專利名稱：提高臭曲霉ZU－G1發(fā)酵生產(chǎn)的α－半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種提高、改進(jìn)臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
豆制品及其功能性成分具有良好的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，且物美價(jià)廉，所以是各檔次餐桌上必不可少的食物，然而豆類所含的低聚糖卻不易被人體消化吸收，它們在腸道被細(xì)菌發(fā)酵，食用后會(huì)引起嗝氣、腹脹、腹痛等人體不適癥狀。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，α-半乳糖苷酶可以很好的解決這個(gè)問題，α-半乳糖苷酶可將低聚糖中的水蘇糖、棉籽糖、蜜二糖等水解，產(chǎn)生單糖，利于人體吸收和利用。
中國發(fā)明專利申請(qǐng)200610050135.4中公開了一種臭曲霉(Aspergillus foetidus)ZU-G1 CGMCC No.1628，可以用于生產(chǎn)α-半乳糖苷酶。該專利申請(qǐng)中也詳細(xì)描述了臭曲霉ZU-G1發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的方法。
但酶在具體應(yīng)用的過程中會(huì)出現(xiàn)保存期短，或者酶活性降低，這是因?yàn)槊富盍艽蟪潭壬弦蕾囉诿阜肿訕?gòu)象的穩(wěn)定性，酶分子的構(gòu)象和催化部位的微環(huán)境的變化均影響到酶的催化活力，周圍溫度和pH會(huì)導(dǎo)致酶的空間結(jié)構(gòu)破壞從而喪失其原有的生物活性。酶在純的溶液中比在不純的溶液中更易變性。α-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)與其熱穩(wěn)定性有直接相關(guān)性，周圍環(huán)境會(huì)影響實(shí)際應(yīng)用過程中作用效率。
國內(nèi)外研究者已對(duì)α-半乳糖苷酶的生產(chǎn)、應(yīng)用等技術(shù)問題進(jìn)行了初步研究與探索，但對(duì)該酶穩(wěn)定性的研究報(bào)道較少，缺乏液體α-半乳糖苷酶制劑有效應(yīng)用的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種提高臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性和pH耐受性的保護(hù)劑。
一種提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑，重量份組成為甘露醇 18～36棉籽糖 76～126海藻糖 38～95所述的保護(hù)劑，優(yōu)選重量份組成為甘露醇 25～30棉籽糖 90～110海藻糖 60～70所述的保護(hù)劑，最優(yōu)選重量份組成為甘露醇 27棉籽糖 101海藻糖 66優(yōu)選重量份組成的保護(hù)劑在高溫和酸性條件下，酶活的保留效果也更佳。
本發(fā)明中由海藻糖、甘露醇和棉籽糖構(gòu)成了能提高和延長臭曲霉ZU-G1發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性的保護(hù)劑，所用的保護(hù)劑無毒、來源廣，易于大規(guī)模使用。
本發(fā)明還提供了所述的保護(hù)劑在提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性中的應(yīng)用，向每100ml臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的粗酶液中加入所述保護(hù)劑132～257mg，優(yōu)選加入所述的保護(hù)劑175～210mg。
最優(yōu)選加入所述的保護(hù)劑194mg，此時(shí)保護(hù)劑中含甘露醇27mg、棉籽糖101mg和海藻糖66mg。
所述的粗酶液為按照中國發(fā)明專利申請(qǐng)200610050135.4中公開的方法得到的α-半乳糖苷酶發(fā)酵液，經(jīng)過離心分離、鹽析、透析等常規(guī)處理后得到的α-半乳糖苷酶粗酶液。
采用本發(fā)明的保護(hù)劑，使得臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶在30℃～60℃酶活保留率提高11.6％～21.7％，耐酸性從pH4.0下降到pH3.0，在pH3.0的環(huán)境中仍保留52％的活性，提高了α-半乳糖苷酶的最大作用效率，拓寬了該酶在酸性環(huán)境中的應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法處理、保存的酶使用安全，可作為食品級(jí)及飼料級(jí)的添加劑。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)α-半乳糖苷酶粗酶液按照中國發(fā)明專利申請(qǐng)200610050135.4中公開的方法，發(fā)酵培養(yǎng)基30ml盛于250ml三角瓶中，接入1ml臭曲霉ZU-G1孢子(濃度為1×106個(gè)/ml)，在轉(zhuǎn)速為200rpm的搖床上28℃培養(yǎng)96h小時(shí)后獲得的α-半乳糖苷酶發(fā)酵液。發(fā)酵液用冷凍離心機(jī)離心15min，轉(zhuǎn)速為8000rpm，收集上清液并對(duì)其用硫酸銨分級(jí)鹽析(硫酸銨飽和度20％-70％)，然后收集沉淀，用少量pH5.0的0.2mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液溶解，裝入透析袋，蒸餾水透析數(shù)小時(shí)(4℃)，直至透析袋外液檢測不到硫酸根離子為止，透析袋內(nèi)的即為α-半乳糖苷酶粗酶液。
實(shí)施例2～10在實(shí)施例1中得到的粗酶液(酶活大約100U/ml)中加入本發(fā)明的保護(hù)劑；每100ml粗酶液中甘露醇、海藻糖和棉籽糖的使用比例見表1，粗酶液加入本發(fā)明的保護(hù)劑后于60℃水浴1h，立即冰浴，稀釋100倍后測定其酶活力。其中海藻糖由上海源聚生物科技有限公司生產(chǎn)；甘露醇由廣東臺(tái)山化工廠生產(chǎn)，棉籽糖由美國Amresco公司生產(chǎn)。
表1


經(jīng)方差分析表明保護(hù)劑的最佳配方為甘露醇與粗酶液的重量體積比為27.33mg/100ml，海藻糖與粗酶液的重量體積比為66.15mg/100ml，棉籽糖與粗酶液的重量體積比為100.8mg/100ml。
實(shí)施例11 不同溫度條件下使用本發(fā)明保護(hù)劑提高α-半乳糖苷酶熱穩(wěn)定性的實(shí)驗(yàn)以4℃放置的未作熱處理未加保護(hù)劑的酶活保留率計(jì)為100％，將加入保護(hù)劑的臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶與未加保護(hù)劑的對(duì)照組在不同的溫度下熱處理不同的時(shí)間后所得的酶活保留率做了對(duì)比，本實(shí)驗(yàn)中每100ml的粗酶液中加入27mg甘露醇、66mg海藻糖和101mg棉籽糖。具體結(jié)果見表2所示。
表2

粗酶液加入本發(fā)明的保護(hù)劑于60℃水浴1h后立即冰浴，稀釋100倍后測定其酶活力。實(shí)驗(yàn)表明在30℃～60℃，本發(fā)明方法處理后的α-半乳糖苷酶的酶活保留率提高11.6％～21.7％。
實(shí)施例12 不同pH值對(duì)α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性影響的實(shí)驗(yàn)以4℃放置的未作熱處理未加保護(hù)劑的酶活保留率計(jì)為100％，利用加有保護(hù)劑的臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶粗酶液與未加保護(hù)劑的參照組在不同pH下，28℃放置24h后所得的酶活保留率做了對(duì)比實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)中每100ml的粗酶液中加入27mg甘露醇、66mg海藻糖和101mg棉籽糖。具體結(jié)果見表3所示。
表3

-沒有檢測到酶活實(shí)驗(yàn)表明對(duì)照組以pH5.0的酶活保留率最高，在pH3.0時(shí)檢測不到酶活；而添加保護(hù)劑組以pH4.0的酶活保留率最高，在pH3.0時(shí)酶活保留率仍然較高(52％)，這利于該酶在酸性環(huán)境中的應(yīng)用。
實(shí)施例13 α-半乳糖苷酶的貯存壽命計(jì)算運(yùn)用加速試驗(yàn)計(jì)算了臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶的貯存壽命，即在28℃、36.2℃和45℃時(shí)，酶活性損失50％需要的時(shí)間分別為對(duì)照組為40.9天、23.3天和7.79天；本發(fā)明為89.5天、38.4天和8.4天。
說明本發(fā)明能延長臭曲霉ZU-G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶的貯存期，貯藏溫度越低越利于酶的保存。
權(quán)利要求
1.一種提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑，其特征在于重量份組成為甘露醇18～36棉籽糖76～126海藻糖38～95
2.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑，其特征在于重量份組成為甘露醇25～30棉籽糖90～110海藻糖60～70
3.如權(quán)利要求1所述的保護(hù)劑，其特征在于重量份組成為甘露醇27棉籽糖101海藻糖66
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的保護(hù)劑在提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性中的應(yīng)用，其特征在于向每100ml臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的粗酶液中加入所述保護(hù)劑132～257mg。
5.如權(quán)利要求4所述的保護(hù)劑在提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性中的應(yīng)用，其特征在于向每100ml臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的粗酶液中加入所述的保護(hù)劑175～210mg。
6.如權(quán)利要求5所述的保護(hù)劑在提高臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶穩(wěn)定性中的應(yīng)用，其特征在于向每100ml臭曲霉ZU-G1α-半乳糖苷酶的粗酶液中加入所述的保護(hù)劑194mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高、改進(jìn)臭曲霉ZU－G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α－半乳糖苷酶穩(wěn)定性的保護(hù)劑，重量份組成為甘露醇18～36；棉籽糖76～126；海藻糖38～95。使用時(shí)向每100ml臭曲霉ZU－G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α－半乳糖苷酶的粗酶液中加入保護(hù)劑130～260mg。采用本發(fā)明保護(hù)劑，使得臭曲霉ZU－G1液體發(fā)酵生產(chǎn)的α－半乳糖苷酶在30℃～60℃酶活保留率提高11.6％～21.7％，耐酸性從pH4.0下降到pH3.0，在pH3.0的環(huán)境中任保留52％的活性，提高了α－半乳糖苷酶的最大作用效率，拓寬了該酶在酸性環(huán)境中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/38GK101016539SQ20071006687
公開日2007年8月15日 申請(qǐng)日期2007年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月23日
發(fā)明者劉彩琴, 何國慶, 傅偉, 陳啟和, 阮暉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)