專利名稱：：紅豆羰基還原酶、制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種紅豆羰基還原酶、制備方法和用途。利用紅豆(i^"WO/Ma"gw/aA(Willd.)W.F.Wight)中提取的羰基還原酶作為催化劑，不對稱還原前手性芳基酮制備手性芳基醇的綠色化學合成方法。本發(fā)明公開了酶催化劑的制備方法，以及利用紅豆粗酶作為催化劑不對稱還原前手性芳基酮的反應工藝。本發(fā)明所述的方法具有催化劑制備簡單、價格低廉、不妨礙生態(tài)環(huán)境、能耐受高濃度的底物、產物手性醇的光學純度高等優(yōu)點，是很有應用潛力的綠色化學合成方法。
背景技術：
：手性是自然界特別是有機體中普遍存在的重要特征。隨著對手性現象研究的深入，越來越多的單一對映體被應用于藥物、香精香料、農藥和液晶產品。手性醇的手性中心接有一個活潑的官能團"-OH",使該類物質成為許多手性產品合成時的關鍵中間體。芳基手性醇是許多藥物的的重要手性中間體，例如2-氯-1-苯乙醇，就是合成氟西汀(Fluoxetine)、托莫西汀(Tomoxetine)和尼索西汀(Nisoxetine)的重要前體。氟西汀(Fluoxetine)也是一種強效抗抑郁藥，而且對許多病癥，如焦慮、酒精中毒、慢性痛、肥胖、善饑、厭食均有很好的療效。托莫西汀(Tomoxetine)是首例去甲腎上腺素再攝取抑制劑，與a-或p-腎上腺能受體無強結合力，是一種抗抑郁藥，其(i)-(-)-異構體的藥效比其問-對映體高9倍。從前手性羰基化合物不對稱還原為手性醇，可以獲得100%的理論產率，具有重要的理論意義和應用前景。雖然化學催化已經取得了很大的進展，但生物催化以其高選擇性、安全性和環(huán)境相容性等優(yōu)點，已經引起了廣泛關注。生物催化還原反應在實際生產中還存在著底物耐受性較低、輔酶再生成本較高等復雜問題，使得目前在工業(yè)上獲得應用的氧化還原酶類催化劑的比率不足總量的14%。植物細胞或組織代表了對有機化合物進行生物轉化反應的重要方法。與其它生物催化劑相比，植物催化劑具有不易引起微生物污染、容易獲得、有的還可以食用等優(yōu)點，因此是更加綠色環(huán)保的生物催化劑。用生長的或固定化的植物細胞培養(yǎng)物催化生物還原反應已經有幾十年的歷史了，但是與其它生物催化劑一樣，現在仍然存在許多缺陷。在利用紅豆作為催化劑不對稱還原前手性芳基酮制備手性芳基醇的過程中，本發(fā)明人發(fā)現該方法具有催化劑制備簡單、價格低廉、不妨礙生態(tài)環(huán)境、耐受高底物濃度、產物手性醇的光學純度高等優(yōu)點，是非常有應用潛力的綠色化學合成方法。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種紅豆羰基還原酶；本方面的目的還一個一種上述的紅豆羰基還原酶的制備方法；本發(fā)明的另一目的是提供一種上述紅豆羰基還原酶的用途,即作為生物催化劑高對映選擇性催化還原高濃度前手性芳基酮制備高光學純度手性芳基醇的方法。本方面的紅豆羰基還原酶是從植物種子紅豆CP/o^o/wsa"gw/flni(Willd.)W.RWight)中采用下述的提取方法獲得a.將紅豆機械破碎為小顆粒，浸泡于去離子水，獲得粗酶液；b.加入丙酮使酶從粗酶中沉淀析出；c.過濾并干燥制備具有催化活力的酶粉。本方面的紅豆羰基還原酶的制備方法，包括下列步驟a.將紅豆機械破碎為小顆粒，浸泡于去離子水，獲得粗酶液；b.加入丙酮使酶從溶液中析出；c.過濾并干燥制備具有催化活力的酶粉。紅豆羰基還原酶的制備方法中，紅豆小顆粒與去離子水的重量比為l:52:5，浸取時間為1~24小時，優(yōu)選310小時。所述的浸取條件為30°C，160rpm。所述的丙酮是使用預冷至-20'C的丙酮進行沉淀，酶液與丙酮的體積比例為1:11:1.5。本發(fā)明的紅豆羰基還原酶的用途是將所述紅豆羰基還原酶的水溶液或緩沖溶液與芳基酮接觸，在適當條件下反應一定時間后，通過常規(guī)的分離方法提取，制備光學活性的手性化合物(5)-或(i)-芳基醇。上述的一種生物還原前手性芳基酮的方法，包括下列步驟a.將用上述方法制備的紅豆羰基還原酶，懸浮于添加了葡萄糖的緩沖溶液中；b.向上述緩沖溶液中加入芳基酮，經不對稱還原產生相應的光學純手性芳基醇；c.反應液經分離、純化得到目標產物-光學純(5>或(及>芳基醇。上述反應體系中所述粗酶粉濃度為10~200g(干重)/L。反應體系中所述芳基酮的濃度為10~200mmol/L。步驟b的反應溫度控制為20~50°C，反應時間為3~96小時。所述緩沖溶液為pH值為6-9的磷酸緩沖溶液。所述的緩沖溶液中添加質量濃度為1~10%的葡萄糖。上述反應體系中可加或不加入有機助溶劑，如果加入有機助溶劑，有機助溶劑的體積為反應體系體積1%~10%，所述有機助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞砜或二曱基甲酰胺中的一種或一種以上的混合物。上述步驟b中所述芳基酮結構通式為在化合物(l)中，R！可選自-Cl、^02或-0<:113，R2可自-CH3、-C2H5、-CH2C1或國CH2Br;在化合物(2)中，Ar可選為2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶或2-噻吩。還原的底物前手性芳基酮可選自苯環(huán)或芳香雜環(huán)的鄰、間、或者對位被取代的芳基酮，或者側鏈被取代的芳基酮。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明的技術內容作進一步的描述，其目的僅在于更好地理解本
發(fā)明內容，而非限制本發(fā)明的保護范圍。實施例l將紅豆(尸/zoyeo/wa"gw/w7、(Willd.)W.F.Wight)機械破碎為小顆粒后，稱取16g紅豆顆粒放入250mL三角燒瓶，浸泡于40mL去離子水，30°C,160rpm條件下浸取67小時，過濾或離心分離獲得粗酶液；用預冷至-20'C的丙酮，以酶液與丙酮的體積比例l:l進行沉淀，獲得粗酶；然后冷凍干燥獲得粗酶粉。實施例2取1g紅豆粗酶粉溶解于10mL磷酸緩沖液(100mM,pH7.0)中，添加5%葡萄糖和0.155g2-氯-l-苯乙酮(加5%v/v乙醇助溶)，在30。C，160rpm條件下反應6小時。反應結東后離心(8，000rpm，10min),收集上清液用乙酸乙酯萃取三次后，再加飽和NaCl溶液洗一次。取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜，減壓濃縮后使用硅膠柱層析(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯2:l10:l,v/v)后，真空干燥后得到產物("-2-氯-l-苯基乙醇。產物可用氣相色譜(釆用島津氣相色譜儀GC-14,手性毛細管柱SUPCOLDEX|3-120)測定其對映體過量值(e.e.)。收率74.8%;ee:99.3%;[a]D21=-58.3(c1.36，CHC13)。實施例3取1g紅豆粗酶粉溶解于10mL磷酸緩沖液(100mM，pH7.0)中，添加5%葡萄糖和0.199g2-溴-l-苯乙酮(加5%v/v乙醇助溶)，在30。C、160rpm條件下反應6小時。反應結東后離心(8,000rpm,10min)收集上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再用飽和NaCl溶液洗滌一次。取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜，減壓濃縮后使用硅膠柱層析(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯2:l10:l,v/v)純化，真空干燥獲得目標產物(i)-2-溴-l-苯基乙醇。產物可用氣相色譜(采用島津氣相色譜儀GC-14,手性毛細管柱SUPCOLDEXp-120)分析測定其對映體過量(e.e.)值。收率38.7%;ee:99.6%;[a]D21=—4L5(c1.00,CHC13)。實施例4取2g紅豆粗酶粉溶解于lOmL磷酸緩沖液(lOOmM，pH7.0)中，添加5%葡萄糖和0.120g苯乙酮(加5。/。v/v乙醇助溶)，在30。C、160rpm條件下反應72小時。反應結東后離心(8，000rpm,10min)收集上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加飽和NaCl溶液洗滌一次。取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜，減壓濃縮后使用硅膠柱層析(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯2:l10:l，v/v)后，真空干燥獲得目標產物(5)-l-苯基乙醇。產物可用氣相色譜(釆用島津氣相色譜儀GC-14,手性毛細管柱SUPCOLDEX卩-120)分析測定其對映體過量(e.e.)值。收率40.8%;ee:98.6%;[a]D21=-58.6(c1.00,CHC13)。實施例5取2g紅豆粗酶粉溶解于10mL磷酸緩沖液(IOOmM,pH7.0)中，添加5%葡萄糖和0.165g4'-硝基苯乙酮(加5%v/v乙醇助溶)，在30。C、160rpm條件下反應72小時。反應結東后離心(8,000rpm,10min)，收集的上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加飽和NaCl溶液洗滌一次。取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜，減壓濃縮后使用硅膠柱層析純化(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯2:1~10:1，v/v),經真空干燥獲得目標產物(5>1-(4，-硝基苯基)乙醇。產物可用氣相色譜(采用島津氣相色譜儀GC-14，手性毛細管柱SUPCOLDEXP-120)分析測定其對映體過量(e.e.)值。收率67.8%;ee:>99.9%;[a]D21=—27.5(c1.00,C2H5OH)。實施例6取2g紅豆粗酶粉溶解于10mL磷酸緩沖液(IOOmM,pH7.0)中，添加5%葡萄糖和0.121g4，-乙酰吡啶(加5%v/v乙醇助溶)，在3CTC、160rpm條件下反應24小時。反應結東后離心(8,000rpm,10min),收集的上清液，用乙酸乙酯萃取三次后，再加飽和NaCl溶液洗滌一次。取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜，減壓濃縮后使用硅膠柱層析純化(洗脫劑為石油醚/乙酸乙酯2:l10:l，Wv),再經真空干燥獲得目標產物(5)-l-(4'-吡咬)乙醇。產物可用氣相色譜(采用島津氣相色譜儀GC-14,手性毛細管柱SUPCOLDEX|3-120)分析測定其對映體過量(e.e.)值。收率47.3%;ee:>99.9%;[a]D21=—44.8(c1.32,C2H5OH)。實施例7-13取50mg紅豆粗酶粉溶解于0.5mL磷酸緩沖液(100mM,pH7.0)中，添加5。/。葡萄糖和下表所列的任一種底物酮(10mM,加P/。v/v乙醇助溶)，在30'C、1100rpm條件下反應一定時間。反應結東后離心(12，000rpm，5min),收集的上清液，用乙酸乙酯萃取兩次，取上層有機相，用無水Na2S04干燥過夜后，進行氣相色譜分析(采用島津氣相色譜儀GC-14,手性毛細管柱SUPCOLDEXP-120),測定產物含量和對映體過量(e.e.)值。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>本發(fā)明的主要優(yōu)勢在于1)所述方法能以高對映選擇性生物還原相對較高濃度的底物酮制備手性芳基醇。2)用作羰基還原酶提取原料的紅豆價格低廉而且容易獲得，且其粗酶的制備方法簡便易行。3)所述生物還原反應溫和、安全，對環(huán)境友好，且紅豆粗酶在反應之后可用作肥料。權利要求1.一種紅豆羰基還原酶，其特征是從植物種子紅豆(Phaseolusangularis(Willd.)W.F.Wight)中采用下述的提取方法獲得a.將紅豆機械破碎為小顆粒，浸泡于去離子水，獲得粗酶液；b.加入丙酮使酶從粗酶中沉淀析出；c.過濾并干燥制備具有催化活力的酶粉。2.—種如權利要求l所述的紅豆羰基還原酶的制備方法,包括下列步驟a.將紅豆機械破碎為小顆粒，在室溫下浸泡于去離子水，浸取的時間為1~24小時，紅豆小顆粒與去離子水的重量比為l:52:5,獲得粗酶液；b.加入丙酮使酶從粗酶液溶液中沉淀析出；粗酶液與丙酮的體積比例為1:11:1.5;c.過濾并干燥獲得具有催化活力的酶粉。3.根據權利要求2所述的紅豆羰基還原酶的制備方法，其特征在于步驟a中所述的紅豆顆粒在水中浸取的時間為3~10小時。4.根據權利要求2或3所述的紅豆羰基還原酶的制備方法，其特征在于所述的紅豆顆粒在水中浸取的條件為30°C,160rpm。5.根據權利要求2所述的催化劑的制備方法，其特征在于所述的丙酮是采用預冷過-20'C的丙S同進行沉淀,。6.—種根據權利要求1所述的紅豆酶的用途，其特征在于所述紅豆酶作為催化劑催化芳基酮合成光學活性的手性產品(5)-或(i)-芳基醇。7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于在205(TC和存在或不存在機助溶劑時，將所述紅豆酶的水溶液或懸浮于添加了葡萄糖的緩沖溶液與芳基酮經不對稱還原反應3~96小時，通過常規(guī)的分離、純化方法提取，獲得光學活性的手性產品(5)-或(i)-芳基醇；反應體系中紅豆還原酶的濃度為10-200g(干重)/L;所述芳基酮的濃度為10~200mmol/L。8.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的緩沖液為pH6~9的磷酸鹽緩沖溶液；所述的緩沖溶液中添加重量濃度為110%的葡萄糖。9.根據權利要求7所述的用途，其特征在于在反應體系中添加反應液體積1%~10%的有機助溶劑，所述有機助溶劑選自甲醇、乙醇、二甲基亞砜或二甲基甲酰胺中的一種一種以上的混合物。10.根據權利要求7所述的用途，其特征在于所述的芳基酮結構通式為(l)或(2)在化合物(l)中，R!可選自-C1、-N02或-OCH3,R2可選自-CH3、-C2H:-CH2Cl,-CH2Br;在化合物(2)中，Ar選自2-吡啶、3-吡啶、4-吡啶或2-噻吩。全文摘要本發(fā)明涉及一種利用紅豆(Phaseolusangularis(Willd.)W.F.Wight)作為催化劑，不對稱還原前手性芳基酮制備手性芳基醇的綠色合成方法。本發(fā)明公開了紅豆酶催化劑的制備方法，以及利用紅豆粗酶不對稱還原前手性芳基酮的生物催化反應工藝。本發(fā)明所公開的方法具有催化劑制備簡單、價格低廉、不妨礙生態(tài)環(huán)境、能耐受高底物濃度、產物手性醇的光學純度高等優(yōu)點，是很有應用潛力的綠色化學合成方法。文檔編號C12N9/02GK101358183SQ20081004242公開日2009年2月4日申請日期2008年9月3日優(yōu)先權日2008年9月3日發(fā)明者盧文芽,林國強,許建和,諺謝申請人:華東理工大學