專利名稱：改進(jìn)的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)背景本發(fā)明涉及一種改進(jìn)的發(fā)酵培養(yǎng)基以及利用該培養(yǎng)基制備脂族多羧酸的方法。
長(zhǎng)鏈-α、ω-二羧酸，即那些具有9個(gè)或9個(gè)以上碳原子的二羧酸，被用作合成多種化學(xué)產(chǎn)物和聚合物的原料。
碳原子數(shù)大于4的二羧酸目前幾乎僅僅是通過非生物學(xué)轉(zhuǎn)化的方法來生產(chǎn)。這類型生產(chǎn)二羧酸的化學(xué)方法具有一定的局限性和缺點(diǎn)。每種方法只限于生產(chǎn)以所用起始物為基礎(chǔ)的特定碳鏈長(zhǎng)度的二羧酸。例如，十二烷二酸方法起始于丁二烯，因此該反應(yīng)方法的產(chǎn)物只限于鏈長(zhǎng)為4的倍數(shù)的酸。另外，該方法基于非再生的石化產(chǎn)品原料，并且多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生不需要的副產(chǎn)物、重金屬廢料和氧化氮，其中所述副產(chǎn)物導(dǎo)致產(chǎn)率下降，所述氧化氮肯定會(huì)在還原加熱爐中被破壞。
生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)二羧酸的方法與現(xiàn)有非生物轉(zhuǎn)化方法相比具有許多潛在的優(yōu)點(diǎn)。其中主要優(yōu)點(diǎn)是可再生原料作為起始物的用途以及能夠在不產(chǎn)生有害化學(xué)副產(chǎn)物的情況下生產(chǎn)二羧酸，所述副產(chǎn)物增大了廢物處理的成本。
通過利用一種生物學(xué)方法所獲得的另一個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)是可以比較容易地對(duì)方法進(jìn)行修改以便能夠利用相同的生物催化劑和相同的設(shè)備生產(chǎn)出更多種類的二羧酸。由于目前的有機(jī)化學(xué)合成方法僅適合于單一二羧酸的生產(chǎn)，幾種不同二羧酸的合成需要針對(duì)每種二羧酸建立一種新的合成路線。另一方面，利用相同的設(shè)備、培養(yǎng)基和方案，僅僅通過給酵母菌提供不同的底物就可以使用一種酵母生物催化劑來生產(chǎn)不同長(zhǎng)度的二羧酸。
其全部?jī)?nèi)容被引入作為參考的美國(guó)專利US6,004,784記載了一種半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基利用玉米漿和啤酒酵母抽提物來降低傳統(tǒng)發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，所述傳統(tǒng)培養(yǎng)基含有昂貴的、標(biāo)準(zhǔn)化程度高的酵母抽提物和酵母氮基質(zhì)。
利用廉價(jià)替代物帶來的問題是多方面的。結(jié)果使得發(fā)酵液在被空氣霧化時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈的氣味。含在玉米漿和酵母粗提物中的微粒物質(zhì)，尤其是結(jié)合了高濃度細(xì)菌的微粒物質(zhì)給滅菌帶來了很大的困難并且給培養(yǎng)基滅菌設(shè)備帶來了生物負(fù)荷。這些替代物還含有許多帶來顏色穩(wěn)定性問題的不可代謝組分，從而需要采用附加的純化步驟，結(jié)果導(dǎo)致現(xiàn)有產(chǎn)物的損失。為了降低培養(yǎng)基成本而對(duì)這些替代物進(jìn)行的選擇增加附加的工藝成本。因此，仍然需要一種低成本的生物發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為作為生物催化劑的酵母提供維持生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)成分以便高度特異性地產(chǎn)生多羧酸、多元醇和多羥基酸。
本發(fā)明還涉及一種制備多羧酸、多元醇和多羥基酸的方法，該方法包括(a)提供一種能夠產(chǎn)生多羧酸、多元醇和多羥基酸的微生物；(b)提供一種能被所述微生物轉(zhuǎn)化為一種多羧酸、多元醇或多羥基酸的底物；(c)提供一種含有下列成分的培養(yǎng)基(i)一種可代謝的碳源和能源；(ii)一種無機(jī)氯源；(iii)一種磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素、過渡金屬元素及其混合物的金屬元素；和(v)一種基本不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源；和(d)在所述培養(yǎng)基中對(duì)所述微生物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
通過對(duì)維持物生物生長(zhǎng)的選擇營(yíng)養(yǎng)成分的精確選擇，本發(fā)明提供了一種利用一種生物轉(zhuǎn)化方法能夠大量商業(yè)化生產(chǎn)多功能重要物質(zhì)的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供了一種低成本的取代現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基的替代物及其使用方法，該培養(yǎng)基的制備和滅菌簡(jiǎn)單，氣味不重，在后續(xù)的下游工藝過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)較少，結(jié)果使得產(chǎn)物的產(chǎn)量至少與現(xiàn)有技術(shù)的常規(guī)方法的產(chǎn)率一樣高。
令人驚奇地是，包括玉米漿和酵母抽提物的多種未知成分能被較少的幾種成分所代替而沒有降低微生物的生長(zhǎng)和多功能化合物的產(chǎn)率。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠方便地對(duì)多種類型的有機(jī)底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。該發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列必需成分(i)一種可代謝的碳源和能源；(ii)一種無機(jī)氮源；(iii)一種磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素及其混合物的金屬元素；和(v)一種基本不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。這些物質(zhì)單獨(dú)滿足了微生物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)要求因而產(chǎn)生的生物物質(zhì)的量和質(zhì)量足以進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。
合適的可代謝的碳源和能源包括但不限于葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、醋酸鈉、甲醇、短鏈醇類物質(zhì)及其混合物。優(yōu)選的可代謝的碳源和能源是葡萄糖，優(yōu)選地是一種液體葡萄糖漿，例如95％的葡萄糖漿等同物，或者濃度較低的葡萄糖漿等同物。這種物質(zhì)含有少量的在發(fā)酵過程中能被補(bǔ)加的淀粉酶類如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶水解的二糖、三糖和多糖。因此，葡萄糖可以通過與生物氧化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)本身來提供。
無機(jī)氮源包括但不限于堿金屬硝酸鹽如硝酸鈉或硝酸鉀，銨鹽如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和醋酸銨。優(yōu)選的無機(jī)氮源是氨或氫氧化銨。
本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基的另一種必需成分是一種磷酸鹽源，該磷酸鹽包括含有任何磷酸鹽的化合物。其實(shí)例包括但不限于磷酸鉀、磷酸鈉和磷酸銨。一種用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的磷酸鹽是磷酸鉀。
在本發(fā)明培養(yǎng)基中使用的合適金屬元素包括堿金屬元素、堿土金屬元素、過渡金屬元素及其混合物。特別優(yōu)選的金屬元素包括混合的鉀、鈣和鎂。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基的最后一個(gè)關(guān)鍵組分是基本上不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素。
任何培養(yǎng)基成分可以作為初始滅菌培養(yǎng)基裝料的一部分來加入，作為用于以后加入到培養(yǎng)基中的濃縮水溶液來進(jìn)行滅菌，或者以過量的形式包含在用于轉(zhuǎn)移到生產(chǎn)發(fā)酵罐中的種子培養(yǎng)液中。
為了避免有關(guān)的氣味散發(fā)、顏色不穩(wěn)定性和污染問題，所述生物素必須不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌，因?yàn)樗鑫⒘Ｎ镔|(zhì)和細(xì)菌促使這類問題的出現(xiàn)并且需要附加的純化步驟。生物素的需要量要比它在現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)基中取代的有機(jī)氮源低幾個(gè)數(shù)量級(jí)。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基水溶液含有(a)約10g/l至約60g/l，優(yōu)選地約20g/l至約40g/l的可代謝的碳源和能量，優(yōu)選地是葡萄糖；(b)約50ppm至約2000ppm，優(yōu)選地約50ppm至約250ppm，和最優(yōu)選地約100ppm至約250ppm的由無機(jī)氮源提供的氮；(c)約1g/l至約10g/l，優(yōu)選地約1g/l至約7g/l的一種磷酸鹽，優(yōu)選地是磷酸鉀；(d)約0.01g/l至約2g/l，優(yōu)選地約0.01g/l至約1g/l的至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素及其混合物的金屬元素，優(yōu)選地是鈣和鎂的混合物；和(e)約1μg/l至約2000μg/l，優(yōu)選地約4μg/l至約200μg/l，和最優(yōu)選地約4μg/l至約20μg/l的生物素，其中所述生物素基本不含有害的微粒物質(zhì)和細(xì)菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基中的水可以是通過蒸餾純化、去離子或軟化處理得到的純水。優(yōu)選地水包括那些來源于分配系統(tǒng)的城市用水、一種加工再循環(huán)蒸汽或井水，其中無機(jī)物含量的調(diào)節(jié)應(yīng)該考慮到這些水源中已有的無機(jī)物含量。例如，含有其它所需成分的水可能已經(jīng)含有足以提供所述微生物生長(zhǎng)所需的全部或基本上全部的無機(jī)物成分。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基滿足了所述微生物生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)需求，從而有機(jī)和無機(jī)成分的加入量降低到最低程度，所述成分需要從作為廢物處理的產(chǎn)物中分離并且產(chǎn)生氣味。與本技術(shù)領(lǐng)域中已知的發(fā)酵培養(yǎng)基組合物相反，本發(fā)明的培養(yǎng)基不含微粒物質(zhì)，特別是能夠在自動(dòng)培養(yǎng)基分離過程中進(jìn)行連續(xù)滅菌并且價(jià)格便宜。盡管本發(fā)明提供的是貧營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，但在培養(yǎng)基配制過程中具有廣泛的適用性從而獲得高產(chǎn)率的多羧酸、多元醇和多羥基羧。
各種輔助成分也可以被用于本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基以便進(jìn)一步促進(jìn)生物發(fā)酵過程。其實(shí)施例包括但不限于各種類型的痕量金屬、螯合劑、抗泡劑等。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基可與任何產(chǎn)生多羧酸、產(chǎn)生多元醇、產(chǎn)生多羥基酸的酵母菌以及多種底物一起使用。例如，在所需產(chǎn)物是一種多羧酸如二酸的情況下，可以使用任何類型的脂肪酸、脂肪酸酯或鏈烷烴底物。用于生產(chǎn)二酸的合適底物包括，但不限于月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、棕櫚油酸及其甲酯，及其混合物。鏈烷烴的實(shí)例包括十二烷、十二碳烯、十三烷、十四烷、十八烷等。
因此，本發(fā)明另一方面提供了一種制備多羧酸、多元酸或多羥基酸的方法。僅僅為了舉例說明的目的，本發(fā)明的方法將通過參考制備作為所需終產(chǎn)物的多羧酸，尤其是二酸的方法來進(jìn)行描述。
所述方法可以在任何所述微生物能生長(zhǎng)并能催化所需轉(zhuǎn)化反應(yīng)的pH范圍內(nèi)進(jìn)行操作。優(yōu)選的和特別有利的pH范圍是酸性的情況，即pH大約為7或低于7。而低pH能被用于任何發(fā)酵過程，尤其有利地是被用于生產(chǎn)多羧酸的發(fā)酵過程。合適的pH調(diào)節(jié)劑是氨、氫氧化銨溶液，濃縮的氫氧化鉀或氫氧化鈉。
所述有機(jī)底物可以是任何可生物氧化成單-或多羧酸的有機(jī)化合物。這種化合物可以是飽和的或非飽和的脂族化合物或任何具有至少一個(gè)末端甲基、一個(gè)末端羧基和/或一個(gè)通過生物氧化可被氧化成羧基的末端功能基團(tuán)的碳環(huán)或雜環(huán)芳香化合物。一個(gè)為羧基衍生物的末端功能基團(tuán)可以存在于底物分子中并且可以通過非生物氧化反應(yīng)被轉(zhuǎn)化成一種羧基。例如，一種脂酶，例如可以在發(fā)酵步驟中被加入以便從另一種不可代謝的酯中釋放出游離脂肪酸來。
鏈烷烴是一種在本發(fā)明方法操作過程中使用的飽和形式的有機(jī)底物。所述鏈烷烴可以是線性的或環(huán)狀的，支鏈的或直鏈的，取代的或未被取代。特別優(yōu)選的鏈烷烴是那些具有約4至約25個(gè)碳原子的鏈烷烴，其實(shí)例包括但不限于丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十八烷等。
可以用于本發(fā)明方法中的非飽和有機(jī)底物的實(shí)例包括但不限于內(nèi)烯烴如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；非飽和的羧酸如2-己烯酸及其酯、包括油酸相對(duì)含量高的甘油三酯在內(nèi)的油酸及其酯，包括芥酸相對(duì)含量高的甘油三酯在內(nèi)的芥酸及其酯，包括蓖麻油酸相對(duì)含量高的甘油三酯在內(nèi)的蓖麻油酸及其酯，包括亞油酸相對(duì)含量高的甘油三酯在內(nèi)的亞油酸及其酯；非飽和醇如3-己烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；非飽和的醛如3-己烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。除了上述底物外，可以用于本發(fā)明的底物還包括具有至少一個(gè)內(nèi)碳-碳雙鍵和至少一個(gè)末端甲基，一個(gè)末端羧基和/或一個(gè)通過生物氧化可被氧化成羧基的末端功能基團(tuán)的脂環(huán)化合物。這種化合物的實(shí)例包括但不限于3，6-二甲基-1，4-環(huán)己二烯；3-甲基環(huán)己烯；3-甲基-1，4環(huán)己二烯等。
可以被用于本發(fā)明方法中的芳香化合物實(shí)例包括但不限于芳烴如鄰-、間-、對(duì)-二甲苯；鄰-、間-、對(duì)-甲基苯甲酸；二甲基吡啶等。所述有機(jī)底物還可含有其它的可被生物氧化為羧基的功能基團(tuán)如醛基或醇基。所述有機(jī)底物還含有其它的不能被生物氧化成羧基和不受生物氧化干擾的功能基團(tuán)如鹵素、醚等。
在發(fā)酵階段當(dāng)所述培養(yǎng)物處于將底物氧化成產(chǎn)物的活躍期時(shí)可以向培養(yǎng)物中提供一種輔助底物。尤其是當(dāng)由底物反應(yīng)本身不能得到最終可利用的碳源和能源時(shí)，那么這種碳源和能源可以由輔助底物來提供。
所述輔助底物是一種可發(fā)酵的碳水化合物如葡萄糖、果糖或麥芽糖；或其它可發(fā)酵的有機(jī)化合物，例如甘油、醋酸鈉、甲醇或短鏈醇類化合物；或其混合物。優(yōu)選的輔助底物是葡萄糖，優(yōu)選地是一種液體葡萄糖漿，例如，96％葡萄糖漿等同物，甚至濃度較低的葡萄糖漿等同物。這種物質(zhì)含有少量的二糖、三糖和多糖，所述多糖在發(fā)酵過程中能被加入的淀粉酶如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶所水解。這種葡萄糖可以由與上述氧化反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行的反應(yīng)本身來提供。
如果用來培養(yǎng)生物物質(zhì)的碳源和能源與被用來促進(jìn)氧化轉(zhuǎn)化反應(yīng)的輔助底物相同，那么它是合適的，但并不是絕對(duì)必要。實(shí)際的好處是只有較少的原料需要進(jìn)行處理并且可以對(duì)各種發(fā)酵步驟進(jìn)行合理的組合。因此，一種單一輔助底物的滅菌和傳輸系統(tǒng)可以被用來傳輸用來培養(yǎng)生物物質(zhì)的碳源和能源和用促進(jìn)氧化反應(yīng)的輔助底物。
可以用于本發(fā)明的微生物是任何能生物氧化本文所定義的底物的微生物。所微生物可以是任何其中β氧化反應(yīng)通過裂解、鈍化或缺失一個(gè)或多個(gè)酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的微生物；任何其中β氧化反應(yīng)通過裂解、鈍化或缺失一個(gè)或多個(gè)酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的酵母菌；任何其中β氧化反應(yīng)通過裂解、鈍化或缺失一個(gè)或多個(gè)酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的念珠菌屬菌株。如發(fā)酵過程涉及底物轉(zhuǎn)化為羧酸的生物氧化，所述微生物通常是一種酵母菌。這樣一種微生物以下列方式氧化底物所形成的單-和/或二羧酸不再通過導(dǎo)致鏈縮短的降解反應(yīng)而被進(jìn)一步氧化。然而，本發(fā)明的方法涉及任何微生物的使用。
美國(guó)專利US5,254,466中列出了在作為碳源的鏈烷烴或脂肪酸上被培養(yǎng)時(shí)分泌作為副產(chǎn)物的α、ω二羧酸的已知酵母菌菌株，其全部?jī)?nèi)容被本文引用作為參考。這些菌株是部分或完全氧化阻斷的菌株；即，它們被進(jìn)行了遺傳修飾因而其染色體基因POX4A，POX4B和POX5基因已被裂解。由于競(jìng)爭(zhēng)性β-氧化途徑由于POX基因被裂解而在功能上被鈍化，所以該菌株中的底物流取向于ω-氧化途徑。一種氧化完全阻斷的菌株是一種美國(guó)專利U.S.5,254,466中記載的熱帶假絲酵母菌株，菌株H5343(ATCC 20962)。
另一種合適的菌株是一種其中一種或多種還原酶基因被擴(kuò)增了的菌株，結(jié)果由于P450基因擴(kuò)增而增加了限速ω-羥化酶的量以及流經(jīng)ω-氧化途徑的底物速率。選擇性地增加已知對(duì)脂肪酸氧化是非常重要的酶的量的菌株也是優(yōu)選的。這種菌株含有拷貝數(shù)增加的CYP和CPR基因。這些基因已被鑒定為是與ω-羥化酶復(fù)合物產(chǎn)生有關(guān)的那些基因，所述ω-羥化酶復(fù)合物催化氧化途徑中的第一個(gè)步驟。菌株HDC1是一種含有多拷貝數(shù)的CYP 52A2A基因的菌株實(shí)例，所述基因已被整合到菌株H5343的基因組中。該菌株及其類似菌株被記載在1998年1月5日申請(qǐng)的懸而未決專利申請(qǐng)60/083,798中，其全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考?？梢杂糜诒景l(fā)明方法的其它菌株是如PCT/US99/20797中所記載的熱帶假絲酵母菌株HDC1，HDC5，HDC10，HDC15，HDC20，HDC23，HDC23-1，HDC23-2和HDC23-3，其全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考。
合適的無機(jī)氮源包括任何含銨化合物。其實(shí)例包括但不限于堿金屬硝酸鹽或銨鹽如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和醋酸銨。優(yōu)選的氮源是銨鹽或通過微生物的代謝作用而產(chǎn)生氨的化合物如脲。一種用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的氮源是氨。
所述發(fā)酵方法可以通過利用甘油酸酯脂肪或油作為有機(jī)氮源和輔助底物來進(jìn)行修改。與發(fā)酵液一起配制的一種脂酶將所述脂肪或油水解或裂解成脂肪酸和甘油。如果提供將游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為其相應(yīng)二酸所必需的能源，微生物通過消耗甘油來促進(jìn)裂解反應(yīng)的完成。尤其優(yōu)選的是油特異性脂酶。油特異性脂酶對(duì)油酸含量高的甘油三酯具有高度的選擇性并且選擇性地催化油酸酯基團(tuán)的水解。這種油特異性脂酶的實(shí)例包括但不限于由假單胞菌屬、胎毛腐質(zhì)菌(Humicolalanuginosa)、皺摺假絲酵母、白地霉和假單胞菌(Burkholderia)。一種特別優(yōu)選的脂酶是美國(guó)專利US5,470,741中記載的來源于白地霉ATCC 74170的UNLipase，該專利的全部?jī)?nèi)容被引入本文中作為參考。
所述發(fā)酵步驟優(yōu)選地分為三個(gè)階段進(jìn)行，生長(zhǎng)期、誘導(dǎo)期和轉(zhuǎn)化期。每一階段可以在相同或不同的溫度、pH、通氣等發(fā)酵罐條件下進(jìn)行。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)物被接種到發(fā)酵罐中時(shí)則開始了生長(zhǎng)期繼而引發(fā)快速生長(zhǎng)期。取決于所用培養(yǎng)基的組成，生長(zhǎng)可以呈指數(shù)生長(zhǎng)形式或呈接近指數(shù)生長(zhǎng)的形式。這種生長(zhǎng)一直持續(xù)到培養(yǎng)物達(dá)到線性生長(zhǎng)階段，該線性生長(zhǎng)階段通過測(cè)定氧消耗減少來確定。當(dāng)生長(zhǎng)受到培養(yǎng)基的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分添加速率的限制時(shí)就開始了線性生長(zhǎng)階段；因此生長(zhǎng)變得與限制性營(yíng)養(yǎng)成份的補(bǔ)加速率成比例。通常，在本發(fā)明的方法中，關(guān)鍵性的營(yíng)養(yǎng)成分是輔助底物。第二階段是誘導(dǎo)期。在誘導(dǎo)期中主要代謝活性被啟動(dòng)從而開始了底物向所需產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化。誘導(dǎo)培養(yǎng)物前所述培養(yǎng)物可以被維持一段時(shí)間的線性生長(zhǎng)期。誘導(dǎo)劑通常是底物本身，但對(duì)于不能啟動(dòng)其本身轉(zhuǎn)化的化合物來說，可以使用另一種與底物協(xié)同作用的誘導(dǎo)劑。所述誘導(dǎo)期可以被用來將快速生長(zhǎng)期過渡到轉(zhuǎn)化期。所述發(fā)酵進(jìn)入下一期，即轉(zhuǎn)化期，此時(shí)所述底物被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物。
在轉(zhuǎn)化期中，所述發(fā)酵液處于pH為2至7的酸性范圍。優(yōu)選的操作pH范圍從約3.5至7.0，更優(yōu)選的范圍是約5.0至約6.5?？梢酝ㄟ^自動(dòng)滴加強(qiáng)堿來調(diào)控pH，所述強(qiáng)堿的實(shí)例是氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化銨溶液或氨氣。解釋一下，通過在該狀態(tài)下進(jìn)行的發(fā)酵與現(xiàn)有技術(shù)中的方法相比，因?yàn)榘狈磻?yīng)后形成非揮發(fā)性的水性銨離子，所以可以使用氨來調(diào)控pH。如果在堿性pH條件下操作，現(xiàn)有技術(shù)中制備多羧酸的方法不能有效地形成水性銨離子因而引起排除氣體中含有不希望有的氨氣和發(fā)酵液中毒性氨的積累。所述發(fā)酵可以在26℃至40℃的溫度下進(jìn)行。
在第一個(gè)階段中，培養(yǎng)基被接種上β-氧化阻斷型微生物如β-氧化阻斷型熱帶假絲酵母菌菌株的活化培養(yǎng)物從而開始了快速指數(shù)生長(zhǎng)。所述培養(yǎng)基的pH通過添加堿，例如包括但不限于氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨氣來進(jìn)行調(diào)控。加入發(fā)酵罐中的輔助底物優(yōu)選地是在轉(zhuǎn)化期以補(bǔ)料的形式添加。指數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)束是通過葡萄糖的耗盡、溶氧的快速增加，以及最靈敏地是通過排放氣體中的氧的快速增加和CO2的減少來作為標(biāo)志。在沒有誘導(dǎo)底物存在的情況下，生物物質(zhì)將以與葡萄糖補(bǔ)加速率成比例的速率(即，線性生長(zhǎng))繼續(xù)積累。理想的是在指數(shù)生長(zhǎng)結(jié)束時(shí)或在達(dá)到所需生物物質(zhì)的濃度時(shí)啟動(dòng)轉(zhuǎn)化期。如果生產(chǎn)罐的氧傳遞特性使得所需生物物質(zhì)濃度通過將培養(yǎng)物維持在指數(shù)生長(zhǎng)期來達(dá)到，那么指數(shù)生長(zhǎng)期與隨后的線性葡萄糖-限制生長(zhǎng)期(誘導(dǎo)期)的結(jié)合可以被用來獲得指定的生物物質(zhì)濃度。
在向受葡萄糖限制的線性生長(zhǎng)期過渡的過程中，為了維持培養(yǎng)物的良好生長(zhǎng)狀態(tài)，可能需要在生長(zhǎng)過程中補(bǔ)加葡萄糖以使培養(yǎng)物始終能夠獲得葡萄糖。初始培養(yǎng)基裝料中的葡萄糖濃度根據(jù)所使用微生物生長(zhǎng)所需的葡萄糖總量減去生長(zhǎng)過程中將要補(bǔ)加的葡萄糖量來進(jìn)行選擇?？梢栽谏L(zhǎng)開始后的任何時(shí)間點(diǎn)開始補(bǔ)加葡萄糖。然而，由于在接種質(zhì)量和生產(chǎn)罐接種后產(chǎn)生的滯后期方面存在某些差異，優(yōu)選地是在指數(shù)生長(zhǎng)期過程中的某一預(yù)定生物物質(zhì)濃度下開始補(bǔ)加葡萄糖，所述生物物質(zhì)濃度通過直接的生物物質(zhì)的測(cè)定或間接的方法如光密度、二氧化碳排放速率或氧吸收值來確定。所述葡萄糖可以是一種精制玉米漿或非精制玉米漿。葡萄糖可以從罐的頂部通過氣體空間以連續(xù)流或以持續(xù)脈沖或脈動(dòng)形式補(bǔ)加。所述葡萄糖可以從底部補(bǔ)加到罐中特別是補(bǔ)加到接近攪拌器的高剪切區(qū)域以便實(shí)現(xiàn)在整個(gè)罐內(nèi)的快速分布。對(duì)于大罐來說，可以在同一罐內(nèi)有多個(gè)葡萄糖補(bǔ)加點(diǎn)。
其中底物被氧化的轉(zhuǎn)化期是通過添加一種誘導(dǎo)物和含有一種可氧化甲基的底物來啟動(dòng)。對(duì)于鏈烷烴、脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸鹽這種情況，這些底物及其混合物誘導(dǎo)它們自身氧化來生成二羧酸并且可以被用于其它物質(zhì)的氧化。所述底物可以以間歇形式加入或以連續(xù)形式來補(bǔ)加或以一系列脈沖或脈動(dòng)的形式來補(bǔ)加。所述底物可以從罐頂部通過蒸汽空間加入或從底部加入特別是加到高剪切區(qū)域。對(duì)于大罐來說可以有多個(gè)底物補(bǔ)加點(diǎn)。所述氧化反應(yīng)在pH小于7的酸性范圍內(nèi)進(jìn)行并且優(yōu)選地是在接近氧化形成羧基的pKa或在低于pKa下進(jìn)行，或者存在于底物中。
當(dāng)進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)，優(yōu)選地是逐漸減小向發(fā)酵罐補(bǔ)加葡萄糖的速率以此防止生物物質(zhì)和三酰甘油酯的積累。隨著商用油酸的轉(zhuǎn)化，胞內(nèi)貯存空泡的積累是一種非常有用的表示葡萄糖補(bǔ)加速率需要調(diào)節(jié)的指示指標(biāo)。通過在轉(zhuǎn)化期內(nèi)每24小時(shí)將補(bǔ)加速率降低約5％至25％而且通常降低約10％來進(jìn)行調(diào)節(jié)。還可以使用其它的指示指標(biāo)如堿的利用率、CO2排放速率或呼吸系數(shù)。
發(fā)酵過程中經(jīng)常遇到的問題是在常規(guī)堿性pH范圍內(nèi)進(jìn)行操作的結(jié)果是形成了羧酸皂(carboxylic acid soaps)和泡沫。在堿性環(huán)境中，羧酸能形成導(dǎo)致發(fā)酵液產(chǎn)生多余泡沫的皂。皂的形成導(dǎo)致發(fā)酵液pH的降低，結(jié)果需要向發(fā)酵液中添加堿如苛性堿來將發(fā)酵液的pH維持在所需值。而且向堿性環(huán)境添加葡萄糖導(dǎo)致影響發(fā)酵液pH的碳酸鹽的形成。為了補(bǔ)償對(duì)皂的pH和碳酸鹽形成的影響，必須向發(fā)酵液中添加大量的堿來將發(fā)酵液的pH維持在所需值。
已驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在2至7，優(yōu)選地3至7，甚至更優(yōu)選地5至6.5的酸性pH范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，而不是在苛性堿pH范圍內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵，泡沫基本被降低并且降低了由葡萄糖代謝過程中產(chǎn)生的二氧化碳向碳酸鹽的轉(zhuǎn)化，因而大大地減少了調(diào)控發(fā)酵液pH的進(jìn)料需用量。通過在酸性pH下進(jìn)行發(fā)酵，基本上克服了這些問題從而減少了發(fā)酵過程中的堿需用量。在生長(zhǎng)反應(yīng)過程中陽離子的凈消耗量超過了陰離子的凈消耗量結(jié)果降低了培養(yǎng)基的pH。理想地的是在生長(zhǎng)過程中通過添加控制pH的堿，將培養(yǎng)基的pH控制在2-7的范圍內(nèi)，優(yōu)選地約3-6.5的范圍內(nèi)。用于這一目的的堿是氫氧化銨、氨、氫氧化鈉和氫氧化鉀。理想地是選擇一種能夠提供一種或多種在生長(zhǎng)過程中能被消耗的主要營(yíng)養(yǎng)成分的堿組分如氫氧化銨、氨和氫氧化鉀。生長(zhǎng)培養(yǎng)基組分的調(diào)節(jié)需要考慮pH調(diào)控試劑的添加。通過將pH調(diào)控試劑和氮源組合到發(fā)酵罐的添加原料中，利用NH4OH或氨氣來調(diào)控pH可以減少培養(yǎng)微生物所需的原料種數(shù)。
如果使用諸如氨或氫氧化銨這類氮源，在培養(yǎng)基中僅需要含有250ppm或更少的氮源來啟動(dòng)生長(zhǎng)以及這些pH調(diào)控試劑的消耗。所述氨濃度在培養(yǎng)物生長(zhǎng)過程中仍需要維持穩(wěn)定。因此誘導(dǎo)時(shí)培養(yǎng)基中需要的氨濃度可以通過向初始培養(yǎng)基裝料中添加氨或銨鹽來進(jìn)行方便的預(yù)選。初始發(fā)酵罐裝料中使用的含氨氮源包括磷酸銨、硫酸銨、硝酸銨、氨、尿素和氫氧化銨。
本發(fā)明的另一方面涉及用于繁殖熱帶假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基的配制并且使得含有可氧化甲基的底物被轉(zhuǎn)化為羧酸的產(chǎn)率非常高。通過調(diào)節(jié)向發(fā)酵液補(bǔ)加物質(zhì)的速率，可以調(diào)控所述微生物的生長(zhǎng)。在利用葡萄糖的微生物的生長(zhǎng)過程中消耗的主要營(yíng)養(yǎng)成分是含氨氮源、鉀、鎂、磷酸鹽和硫酸鹽。雖然鈉和鈣沒有被消耗，但需要的鈣濃度為約5-50ppm或更高以便獲得取決于接種培養(yǎng)基組分的正常生長(zhǎng)。微量無機(jī)物和生物素也包含在培養(yǎng)基中。所述生物素可以是純度較高的或者是以較粗純度級(jí)別的形式如生物素酵母、酵母抽提物或玉米漿液來提供。
使用的磷酸鹽來源是磷酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉和磷酸。所用的鉀源是硫酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸三鉀和苛性鉀堿。
一種發(fā)酵輔助成分可以被用于鏈烷烴的氧化和/或脂肪酸的氧化。優(yōu)選的發(fā)酵輔助成分是一種脂肪酸酯，特別優(yōu)選的發(fā)酵輔助成分是一種甲酯。使用這種發(fā)酵調(diào)控試劑的一個(gè)主要益處在于泡沫的控制和發(fā)酵液流體特性的調(diào)節(jié)。如果產(chǎn)物鏈長(zhǎng)分布對(duì)于產(chǎn)物基本性能是重要的，由于甲酯也被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所以理想的是選擇類似于鏈烷烴或脂肪酸鏈長(zhǎng)的甲酯。該酯可以分批添加或混入原料中來添加。如果混入原料，該酯應(yīng)含有約10％或低于10％，優(yōu)選地約1％或低于1％的原料。某些商用脂肪酸天然含有一些甲酯并且可以被直接用作生產(chǎn)二羧酸的底物。例如，EMERSOL267(Cognis Corporation)是一種含有約1％或低于1％甲酯的商用油酸并且已被發(fā)現(xiàn)是本發(fā)明的一種有利底物。一種用于本法發(fā)明方法中的常規(guī)技術(shù)等級(jí)的油酸EMERSOL267的組成大約為0.3％C12，2.4％C14，0.6％C141，4.7％C16，4.6％C161，0.2％C17，0.8％C18，69.9％C181，10.5％C182，0.3％C183。
對(duì)于鏈烷烴被氧化為二羧酸的情況，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)以脂肪酸或脂肪酸鹽作為輔助成分是有利的。這導(dǎo)致鏈烷烴在發(fā)酵液中的良好分布。所述脂肪酸可以分批加入或可以被配制到鏈烷烴原料中。如果被配制到原料中，脂肪酸或脂肪酸鹽通常含有約10％或低于10％，優(yōu)選地5％或低于5％的原料。因此，如果產(chǎn)物鏈長(zhǎng)分布對(duì)于產(chǎn)物基本性能是重要的，由于脂肪酸也被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所以理想的是選擇類似于鏈烷烴的鏈長(zhǎng)分布的脂肪酸。
已驚奇地發(fā)現(xiàn)通過將相對(duì)于空氣飽和度的溶氧濃度值維持在低于約25％，優(yōu)選地低于20％，則減少了轉(zhuǎn)化期輔助底物的需用量，當(dāng)溶解氧濃度低于這些值時(shí)，能更有效地利用葡萄糖來提供氧化的能量。添加太多葡萄糖的結(jié)果造成生物物質(zhì)和三酰甘油酯的進(jìn)一步積累，同時(shí)減少轉(zhuǎn)化期過程中的羧酸產(chǎn)生。
通過調(diào)節(jié)初始培養(yǎng)基裝料中的鎂濃度或鎂與磷酸鹽的比例可以部分調(diào)控或降低產(chǎn)油酵母中三酰甘油酯的形成。發(fā)酵接種物中優(yōu)選的鎂濃度是約0.1至約1.0gm/L，更優(yōu)選地是約0.2至約0.8g/L。優(yōu)選的磷酸鹽∶鎂比例是20∶1至約2∶1，優(yōu)選地15∶1至約3∶1。
已驚奇地發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化期的發(fā)酵液積累具有消耗H2O2的活性的熱不穩(wěn)定性過氧化氫酶類。這可能干擾葡萄糖濃度的分析，該分析測(cè)定由葡萄糖氧化產(chǎn)生的H2O2。
本發(fā)明方法的優(yōu)選技術(shù)方案是通過油酸的生物氧化來制備9-十八烯二酸。當(dāng)任何等級(jí)的油酸被用作底物時(shí)，一種常規(guī)技術(shù)等級(jí)的油酸由下列羧酸組成0.42％C12；2.7％C14；0.86％C141；6.3％C16；4.6％C161；0.93％C17；2.8C18；71.8％C181；8.3％C182；0.58％C183。所述油酸還可以是一種來源于Helianthus annuus(向日葵籽油)品種的脂肪油的高等級(jí)油酸，所述Helianthus annuus被記載在例如美國(guó)專利US4,627,192中，其全部?jī)?nèi)容被引入本文作為參考。本方法也可以使用其它高油酸品種的油籽。這種油富含油酸并且含有至少70-80％重量的油酸。
通過下列實(shí)施例能更好地理解本發(fā)明，所有實(shí)施例只是用來進(jìn)行說明的，并不是用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行任何不適當(dāng)?shù)南拗?。在所有的?shí)施例中，組分濃度以它們的無水形式來表示。如果所述濃度被適當(dāng)調(diào)節(jié)到包括水合物的水份，可以使用所列出的通過商業(yè)途徑獲得的組分的水合物。
實(shí)施例1制備本發(fā)明的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分被列于下面的表1和2中。
表1合成的生產(chǎn)培養(yǎng)基 濃度(g/L)組分葡萄糖 27.0硫酸銨 7.0磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.5氯化鈣 0.1檸檬酸 0.06三氯化鐵 0.023生物素 0.0002痕量金屬硼酸0.0009硫酸銅 0.00007碘化鉀 0.00018三氯化鐵0.00036硫酸錳 0.00072鉬酸鈉 0.00036硫酸鋅 0.00072水 余量SAG 471抗泡劑 0.8ml
表1的培養(yǎng)基組分以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行加熱滅菌以便避免發(fā)生沉淀反應(yīng)，冷卻后被加到滅菌的發(fā)酵罐中。未接種的完全培養(yǎng)基被發(fā)現(xiàn)非常清澄且是淺稻草色，沒有強(qiáng)烈的氣味。加入抗泡劑后產(chǎn)生輕微的渾濁。在無菌條件下利用表1所列的培養(yǎng)基，通過對(duì)初始液體體積為12L的發(fā)酵罐進(jìn)行攪拌、通氣來培養(yǎng)熱帶假絲酵母H5343 ALK 2-1。所述無菌培養(yǎng)基被接種上5％的熱帶假絲酵母H5343 ALK 2-1的接種物并在35℃，pH 5.8和通氣速率足以使溶氧保持在20％以上的條件下攪拌培養(yǎng)大約10小時(shí)。當(dāng)所述培養(yǎng)物終止指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，溶氧開始上升，轉(zhuǎn)化期通過以下方式來啟動(dòng)以0.7g/L/小時(shí)的速率開始連續(xù)補(bǔ)加ExxonDevelopmental Fluid 137的原料流(一種含有約94.4％十三烷的碳?xì)浠衔铩⑵溆嘀饕鞘?，該原料流與發(fā)酵輔助成分1.25％Emersol267(一種技術(shù)等級(jí)的油酸)和1.25％Emery2203(一種技術(shù)等級(jí)的甲基油脂(tallowate))混合。與此同時(shí)，發(fā)酵罐中的溫度由35℃降至30℃，通氣速率降至0.4vvm，以及對(duì)罐施加了0.4巴的反壓力。在生長(zhǎng)期和轉(zhuǎn)化期利用6N的KOH將PH維持在5.8-5.9之間。當(dāng)生物物質(zhì)濃度達(dá)到約10g/L時(shí)，開始以1.58g葡萄糖/L/小時(shí)的速率向發(fā)酵罐連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖。根據(jù)每天顯微鏡的觀察結(jié)果和對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)積累的貯存泡的評(píng)估，將轉(zhuǎn)化期中所述葡萄糖的補(bǔ)加速率降低到0-15％。在轉(zhuǎn)化期中向發(fā)酵罐加入7ml的PPG(聚丙二醇)抗泡劑來控制輕微的泡沫。轉(zhuǎn)化期進(jìn)行50小時(shí)后，發(fā)酵罐中的全部發(fā)酵液中含有41.5g/Kg的1，13-十三烷二酸(1，13-tridecanedioic acid)。
實(shí)施例2表2合成的生產(chǎn)培養(yǎng)基濃度(g/L)組分葡萄糖27.0磷酸二氫鉀4.9硫酸鎂0.6氯化鈣0.1檸檬酸0.06三氯化鐵 0.023生物素0.000012微量金屬硫酸銅 0.00007硫酸錳 0.00432硫酸鋅 0.00072檸檬酸鹽0.00708水余量SAG 471抗泡劑 0.6ml表2的培養(yǎng)基組分以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行滅菌以便避免發(fā)生任何沉淀反應(yīng)，然后被加到滅菌的發(fā)酵罐中。未接種的完全培養(yǎng)基被發(fā)現(xiàn)非常清澄且是淺稻草色，沒有強(qiáng)烈的氣味。在無菌條件下利用表2所列的培養(yǎng)基，通過對(duì)初始液體體積為12L的發(fā)酵罐進(jìn)行攪拌、通氣來培養(yǎng)熱帶假絲酵母H5343 HDC 23-3。所述無菌培養(yǎng)基被接種上3％的熱帶假絲酵母H5343 HDC 23-3的接種物并在35℃和通氣速率足以使溶氧保持在20％以上的條件下攪拌培養(yǎng)大約12小時(shí)。通過添加6N的NH4OH將生長(zhǎng)期的pH調(diào)節(jié)和維持在5.8-5.9，所述NH4OH也是培養(yǎng)基中的無機(jī)氮源。當(dāng)所述培養(yǎng)物終止指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，溶氧開始上升，轉(zhuǎn)化期通過添加一種誘導(dǎo)物質(zhì)啟動(dòng)并且同時(shí)開始以2.0g/L/小時(shí)的速率連續(xù)補(bǔ)加油含量高的向日葵脂肪酸的原料流(含有84.4％油酸，5.2％亞油酸，4.7％硬脂酸，3.9％棕櫚酸，以及含有少量的二十烷酸(20∶0)，eicosaenoic acid(20∶1)，十五烷酸，月硅酸，十四烷酸的其余物質(zhì))。與此同時(shí)，發(fā)酵罐中的溫度由35℃降至30℃，通氣速率降至0.4vvm，以及將pH調(diào)控試劑NH4OH換成NaOH。利用6N NaOH將轉(zhuǎn)化期的pH調(diào)節(jié)和維持在5.8-5.9。當(dāng)生物物質(zhì)濃度達(dá)到約10g/L時(shí)，開始以1.22g葡萄糖/L/小時(shí)的速率向發(fā)酵罐連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖。根據(jù)每天顯微鏡的觀察結(jié)果和對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)積累的貯存泡的評(píng)估，將轉(zhuǎn)化期中所述葡萄糖的補(bǔ)加速率降低到0-45％。在轉(zhuǎn)化期中不添加抗泡劑。轉(zhuǎn)化期進(jìn)行50小時(shí)后，發(fā)酵罐中的全部發(fā)酵液中含有71g/Kg的總二羧酸。
實(shí)施例3表3合成培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基組分 濃度(g/L)葡萄糖 20.0硫酸銨 0.5磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.9NaCl 0.5氯化鈣 0.1生物素 0.0002痕量金屬硼酸 0.00075硫酸銅0.00006碘化鉀0.00015硫酸鐵0.04三氯化鐵 0.0003硫酸錳0.0006鉬酸鈉0.0003硫酸鋅0.0006水 余量SAG 471抗泡劑2滴表3的培養(yǎng)基組分以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行滅菌以便避免發(fā)生沉淀反應(yīng)，冷卻后被加到滅菌的發(fā)酵罐中。培養(yǎng)基被發(fā)現(xiàn)非常清澄且是淺稻草色，沒有氣味。加入抗泡劑后產(chǎn)生輕微的渾濁。采用6N氫氧化銨溶液將培養(yǎng)基的pH初調(diào)到5.8。在一個(gè)攪拌和通氣的發(fā)酵罐中利用所述培養(yǎng)基并且通過接種以含有相似組分的培養(yǎng)基制備的4％接種物來培養(yǎng)熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)。主要滯后期之后開始進(jìn)行指數(shù)生長(zhǎng)。當(dāng)通過光密度測(cè)量判斷所述培養(yǎng)物含有約5g/L干重的生物物質(zhì)時(shí)，根據(jù)初始的培養(yǎng)基體積開始以1.25g/L/小時(shí)的速率補(bǔ)加葡萄糖。當(dāng)葡萄糖成為生長(zhǎng)的限制因素且整個(gè)過程的指數(shù)生長(zhǎng)速率剛有所下降時(shí)，指數(shù)生長(zhǎng)繼續(xù)進(jìn)行約9小時(shí)。
當(dāng)快速生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)，pH調(diào)控試劑被換成6N的氫氧化鉀溶液并且繼續(xù)恒定地補(bǔ)加葡萄糖110小時(shí)。在此期間，其濃度在整個(gè)指數(shù)生長(zhǎng)期中維持恒定的銨被從所述培養(yǎng)基中耗盡并且磷酸鹽的濃度降到很低的值。盡管這些關(guān)鍵性營(yíng)養(yǎng)成分被消耗了，但是生物物質(zhì)仍繼續(xù)以恒定的線性速率在培養(yǎng)基中積累?；罴?xì)胞數(shù)也呈線性增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)直至培養(yǎng)基中的銨被耗盡，之后活細(xì)胞數(shù)保持恒定。最后，所述發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)出71.5g/L干重的生物物質(zhì)。
對(duì)比實(shí)施例1合成的生產(chǎn)培養(yǎng)基 濃度(g/L)葡萄糖 40.0硫酸銨 8.0玉米漿 9.0磷酸二氫鉀 2.0磷酸氫二鉀 1.0硫酸鎂 0.5NaCl 0.5氯化鈣 0.1痕量金屬硼酸0.00075硫酸銅 0.00006
碘化鉀 0.00015三氯化鐵 0.0003硫酸錳 0.0006鉬酸鈉 0.0003硫酸鋅 0.0006SAG 471抗泡劑 2滴對(duì)比實(shí)施例1的培養(yǎng)基組分以適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行滅菌以便避免發(fā)生任何沉淀反應(yīng)，然后被加到滅菌的發(fā)酵罐中。未接種的完全培養(yǎng)基被發(fā)現(xiàn)顏色非常暗，帶有強(qiáng)烈的玉米漿氣味。在無菌條件下利用表3所列的培養(yǎng)基，通過對(duì)初始液體體積為10L的發(fā)酵罐進(jìn)行攪拌、通氣來培養(yǎng)熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)。所述無菌培養(yǎng)基被接種上6％的熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)的接種物并在35℃和通氣速率足以使溶氧保持在20％以上的條件下攪拌培養(yǎng)大約9.5小時(shí)。生長(zhǎng)過程中添加5ml的SAG 471抗泡劑來控制培養(yǎng)基中的泡沫。通過添加6N的NH4OH將生長(zhǎng)期的pH調(diào)節(jié)和維持在5.8-5.9。當(dāng)所述培養(yǎng)物終止指數(shù)生長(zhǎng)時(shí)，溶氧開始上升，開始以2.0g/L/小時(shí)的速率連續(xù)補(bǔ)加Emersol267(含有71.8％油酸，8.3％亞油酸，6.3％棕櫚酸，4.6％棕櫚油酸，2.8％硬脂酸，2.7％十四烷酸，0.93％C170酸，0.86％肉豆蔻腦酸，0.58％亞麻酸和0.42％月硅酸的商用等級(jí)的油酸)來啟動(dòng)轉(zhuǎn)化期。與此同時(shí)，發(fā)酵罐中的溫度由35℃降至30℃，通氣速率降至1.2vvm，以及將pH調(diào)控試劑NH4OH換成KOH。利用6N KOH將轉(zhuǎn)化期的pH調(diào)節(jié)和維持在5.8或5.8以上。當(dāng)指數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束而轉(zhuǎn)化期剛開始時(shí)，開始以1.8g/L/小時(shí)的速率向發(fā)酵罐連續(xù)補(bǔ)加葡萄糖。整個(gè)轉(zhuǎn)化期過程中維持該補(bǔ)加葡萄糖的速率不變。在轉(zhuǎn)化期的前3個(gè)小時(shí)向發(fā)酵罐中添加17ml的SAG 471抗泡劑以便控制嚴(yán)重的泡沫。轉(zhuǎn)化期進(jìn)行50小時(shí)候，發(fā)酵罐中的全部發(fā)酵液中含有64g/Kg的總二羧酸。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其含有(a)一種可代謝的碳源和能源；(b)一種無機(jī)氮源；(c)一種磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素、過渡金屬元素及其混合物的金屬元素；和(e)一種基本不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的可代謝的碳源和能源是葡萄糖。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的無機(jī)氮源是硫酸銨。
4.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的無機(jī)氮源是氨。
5.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的無機(jī)氮源是氫氧化銨。
6.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的磷酸鹽源是磷酸鉀。
7.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的金屬元素是鈣。
8.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的金屬元素是鎂。
9.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其中所述的金屬元素是鈣和鎂。
10.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其還含有一種抗泡劑。
11.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其還含有一種螯合劑。
12.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其還含有至少一種痕量金屬。
13.一種發(fā)酵培養(yǎng)基，其含有(a)葡萄糖；(b)一種銨鹽；(c)一種磷酸鹽；(d)一種鉀鹽；(e)一種硫酸鎂；(f)一種鈣鹽；(g)一種鐵鹽；(h)一種螯合劑；和(i) 一種痕量金屬。
14.一種制備一種多羧酸、一種多元醇或一種多羥基酸的方法，其包括(a)提供一種能夠產(chǎn)生一種多羧酸、一種多元醇或一種多羥基酸的微生物；(b)提供一種能被所述微生物轉(zhuǎn)化為一種多羧酸、一種多元醇和一種多羥基酸的底物；(c)提供一種含有下列成分的培養(yǎng)基(i)一種可代謝的碳源和能源；(ii)一種無機(jī)氮源；(iii)一種磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素、過渡金屬元素及其混合物的金屬元素；和(v)一種基本不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源；和(d)在所述發(fā)酵培養(yǎng)基中對(duì)所述微生物和底物進(jìn)行發(fā)酵。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述微生物是熱帶假絲酵母。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述底物是一種具有約4至約25個(gè)碳原子的鏈烷烴。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的可代謝的碳源和能源是葡萄糖。
18.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的無機(jī)氮源是硫酸銨。
19.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的磷酸鹽源是磷酸鉀。
20.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的金屬元素是鈣。
21.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的金屬元素是鎂。
22.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述的金屬元素是鈣和鎂。
23.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有一種螯合劑。
24.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有一種抗泡劑。
25.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還含有至少一種痕量金屬元素。
26.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述步驟(d)是在pH大約至多為7的條件下進(jìn)行。
27.如權(quán)利要求14所述的方法，其在步驟(d)中還包括將溶氧濃度值維持在低于大約25％。
28.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述無機(jī)氮選自氨、氫氧化銨及其混合物。
全文摘要
一種發(fā)酵培養(yǎng)基,其含有:(a)一種可代謝的碳源和能源;(b)一種無機(jī)氮源;(c)一種磷酸鹽;(d)至少一種選自堿金屬元素、堿土金屬元素、過渡金屬元素及其混合物的金屬元素;和(e)一種基本不含微粒物質(zhì)和細(xì)菌的生物素源。
文檔編號(hào)C07C55/00GK1377422SQ00813588
公開日2002年10月30日 申請(qǐng)日期2000年9月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月30日
發(fā)明者K·W·安德森, J·D·溫澤爾 申請(qǐng)人:科金斯公司