此本申請(qǐng)人利用這種方法設(shè)計(jì)并開(kāi)發(fā)了體外復(fù)發(fā)分析法來(lái)篩選和驗(yàn)證用于根除神經(jīng)膠質(zhì)瘤中癌癥干細(xì)胞的潛在治療試劑。在被轉(zhuǎn)移回沒(méi)有任何試劑如抑制劑的恢復(fù)階段(恢復(fù)R)之前，使CIC、原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞和正常腦細(xì)胞暴露于試劑如抑制劑最多20天，優(yōu)選10天或20天(處理T)。新穎性本文的在于用于測(cè)試任何藥物的效用的干性讀出以及識(shí)別特異性抗CSC試劑的可能性?；旧?，任何試劑或抑制劑可以被認(rèn)為是有效的抗CSC試劑，只要其符合以下條件1)在暴露于所述試劑或抑制劑最多20天的時(shí)間里，GIC(FLl+細(xì)胞)的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，GIC(FLl+細(xì)胞)的恢復(fù)低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述試劑或抑制劑期間以及之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。優(yōu)選地，所述試劑或抑制劑是電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑。作為本申請(qǐng)人的體外復(fù)發(fā)分析法的概念和驗(yàn)證的證據(jù)，測(cè)試了 Y-輻射和目前用于GBM的首要細(xì)胞毒性試劑替莫唑胺的效用。與FBS-培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比， 40% 的FLl+細(xì)胞能夠耐受25Gy的輻射，存活并因此在基因毒性壓力后30天內(nèi)恢復(fù)，這證實(shí)了輻射主要不是靶向到CIC亞群而是腫瘤實(shí)體中快速分化的細(xì)胞。之前的替莫唑胺治療，如 Hegi等，N Engl J Med.，2005，352 (10)，997-1003中所描述的，首次測(cè)試了神經(jīng)膠質(zhì)瘤球 (gliomasphere)細(xì)胞中MGMT啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)，預(yù)測(cè)了神經(jīng)膠質(zhì)瘤球細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是對(duì)替莫唑胺敏感的。然而，即使用25 μ M的替莫唑胺處理多達(dá)20天之后，這比臨床使用劑量高 5倍，仍有超過(guò)30%的FLl+細(xì)胞存活，并能在20天內(nèi)恢復(fù)(0.2 <R< 1)。從表型和分子觀點(diǎn)看，根據(jù)定義，GBM是高度異質(zhì)的腫瘤。在區(qū)別地被激活或沉默的信號(hào)傳導(dǎo)途徑中，在 60%的GBM中表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)信號(hào)級(jí)聯(lián)被放大/過(guò)表達(dá)，并且在 65%的GBM中PII/AKT/PTEN信號(hào)級(jí)聯(lián)在PTEN表達(dá)中顯示變化。相似的，PTEN 的喪失似乎與不良預(yù)后和輻射耐受性相關(guān)。使用5μΜ埃羅替尼的長(zhǎng)期處理在超過(guò)50%的 FLl+細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，僅在2/6GBM中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，而與EGFR狀態(tài)無(wú)關(guān)，這因此證實(shí) EGFR基因的擴(kuò)增與對(duì)EGFR激酶抑制劑如吉非替尼或埃羅替尼的響應(yīng)能力無(wú)關(guān)。此外，所有的神經(jīng)膠質(zhì)瘤球培養(yǎng)物均能在10天內(nèi)從處理中恢復(fù)，這表明在受體水平上阻斷EGFR信號(hào)傳導(dǎo)途徑是無(wú)效的。主要的發(fā)育途徑如Notch、SHH-Gli和WNT、mT0R與若干人腫瘤有關(guān)，通常包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤，但很少有研究系統(tǒng)地強(qiáng)調(diào)它們?cè)谌税┌Y干細(xì)胞中的作用。更具體而言，用環(huán)巴胺抑制SHH-Gli的活性，或用Y-分泌酶抑制劑DAPT抑制NOTCH信號(hào)傳導(dǎo)途徑的活性，或通過(guò)潛在的影響癌癥起始細(xì)胞群的增殖和自我更新來(lái)降低腫瘤生長(zhǎng)。相似但不完全相同的，用特癌適抑制mTOR，或分別用5 μ M環(huán)巴胺的或5 μ M的DAPT靶向發(fā)育途徑如SHH-Gli或NOTCH 引起存活FLl+細(xì)胞的數(shù)量的降低。但是，即使在治療20天后仍能觀察到殘留的CIC，并導(dǎo)致CIC群的快速恢復(fù)，這些藥物仍被認(rèn)為是無(wú)效的。根據(jù)活性線粒體的數(shù)量、代謝的含量以及無(wú)氧能量制造途徑的抑制劑的效用，與 FLltl細(xì)胞相比，F(xiàn)Ll+細(xì)胞很可能優(yōu)先通過(guò)有氧途徑來(lái)制造它們的能量。因此，本申請(qǐng)人提出這樣的概念，任何具有抑制線粒體活性有效能力的試劑都會(huì)削弱CIC中的能量制造，很可能殺死CIC。這一概念通過(guò)本發(fā)明所使用的體外復(fù)發(fā)分析法進(jìn)行測(cè)試，并篩選電子傳輸鏈 (如魚(yú)藤酮，抗霉素A，安那芬尼)和質(zhì)子泵(寡霉素A/B)的抑制劑。暴露于5μ M的魚(yú)藤酮或抗霉素A或安那芬尼(氯丙咪嗪)或寡霉素Α/Β 20天殺死所有的FLl+細(xì)胞。對(duì)于治療的開(kāi)發(fā)和治療策略的設(shè)計(jì)，本申請(qǐng)人縮短了暴露于抑制有氧途徑的試劑的時(shí)間，發(fā)現(xiàn)10天的治療甚至足以殺死整個(gè)CIC庫(kù)。為了測(cè)試這些抑制劑對(duì)CIC的特異性，使正常腦細(xì)胞和原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(FBS培養(yǎng)物)暴露于上述線粒體試劑10天。發(fā)現(xiàn)正常腦細(xì)胞和原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)寡霉素Α/Β也是敏感的，這表明阻斷線粒體復(fù)合物IV活性可能不是合適的，因?yàn)槠浯_實(shí)影響正常腦細(xì)胞的存活。雖然輕微地影響生長(zhǎng)和增殖，但是暴露于抗霉素A 或安那芬尼以及在較小程度上暴露于魚(yú)藤酮允許正常腦細(xì)胞存活，并因此打開(kāi)了作為治療藥物的前景。有趣的是，在FBS中培養(yǎng)的原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤可以抵抗這些試劑，這進(jìn)一步證實(shí)了來(lái)自腫瘤實(shí)體的細(xì)胞具有與CIC不同的代謝方式。本發(fā)明提供神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性的抑制劑，所述抑制劑用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時(shí)間里，GIC的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，GIC的復(fù)發(fā)低于0. 2倍；以及3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑阻止由GIC制造
能量°優(yōu)選地，神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的所述移除是指神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的部分切除。優(yōu)選地，所述神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑以相當(dāng)于最多10倍IC2劑量的劑量施用。最優(yōu)選地，所述IC2劑量在0. 157至 0. 315mg/kg 的范圍。表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤優(yōu)選選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、轉(zhuǎn)移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、復(fù)發(fā)性癌癥以及轉(zhuǎn)移性癌癥。術(shù)語(yǔ)“樣品，，包括來(lái)自任何來(lái)源的組織或液體樣品，例如來(lái)自于患有癌癥、具有復(fù)發(fā)癌癥或疑似患有例如人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、轉(zhuǎn)移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤和室管膜細(xì)胞瘤的癌癥的患者(例如哺乳動(dòng)物患者，
11更具體而言，人類(lèi)患者)的組織或液體樣品。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品包括來(lái)自任何來(lái)源的組織或液體樣品，例如來(lái)自于患有轉(zhuǎn)移性癌癥或懷疑患有例如從黑色素瘤，乳腺癌， 結(jié)腸癌，肺癌轉(zhuǎn)移至大腦的癌癥的患者(例如哺乳動(dòng)物患者，更具體而言，人類(lèi)患者)的組織或液體樣品。術(shù)語(yǔ)“癌癥干細(xì)胞樣品”是指選自含有根據(jù)本發(fā)明所述的FLl+和FL1°細(xì)胞的混合物的神經(jīng)膠質(zhì)瘤球培養(yǎng)物(如實(shí)施例中所述的那樣培養(yǎng))或含有兩種被分離的FLl+或FL1° 細(xì)胞群的樣品，其中細(xì)胞通過(guò)根據(jù)本發(fā)明的方法分離。術(shù)語(yǔ)“癌細(xì)胞樣品”包括新鮮地從腫瘤樣品中解離的細(xì)胞樣品，或從腫瘤樣品中解離之后經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的細(xì)胞樣品，例如，諸如在干細(xì)胞培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤球培養(yǎng)物、 諸如在富含血清的培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的附著的細(xì)胞培養(yǎng)物以及諸如在分化培養(yǎng)基等中培養(yǎng)的分化的細(xì)胞培養(yǎng)物。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“腫瘤”(或瘤)是指贅生物或由于細(xì)胞異常生長(zhǎng)形成的贅生物或固態(tài)病變。腫瘤可以是良性的，癌前的或惡性的。腫瘤可能與中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)移至腦部和肺部轉(zhuǎn)移、急性粒細(xì)胞性白血病(AML)、乳腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤和卵巢腫瘤有關(guān)。此外，術(shù)語(yǔ)腫瘤還包括諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、室管膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、黑色素瘤。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞培養(yǎng)基等”包括其中鋪展有來(lái)源于新鮮解離的組織樣品的癌癥干細(xì)胞(也成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤球)的培養(yǎng)基。例如，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基包括用1/1’ 000的盤(pán)尼西林-鏈霉素(Gibco 公司)、B27(l/50Gibco 公司)或 BIT950(K20 % Stem cell Technologies公司)、30mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)、人重組 EGF (20ng/mlInvitrogen 公司)以及堿性 FGF-2 QOng/ml Invitrogen 公司)補(bǔ)充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司)。術(shù)語(yǔ)“富含血清的培養(yǎng)基等”包括其中鋪展有來(lái)源于新鮮解離的組織樣品的附著培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。(例如10%的FBS，用1/1，000的盤(pán)尼西林-鏈霉素(Gibco公司)補(bǔ)充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司))。術(shù)語(yǔ)“分化培養(yǎng)基等”包括其中鋪板有癌癥干細(xì)胞的用于分析其多潛能能力的培養(yǎng)基，例如涂覆有在水中1 100稀釋的聚-L-鳥(niǎo)氨酸和層粘連蛋白(Sigma公司) 混合物的平板，用于37攝氏度下0/N。解離細(xì)胞并以10個(gè)細(xì)胞/μ 的密度鋪板于用 1/1000 (Gibco 公司)地盤(pán)尼西林-鏈霉素、B27 (l/50Gibco 公司)或 BIT9500 (20 % Stem cell Technologies公司)、30mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸(Sigma-Aldrich公司)補(bǔ)充的 DMEM-F12-Ham，s (Gibco 公司)中。術(shù)語(yǔ)“FL1通道”是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，he.中描述的熒光的縱向檢測(cè)通道。典型地，對(duì)于488nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在FLl 通道中以520nm或約520nm的波長(zhǎng)進(jìn)行自發(fā)熒光的檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“FL3通道”是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，Inc.中描述的熒光的側(cè)向檢測(cè)(45度)通道。典型地，對(duì)于488nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在FL3通道中以> 630nm的波長(zhǎng)進(jìn)行自發(fā)熒光的檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“FL4通道，，是諸如在 Practical Flow Cytometry，Shapiro 等，第四版，2003， Wiley & Sons，Inc.中描述的熒光的側(cè)向檢測(cè)通道。典型地，對(duì)于632nm或約632nm的或者546nm或約546nm的激發(fā)波長(zhǎng)，在FL4通道中以> 630nm的波長(zhǎng)進(jìn)行自發(fā)熒光的檢測(cè)。術(shù)語(yǔ)“正常腦細(xì)胞”是指具有正常生理功能未患有任何疾病或病癥如腫瘤的健康腦細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)的和可恢復(fù)的”是指在暴露于本發(fā)明的抑制劑期間或之后，正常腦細(xì)胞保持其正常的生理功能并且不被削弱。術(shù)語(yǔ)“FL1+細(xì)胞”或“FL1-H細(xì)胞”或“GIC”或“CIC”是指通過(guò)本發(fā)明所述的方法由熒光活化細(xì)胞分選法所分選的細(xì)胞，尤其是通過(guò)選擇性檢測(cè)和分選表現(xiàn)特定形態(tài)(高FSC 和低/中SSC)的細(xì)胞以及在用激光束激發(fā)細(xì)胞亞樣品時(shí)在FLl通道中檢測(cè)的自發(fā)熒光發(fā)射。這種亞樣品存在于當(dāng)以488納米(例如藍(lán)色激光束，如氬)激發(fā)時(shí)表現(xiàn)出在FLl通道中以約520nm的波長(zhǎng)檢測(cè)的自發(fā)熒光發(fā)射的細(xì)胞亞群中。更具體而言，可以在FLl通道中用530nm+/-15分光鏡，或更緊密地用515nm+/-5分光鏡檢測(cè)FLl自發(fā)熒光，這證實(shí)FLl自發(fā)熒光發(fā)射光譜的特異性。術(shù)語(yǔ)“FL1°細(xì)胞”或“非FLl-H細(xì)胞”或“無(wú)自發(fā)熒光細(xì)胞”是指通過(guò)本發(fā)明所述的方法由熒光活化細(xì)胞分選法所分選的細(xì)胞，尤其是通過(guò)選擇性地檢測(cè)和分選表現(xiàn)特定形態(tài)(低/中FSC和中/高SSC)、在FLl通道中不是熒光性的并且表現(xiàn)在FL3或FL4通道中檢測(cè)到的熒光中輕微的正偏移的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“FL1_細(xì)胞”或“原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞”或“FBS培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞”是指在10%的FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、附著性的、不是通過(guò)本發(fā)明所述的方法由熒光活化細(xì)胞分選法所分選的細(xì)胞。這些細(xì)胞表現(xiàn)特定形態(tài)(中FSC和高SSC)、高的細(xì)胞質(zhì)/細(xì)胞核比例 (> 1)并且在FLl通道或F13或FL4通道中都不是熒光性的。術(shù)語(yǔ)“高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”是指前向散射并對(duì)應(yīng)于粒徑和速率的測(cè)定(細(xì)胞直徑在5至7 μ m之間)。術(shù)語(yǔ)“低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中FSC-A”是指前向尺寸散射并對(duì)應(yīng)于細(xì)胞尺寸(細(xì)胞直徑< 5至7 μ m)。術(shù)語(yǔ)“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”是指?jìng)?cè)向或直角散射并對(duì)應(yīng)于細(xì)胞復(fù)雜性或粒度(具有大的細(xì)胞質(zhì)和顆粒的細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)“低/中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”是指?jìng)?cè)向或直角散射并對(duì)應(yīng)于細(xì)胞復(fù)雜性或粒度(具有無(wú)顆粒的且限定在細(xì)胞核周?chē)募?xì)胞質(zhì)的細(xì)胞)。典型地，F(xiàn)Ll+或FLl-H細(xì)胞結(jié)合了 “高FSC”或“高FSC-H”或“高FSC-A”與“低/ 中SSC”或“低/中SSC-H”或“低/中SSC-A”，并因此細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)直徑比> 1。典型地，F(xiàn)Ll0或非FLl-H細(xì)胞結(jié)合了 “低/中FSC”或“低/中FSC-H”或“低/中 FSC-A”與“中/高SSC”或“中/高SSC-H”或“中/高SSC-A”，并因此細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)直徑比< 1。術(shù)語(yǔ)“干細(xì)胞培養(yǎng)基”是適用于干細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。典型地，干細(xì)胞培養(yǎng)基包括例如促細(xì)胞分裂原(堿性FGF-2，EGF)和無(wú)補(bǔ)充培養(yǎng)基(B27或BIT9500)。術(shù)語(yǔ)“球原性(spherogenicity)，，包括單個(gè)干細(xì)胞對(duì)稱(chēng)或不對(duì)稱(chēng)的分裂形成克隆體的能力。這種克隆體被稱(chēng)為球體，更準(zhǔn)確的說(shuō)，當(dāng)所述球體是衍生自神經(jīng)膠質(zhì)瘤時(shí)，其被稱(chēng)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤球。這種能力可以通過(guò)無(wú)性繁殖分析法來(lái)檢測(cè)，所述無(wú)性繁殖分析法也稱(chēng)為自我更新分析法，例如在PCT/IB2008/0M872中所描述的。自我更新分析法確實(shí)可以檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞形成克隆體的能力，但不是所有的克隆體都會(huì)形成球體。只有干細(xì)胞或正常發(fā)育中的早期先祖細(xì)胞或某些癌癥類(lèi)型表現(xiàn)球原性的潛力，并且這種特性存在于神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中。術(shù)語(yǔ)“多潛能性”包括細(xì)胞分化為若干細(xì)胞類(lèi)型的能力，例如，對(duì)于來(lái)自中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞而言，多潛能性是指分化為諸如GFAP (星形膠質(zhì)細(xì)胞)>NESTIN(神經(jīng)祖細(xì)胞)、 TUJl (神經(jīng)元)的細(xì)胞的能力。術(shù)語(yǔ)“恢復(fù)階段”包括在處理之后，F(xiàn)Ll+細(xì)胞和FLltl細(xì)胞被轉(zhuǎn)移回干細(xì)胞培養(yǎng)基中。術(shù)語(yǔ)“復(fù)發(fā)”是指在用試劑處理之后，癌癥干細(xì)胞存活以保持其固有性質(zhì)(在FLl 通道中的自發(fā)熒光、球原性)、其分裂能力以及任選地保持其他性質(zhì)(例如通過(guò)分化標(biāo)記物的表達(dá)檢測(cè)的分化能力、通過(guò)干性標(biāo)記物的表達(dá)檢測(cè)的干性性質(zhì)以及使用氧化-還原比色法(MTS)通過(guò)NAD/NADPH+酶的活性和比率測(cè)定的代謝特性)的能力。復(fù)發(fā)的檢測(cè)通過(guò)本發(fā)明所述的篩選分析法來(lái)進(jìn)行，并包括在處理之后分析FLl+和FL1°細(xì)胞的存在及比例，如圖5所總結(jié)的。復(fù)發(fā)水平將以在恢復(fù)期期間存活的處理后的癌癥干細(xì)胞的比例為基礎(chǔ)并根據(jù)未觀察到癌癥干細(xì)胞復(fù)發(fā)的恢復(fù)期的長(zhǎng)度來(lái)評(píng)價(jià)。本文所用術(shù)語(yǔ)“有效量”是指根據(jù)本發(fā)明的至少一種化合物或其藥學(xué)制劑的量，所述能夠在目標(biāo)組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人體產(chǎn)生所要求的生物學(xué)或醫(yī)學(xué)響應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有效劑量是用于緩解要被治療的疾病或病癥的癥狀的“治療有效量”。這一術(shù)語(yǔ)在本文中還包括足以減輕疾病發(fā)展，特別是指緩解或抑制復(fù)發(fā)過(guò)程(例如妨礙復(fù)發(fā)的發(fā)生， 或降低復(fù)發(fā)過(guò)程的頻率或程度)，和/或引起并由此產(chǎn)生目標(biāo)所要求的響應(yīng)的活性化合物的量(例如“抑制有效量”)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)治療的“效用”，可以根據(jù)相應(yīng)于本發(fā)明的用法或方法的疾病過(guò)程中的變化來(lái)檢測(cè)。例如，根據(jù)本發(fā)明的治療的效用依賴(lài)于兩個(gè)條件-殺死FLl+細(xì)胞的能力，其通過(guò)10或20天后存活的FLl+細(xì)胞至少降低50%來(lái)測(cè)定；-FLl+細(xì)胞沒(méi)有恢復(fù)(r < 0. 2)，其通過(guò)治療后至少20天后存活的FLl+細(xì)胞的數(shù)量來(lái)測(cè)定。本發(fā)明治療的效用可通過(guò)患者狀況的改善以及本發(fā)明的治療對(duì)患者的積極影響來(lái)測(cè)定。術(shù)語(yǔ)“抑制癌癥干細(xì)胞復(fù)發(fā)的能力”是指試劑在處理之后以及處理后的恢復(fù)期的觀察之后能夠減少癌癥干細(xì)胞樣品中癌癥干細(xì)胞數(shù)量的性質(zhì)。優(yōu)選地，抑制癌癥干細(xì)胞復(fù)發(fā)的能力是指根除癌癥干細(xì)胞樣品中的癌癥干細(xì)胞并且在恢復(fù)期觀察之后避免這些細(xì)胞復(fù)發(fā)的能力。本文中可互換使用的術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤試劑”或“治療試劑”或“試劑”包括易于具有腫瘤治療活性例如在腫瘤治療中有效的分子或化合物，所述治療如降低或停止腫瘤的生長(zhǎng)、 預(yù)防、降低或停止腫瘤的復(fù)發(fā)。其包括已知的對(duì)癌癥具有治療活性的試劑或研究發(fā)現(xiàn)對(duì)腫瘤具有治療活性的試劑。術(shù)語(yǔ)“抗腫瘤試劑”或“治療試劑”或“試劑”還包括任何分子(如化學(xué)的，生物學(xué)的)或任何外部/環(huán)境因素(如機(jī)械的，輻射)。本文所用“治療”和“進(jìn)行治療”等一般表示獲得了期望的藥理學(xué)或生理學(xué)效果。 這些效果在防止或部分地防止諸如癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)的疾病、其癥狀和病癥方面可以是預(yù)防性的，和/或在部分或完全治愈疾病、病癥、癥狀或歸因于所述疾病的副作用方面可以是治療性的。本文所用術(shù)語(yǔ)“治療”覆蓋哺乳動(dòng)物特別是人類(lèi)中的所有治療，包括(a)防止疾病例如癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)在受試者中發(fā)生，所述受試者已經(jīng)進(jìn)行過(guò)治療，例如手術(shù)(切除或部分切除)、放療和/或化療，或可能有傾向患有疾病但還未被確診；(b)抑制疾病，例如癌癥(神經(jīng)膠質(zhì)瘤)，即阻止其發(fā)展；或緩解疾病，即引起疾病和/或其癥狀或病癥的復(fù)原。在本發(fā)明的情況下使用的術(shù)語(yǔ)“抑制劑”被定義為完全或部分抑制生物分子活性的分子。術(shù)語(yǔ)“線粒體活性抑制劑”被定義為氧化細(xì)胞能量制造過(guò)程的抑制劑，典型地，是有氧細(xì)胞代謝的抑制劑。氧化細(xì)胞能量制造過(guò)程抑制劑包括細(xì)胞三羧酸(TCA)或檸檬酸循環(huán)(碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)化學(xué)轉(zhuǎn)化為二氧化碳和水產(chǎn)生可使用形式的能量)的抑制劑，或細(xì)胞氧化(有氧)糖酵解(在細(xì)胞質(zhì)中由葡萄糖代謝為丙酮酸根)的抑制劑，或糖酵解底物(丙酮酸根)氧化磷酸化的抑制劑。典型地，線粒體活性抑制劑是在體外和體內(nèi)復(fù)發(fā)分析法中顯示阻斷電子傳輸鏈或氧化磷酸化導(dǎo)致產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(R0Q的能力的試劑。如本文所使用的，電子傳輸鏈活性的抑制劑，例如可以是二亞苯基碘氯化物(DPI) 或其衍生物。二亞苯基碘氯化物(DPI)與黃素蛋白牢固地結(jié)合，因此是若干重要的酶，包括一氧化氮合成酶(N0Q、NADPH-泛醌氧化還原酶、NADPH氧化酶和NADPH細(xì)胞色素P450氧化還原酶，的強(qiáng)力的特異性的抑制劑。優(yōu)選地，電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI) 和其衍生物。更有選地，電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)和/或復(fù)合物(III)活性的抑制劑。術(shù)語(yǔ)“線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)活性的抑制劑”包括抑制線粒體復(fù)合物I 活性的試劑。例如，氧化磷酸化復(fù)合物(I)的抑制劑包括在NADH脫氫酶結(jié)合位點(diǎn)與線粒體復(fù)合物 I 結(jié)合的試劑(Hogan & Singer，1967，Biochem. Biophys. Res. Commun.，27 (3) 356-60)，如魚(yú)藤酮，一種已知的殺蟲(chóng)劑，及其衍生物。魚(yú)藤酮衍生物包括芳基疊氮紫穗槐素(arylazidoamorphigenin)、螺留酮型擬魚(yú)藤酮、灰葉素、紫穗槐素、12a-羥基紫穗槐素、 12a-羥基達(dá)潘醇和6’ -O-D-吡喃葡萄糖基達(dá)潘醇(6’ -O-D-glucopyranosyldalpanol)?！熬€粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(III)活性的抑制劑”包括抑制線粒體復(fù)合物III活性的試劑。例如，氧化磷酸化復(fù)合物(III)的抑制劑包括抑制復(fù)合物III催化活性的抑制劑，如抗霉素A，一種已知的抗真菌劑，及其衍生物?？姑顾谹衍生物包括黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素的十三燒基類(lèi)似物(Hu 等，2008，^Tetrahedron letters, 49 (35) :5192-5195)。氧化磷酸化復(fù)合物(III)的抑制劑的其他實(shí)例包括任何二本西平衍生物，其是已知的抗抑郁藥，例如氯丙咪嗪，一種雙重血清素-去甲腎上腺素再攝入抑制劑(Anafranil )或其衍生物及類(lèi)似物，如丙咪嗪和氯丙嗪。丙咪嗪及其鹽酸鹽公開(kāi)于美國(guó)專(zhuān)利2，554，736，其噻嘧啶鹽公開(kāi)于在美國(guó)專(zhuān)利3，326，896。丙咪嗪及其鹽是口服活性的二本西平三環(huán)抗抑郁藥。 氧化磷酸化復(fù)合物(III)的抑制的其他劑實(shí)例有甘草查耳酮A、殼二孢氯素和嗜球果傘素 B(Strobilirubin B)0雙重血清素-去甲腎上腺素再攝入抑制劑(DSNRI)，其抑制血清素和去甲腎上腺素的再攝入，包括文拉法辛(Effexor )、文拉法辛代謝物0-去甲文拉法辛、氯丙咪嗪(Anafranil )、氯丙咪嗪代謝物去甲氯丙咪嗪(Cymbalta )、米那普侖和丙咪嗪 (Tofranil ⑧或 Janimine )。他們的化學(xué)名稱(chēng)、商品名稱(chēng)、結(jié)構(gòu)、治療學(xué)和藥理學(xué)信息以及治療種類(lèi)可以在文獻(xiàn)中找至IJ，例如 Merck Index，第九版 1976，Goodman & GiIman，The Pharmacological Basis of Therapeutics,第九版 1996,禾口 the Physician' s Desk Reference 2004。通常根據(jù)本發(fā)明，抑制劑抑制線粒體氧化磷酸化復(fù)合物(I)的活性或線粒體氧化磷酸化復(fù)合物(III)的活性。然而，一些抑制劑如標(biāo)樁菌素、黏噻唑菌醇、殺粉蝶菌素或其衍生物和類(lèi)似物可以同時(shí)抑制線粒體氧化磷酸化復(fù)合物(I)和復(fù)合物(III)的活性。上述雙重抑制劑可以是更強(qiáng)力的抑制劑，因此可以是需要較低濃度的更強(qiáng)的抗Gic試劑。表1列出了放療和化療或臨床試驗(yàn)中所使用的經(jīng)典試劑、所引用的文獻(xiàn)出處以及在體外復(fù)發(fā)分析法中所使用的計(jì)量。表2和3列出了靶向有氧/無(wú)氧途徑的試劑、所引用的文獻(xiàn)出處以及在體外復(fù)發(fā)分析法中所使用的計(jì)量。優(yōu)選地，線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)和/或(III)活性的抑制劑選自魚(yú)藤酮、 抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查爾酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。例如，線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)和(III)活性的抑制劑的所述組合包括魚(yú)藤酮與抗霉素A組合或者魚(yú)藤酮與氯丙咪嗪組合。最優(yōu)選地，線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)和/或(III)活性的抑制劑選自黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。術(shù)語(yǔ)“線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑”包括通常由底物可用性、內(nèi)源性和/或外源性的終產(chǎn)物來(lái)確定的化合物。線粒體TCA循環(huán)活性的抑制劑例如有NADH和ATP、檸檬酸鹽、 乙酰輔酶A、TCA的鈣抑制關(guān)鍵酶，例如異檸檬酸脫氫酶、α -酮戊二酸脫氫酶以及檸檬酸合成酶。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，線粒體TCA循環(huán)的活性可以由電子傳輸鏈的抑制劑間接地抑制，諸如選自魚(yú)藤酮、抗霉素Α、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查爾酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽的線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)和復(fù)合物(III)的抑制劑。
1權(quán)利要求
1.神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，所述抑制劑用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時(shí)間里， GIC的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，GIC的恢復(fù)低于0.2倍；3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的；并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑阻止由GIC產(chǎn)生能量。
2.如權(quán)利要求1所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的所述移除是神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的部分切除。
3.如權(quán)利要求2所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑以相當(dāng)于10倍IC2劑量的劑量施用。
4.如權(quán)利要求1或3所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述IC2劑量在0. 157mg/kg至0. 315mg/kg的范圍。
5.如權(quán)利要求1至4所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
6.如權(quán)利要求1至5所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)和/或復(fù)合物 (III)的活性抑制劑。
7.如權(quán)利要求6所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)和/或復(fù)合物(III)的活性抑制劑選自魚(yú)藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查耳酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。
8.如權(quán)利要求7所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所組合包括將魚(yú)藤酮與抗霉素A組合，或者將魚(yú)藤酮與氯丙咪嗪組I=I O
9.如權(quán)利要求6所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)和/或復(fù)合物(III)的活性抑制劑選自黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。
10.如權(quán)利要求1至9所述的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑，其中所述表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、 神經(jīng)鞘瘤、轉(zhuǎn)移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、少突星形細(xì)胞瘤、復(fù)發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥。
11.用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含至少一種如權(quán)利要求1至10 中任一項(xiàng)所述的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，以及一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體。
12.如權(quán)利要求11所述的用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/ 或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包含一種線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(I)的活性抑制劑和一種線粒體電子傳輸鏈復(fù)合物(III)的活性抑制劑的組合，以及一種或多種藥學(xué)可接受的稀釋劑或載體。
13.在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，所述方法包括施用治療有效量的電子傳輸鏈和/或線粒體TCA 循環(huán)的活性抑制劑，其中，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑最多20天的時(shí)間里， GIC的存活降低超過(guò)50% ；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，GIC的恢復(fù)低于0.2倍；3)在暴露于所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的；并且由此，所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑阻止由GIC產(chǎn)生能量。
14.如權(quán)利要求13所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的所述移除是神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體的部分切除。
15.如權(quán)利要求13至14所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述治療有效量為最多10倍 IC2劑量。
16.如權(quán)利要求15所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述IC2劑量在0. 157mg/kg至 0. 315mg/kg 的范圍。
17.如權(quán)利要求13至16所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述方法還包括，在施用治療有效劑量的所述電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑之前或之后用標(biāo)準(zhǔn)放療和 /或化療治療的步驟。
18.如權(quán)利要求13至17所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑是二亞苯基碘氯化物(DPI)及其衍生物。
19.如權(quán)利要求13至18所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述電子傳輸鏈和/或線粒體 TCA循環(huán)的活性抑制劑是線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物⑴和/或復(fù)合物(III)的活性抑制劑。
20.如權(quán)利要求19所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物 (I)和/或復(fù)合物(III)的活性抑制劑選自魚(yú)藤酮、抗霉素A、丙咪嗪、氯丙咪嗪、黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、嗜球果傘素b、甘草查耳酮A、殼二孢氯素、殺粉蝶菌素和/或它們的組合和/ 或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。
21.如權(quán)利要求20所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述組合包括將魚(yú)藤酮與抗霉素 A組合，或者將魚(yú)藤酮與氯丙咪嗪組合。
22.如權(quán)利要求20所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物 (I)和/或復(fù)合物(III)的活性抑制劑選自黏噻唑菌醇、標(biāo)樁菌素、殺粉蝶菌素和/或它們的衍生物和/或它們的藥學(xué)可接受的鹽。
23.如權(quán)利要求13至22所述的在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和 /或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法，其中所述表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤選自神經(jīng)膠質(zhì)瘤、神經(jīng)鞘瘤、轉(zhuǎn)移到腦組織的腫瘤、腦膜瘤、室管膜細(xì)胞瘤、 星形細(xì)胞瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少突星形細(xì)胞瘤、復(fù)發(fā)性癌癥和轉(zhuǎn)移性癌癥。
24.用于識(shí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使從腫瘤的細(xì)胞樣本中分離的FLl+細(xì)胞和正常腦細(xì)胞與帶篩選的抑制劑接觸，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的存活降低超過(guò)50%；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的恢復(fù)低于0.2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的。
25.用于識(shí)別神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的篩選方法，所述方法包括使原代神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞與所述待篩選的抑制劑接觸。
26.用于篩選神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑的試劑盒，所述抑制劑滿足以下條件1)在暴露于所述抑制劑最多20天的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的存活降低超過(guò)50%；2)在最多20天的恢復(fù)階段的時(shí)間里，F(xiàn)Ll+細(xì)胞的恢復(fù)低于0.2倍；3)在暴露于所述抑制劑期間和之后，正常腦細(xì)胞的存活是可持續(xù)和可恢復(fù)的；并且所述抑制劑在表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞的腫瘤的治療中有用，其中所述試劑盒包含原代CIC培養(yǎng)物、原代附著的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞、正常細(xì)胞以及選自魚(yú)藤酮和抗霉素A中至少一種線粒體電子傳輸鏈的復(fù)合物(I)或復(fù)合物(III)的活性的標(biāo)準(zhǔn)抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療腫瘤的化合物。更具體而言，本發(fā)明涉及神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)中電子傳輸鏈和/或線粒體TCA循環(huán)的活性抑制劑，所述抑制劑用于在進(jìn)行過(guò)神經(jīng)膠質(zhì)瘤實(shí)體先期移除的受試者中預(yù)防和/或治療表現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤起始細(xì)胞(GIC)的腫瘤的方法。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的抑制劑的藥物組合物，以及識(shí)別本發(fā)明的抑制劑的篩選方法。
文檔編號(hào)A61K31/352GK102439453SQ201080022077
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者伊萬(wàn)·拉多萬(wàn)諾維奇, 維吉妮·克萊門(mén)特 申請(qǐng)人:日內(nèi)瓦大學(xué), 日內(nèi)瓦大學(xué)醫(yī)院