專利名稱：：基因的等溫滾環(huán)復(fù)制與限制性內(nèi)切酶檢測方法及其試劑盒的制作方法所屬領(lǐng)域本發(fā)明是一種體外擴增基因片段和檢測的方法，命名為RCA-RED。
背景技術(shù)：
：DNA的細(xì)胞外復(fù)制是現(xiàn)代分子生物學(xué)的最主要成就之一，也是現(xiàn)代生物學(xué)研究和應(yīng)用中使用得最為普遍的手段。二十世紀(jì)五十年代，美國科學(xué)家孔伯格(ArthurKornberg)利用大腸桿菌的DNA聚合酶I在試管內(nèi)復(fù)制DNA成功。八十年代后期，美國科學(xué)家穆理斯(KaryB.Mullis)發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法，該方法不僅能夠復(fù)制，而且能夠大量擴增目的基因。PCR實際上是以線性DNA為模板進行復(fù)制，主要反應(yīng)因子有DNA模板，擴增片段兩端的寡聚脫氧核苷酸引物(oligodeoxynucleotideprimers)，四種脫氧核苷酸(dNTP)，耐熱DNA聚合酶，及適宜的離子和酸度條件。PCR反應(yīng)的物理條件包括高溫(通常為95℃，使DNA雙鏈分離變性)，低溫(通常為45-60℃，使引物與同源序列結(jié)合)和中溫，即反應(yīng)溫度(通常為65-72℃，由DNA聚合酶合成DNA)三個階段，每三個階段構(gòu)成一個循環(huán)，一般一個PCR反應(yīng)需要25-40個循環(huán)。在理想情況下，PCR反應(yīng)每經(jīng)過一個循環(huán)，目的基因的數(shù)量就被擴增一倍，這樣，在經(jīng)過30個循環(huán)之后，一個目的基因分子就可能被擴增到十億個以上(230)。在這些擴增的目的基因中，絕大多數(shù)DNA分子的長度由兩個引物的位置所決定，也就是說，它們的長度都是一致的，因此可以通過凝膠電泳和DNA染色方法檢測擴增片段的存在。PCR方法具有靈敏度高，簡單、快速等優(yōu)點，很快成為體外復(fù)制與擴增DNA的常規(guī)方法。但是，PCR也存在一些缺點，如它需要價格昂貴的DNA擴增儀，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，不能夠定量，等等。到了九十年代，有人發(fā)明了DNA的滾環(huán)復(fù)制擴增方法(RCA)。RCA與PCR的主要區(qū)別有四個第一，它的復(fù)制模板是環(huán)狀的，復(fù)制方式是滾環(huán)式的，擴增出的DNA分子雖是線性的，但是其長度不等，一般是環(huán)狀模板的整倍數(shù)。第二，用于RCA的DNA聚合酶都能夠使與模板互補的DNA鏈脫落，同時合成新鏈。這個特點決定了RCA不需要PCR的變性、復(fù)性等變溫條件，整個反應(yīng)可以在恒溫下進行，從而不需要DNA擴增儀。第三，由于在RCA反應(yīng)中，復(fù)制模板直接來源于化學(xué)合成的DNA引物，它與目的基因的關(guān)系僅是形成互補結(jié)構(gòu)，以便能夠連接成環(huán)，所以從理論上講，RCA能夠直接檢測DNA和RNA分子，而PCR只能夠直接檢測DNA分子。第四，RCA的擴增效率極高。有數(shù)據(jù)表明，PCR方法每小時可以使DNA擴增109，而RCA方法每小時可以使DNA擴增1012，相差達到千倍。不過，RCA擴增的DNA片段長度不等，常規(guī)的電泳方法不能夠用來檢測擴增的DNA，而是需要通過復(fù)雜的熒光和同位素標(biāo)記技術(shù)來檢測。這就極大地限制了它的應(yīng)用。技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的是，為克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供一種基因的等溫滾環(huán)復(fù)制與限制性內(nèi)切酶檢測方法，命名為RCA-RED(RollingCircleAmplification-RestrictionEnzymeDigestion)。通過在RCA的引物中設(shè)計限制性內(nèi)切酶的識別位點，在RCA反應(yīng)之后，用限制性內(nèi)切酶將擴增的DNA切割成長度相等的片段，然后應(yīng)用電泳方法來檢測擴增產(chǎn)物的存在。該方法的基本步驟包括(1)、將DNA探針與待檢樣品的DNA或RNA混合，使DNA探針與目的基因雜交。該引物探針上有特定的限制性內(nèi)切酶切割位點；(2)、加入DNA連接酶，使DNA探針連接成環(huán)狀；(3)、加入DNA聚合酶和復(fù)制引物，今其以滾環(huán)方式復(fù)制并合成雙鏈DNA；(4)、加入限制性內(nèi)切酶，將復(fù)制的DNA切割成特定長度的片段；(5)、通過電泳，如平板瓊脂糖凝膠電泳，垂直聚丙烯酰胺電泳，毛細(xì)管電泳等，檢查特定長度的DNA片段。用RCA方法檢測目的基因，其關(guān)鍵在于引物的設(shè)計。與PCR只需要一對引物不同，一個RCA反應(yīng)一般至少需要以下數(shù)種引物1、環(huán)狀復(fù)制模板大探針(簡稱C-探針)2、充寡聚脫氧核苷酸探針(簡稱G-探針)3、滾環(huán)復(fù)制引物(簡稱P1)4、互補鏈合成引物(簡稱P2)該方法可以在等溫情況下使待檢基因成指數(shù)擴增，用限制性內(nèi)切酶切割成特定長度之后，其擴增的DNA可以通過電泳方法檢測。無需價格昂貴的DNA擴增儀，可定量，可用于包括動物、植物和微生物的基因檢測；以及可用于包括動物、植物和微生物的基因擴增。圖1是C-探針的基本結(jié)構(gòu)示意圖；C-探針是RCA-RED的主要成分，由左、右靶區(qū)和P1互補區(qū)、P2區(qū)組成。C-探針還可以有其它區(qū)域。限制性內(nèi)切酶位點一般位于C-探針內(nèi)。圖2是RCA復(fù)制模板的形成示意圖；C-探針的靶區(qū)和G-探針在與目的基因的互補序列雜交后，經(jīng)DNA連接酶連接成一個環(huán)狀DNA。這就是RCA中的復(fù)制模板。圖3是RCA-RED原理流程圖。圖4為應(yīng)用RCA-RED方法檢測噬菌體λDNA的電泳照片C-探針是RCA反應(yīng)的主要探針，是長度在50到500核苷酸之間的單鏈DNA，5’端有磷酸根基團，3’端為羥基。5’端磷酸根基團的作用是它能夠與3’端羥基在連接酶的作用下連接成共價鍵。C-探針的最佳長度在100-200個核苷酸左右。C-探針兩端各10-30個左右核苷酸為靶標(biāo)區(qū)，與目的基因的一條鏈互補，形成一個有缺口或無缺口的單鏈DNA環(huán)狀結(jié)構(gòu)。這個缺口可以是1-50個核苷酸，一般在5-10個核苷酸。缺口的長度也就是下面G-探針的長度。如缺口長度為0，則不需要G-探針。在靶標(biāo)區(qū)之間，是所謂的間隔區(qū)，根據(jù)不同需要可以有多個區(qū)域，但有兩個區(qū)域是必須的，一個是P1互補區(qū)，一個是P2區(qū)，其序列一個與引物P1互補，另一個與引物P2相同。詳見圖1。G-探針是一個完全與目的基因互補的寡聚脫氧核苷酸鏈，5’端有磷酸根基團，3’端為羥基。它的長度在數(shù)個到幾十個核苷酸之間，一般為5-10個核苷酸左右。G-探針的主要作用是填充C-探針的左右靶標(biāo)區(qū)與目的基因互補雜交之后形成的缺口。在DNA連接酶的作用下，C-探針與G-探針組成了一個由共價鍵連接起來的單鏈環(huán)狀DNA。這就是RCA復(fù)制的模板。C-探針的靶標(biāo)區(qū)和G-探針決定RCA-RED反應(yīng)的特異性，也就是說，只有在它們與目的基因序列雜交之后，反應(yīng)才可能繼續(xù)進行下去。詳見圖2。P1是一個單鏈寡聚脫氧核苷酸，長度在10-50核苷酸之間，一般在20個核苷酸左右。它與C-探針上的P1互補區(qū)通過氫鍵互補，成為RCA反應(yīng)中DNA合成起始引物。P2是一個單鏈寡聚脫氧核苷酸，長度在10-50核苷酸之間，一般在20個核苷酸左右。它與C-探針上的P2區(qū)序列一致，其作用是與新合成的DNA鏈上的P2互補區(qū)雜交，成為第二條DNA鏈合成的起始引物。本發(fā)明的最主要之處就是在復(fù)制模板(C-探針與G-探針連接而成的DNA環(huán))內(nèi)設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點。在RCA反應(yīng)結(jié)束后，通過該內(nèi)切酶把擴增出的多聚模板DNA切割成特定長度的片段。一般說來，限制性內(nèi)切酶切割位點可以在C-探針內(nèi)，也可以在G-探針內(nèi)，但最好是在C-探針之內(nèi)。限制性內(nèi)切酶位點可以在C-探針的任何地方，如靶標(biāo)區(qū)，間隔區(qū)等。復(fù)制模板內(nèi)可以有多個不同的限制性內(nèi)切酶位點，但以2-3個最為適宜。限制性內(nèi)切酶可以是識別四個鹼基序列的酶，如AluI，HaeIII，Sau3AI，TaqI，也可以是識別六個鹼基序列的酶，如BamHI，EcoRI，HindIII，SalI，也可以是其他任何限制性內(nèi)切酶。一般來說，應(yīng)該首先選用來自耐熱細(xì)菌和對反應(yīng)條件要求不苛刻的內(nèi)切酶。設(shè)計限制性內(nèi)切酶位點的原則是就某一個限制性內(nèi)切酶來說，整個復(fù)制模板內(nèi)該酶的切割位點不應(yīng)超過5個，一般不超過3個，最好只有1個。RCA-RED的探針和引物中只有C-探針的靶標(biāo)區(qū)和G-探針是特異序列，其它序列屬于武斷隨機序列，此處稱之為核心序列。為了方便引物設(shè)計，可以先構(gòu)建好一系列核心序列，具有不同長度(50，80，100，130，160，200個鹼基)和不同限制性內(nèi)切酶位點，然后補充目的基因的靶標(biāo)區(qū)序列。由于存在長度和酶切位點的差異，從理論上講，一個RCA-RED反應(yīng)可以檢測數(shù)個不同基因或一個基因的序列多態(tài)性。RCA-RED的一般步驟如下(詳見圖3)1、在試管內(nèi)加入待測樣品的DNA和C-探針與G-探針，在適宜的條件下令其雜交；2、加入DNA連接酶，使C-探針與G-探針連接成共價環(huán)狀DNA；3、加入DNA聚合酶和P1，P2引物，開始合成單鏈及雙鏈DNA；4、加入限制性內(nèi)切酶，將合成的DNA切割成單位長度；5、將切割后的DNA在凝膠中電泳，然后通過染色觀察特定長度的DNA片段。實例1應(yīng)用RCA-RED方法檢測噬菌體λDNA噬菌體λ是一種細(xì)菌病毒，其基因組為雙鏈DNA，全長約4萬8千鹼基(48kb)。在13861至13920鹼基之間，其序列如下(GenBankNo.215104)5’GCGGTGAGTGCCTCCTTTGTACTGTCCACGCCGACGGAAACGGATGGCGCTGTTTTTCCG3’根據(jù)上面的序列，設(shè)計了噬菌體λ的RCA-RED引物C-探針5′p-CAGTACAAAGGAGGCACTCTAGGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCAGCGCCATCCGTTTCCG-OH3′其中，5’端為一個磷酸根基團，用“P”表示，3’端是個羥基，用“OH”表示。5’端的19個鹼基(CAGTACAAAGGAGGCACTC)是左靶標(biāo)區(qū)，與λ基因組序列13866-13884互補；3’端的18個鹼基(CAGCGCCATCCGTTTCCG)是右靶標(biāo)區(qū)，與λ基因組序列13895-13913互補；兩個靶標(biāo)區(qū)之間的53個鹼基為間隔區(qū)，內(nèi)含P1互補區(qū)(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)，其中有一個HindIII酶切位點AAGCTT，和P2區(qū)(CTCGACTTGGAACCTGAAGG)，其中有一個TaqI酶切位點TCGA。在上述四個區(qū)域之間，該C-探針上還有3個短片段，用作間隔，其中之一為EcoRI酶切位點GAATTC。G-探針5’p-TCGGCGTGGA-OH3’，與λ基因組序列13885-13894(TCCACGCCGA)互補；P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，與C-探針上的P1互補區(qū)(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)互補；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’與P2區(qū)序列相同。檢測步驟1、將C-探針和G-探針(各為50-100nM)與噬菌體λ的DNA(10-100ng)在T4DNA連接酶緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反應(yīng)體積為50μl。在95℃加熱3分鐘，降至室溫，然后加5個衛(wèi)斯單位(WeissUnits)的T4DNA連接酶，37℃30分鐘；2、從上述反應(yīng)液中取出25μl反應(yīng)物，與等體積的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分鐘后，再加0.2μMP2引物，50ngφ29DNA聚合酶，30℃60分鐘；3、加入等量的11酚/氯仿混合液，混勻，離心5分鐘，取上層水相，加十分之一體積的3M醋酸鈉(pH6.0)，2.5倍體積的95％乙醇，14000rpm離心15分鐘，將沉淀溶解在10μl純水或TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；4、將上述DNA用EcoRI或HindIII或TaqI在15μl反應(yīng)體積中切割，其反應(yīng)條件分別是EcoRI100mMTris-HCl，pH7.5，50mMNaCl，10mMMgCl2，0.025％TritonX-100，37℃60分鐘；HindIII10mMTris-HCl，pH8.4，50mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，37℃60分鐘；TaqI10mMTris-HCl，pH8.4，100mMNaCl，10mMMgCl2，65℃60分鐘；5、加入3μl6X電泳樣品緩沖液(30％甘油，0.25％溴酚藍染料)，在3％的瓊脂糖或5％的聚丙烯酰胺中電泳，然后用溴化乙錠或硝酸銀染色，檢查100bpDNA帶。說明第二步中的DNA聚合酶可以是φ29DNA聚合酶，也可以是其他具有能夠使與模板互補的DNA鏈與模板脫離，并且缺少5’到3’外切酶活性的DNA聚合酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)，噬熱菌VentRTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)，噬菌體T5DNA聚合酶，噬菌體M2DNA聚合酶，等等。第三步(DNA純化和濃縮)可以省略，也可以用市場上銷售的DNA純化試劑盒來替代。如果省略第三步，可以把擴增的DNA直接用限制性內(nèi)切酶在相應(yīng)的緩沖液中切割。陰性對照可以使用沒有噬菌體污染的大腸桿菌DNA。圖4為應(yīng)用RCA-RED方法檢測噬菌體λDNA的電泳照片按照文中的步驟做完RCA反應(yīng)之后，將DNA用酒精沉淀，用限制性內(nèi)切酶切割，然后在瓊脂糖凝膠中電泳。DNA用溴化乙錠染色后，在紫外光下拍照。1RCA反應(yīng)中沒有λDNA的陰性對照2-5RCA反應(yīng)中加有λDNA，然后沒有加限制性內(nèi)切酶(泳道2)，和分別加EcoRI(泳道3)，HindIII(泳道4)，TaqI(泳道5)。6DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從下至上為50，100，200，300，400，600，1000，1500，2000bp.實例2應(yīng)用RCA-RED方法檢測馬傳染性貧血病毒馬傳染性貧血病毒(EquineInfectiousAnemiaVirus，EIAV)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒科慢病毒屬(lentivirus)，基因組是單鏈RNA，全長約8kb。在侵染寄主之后，EIAV的基因組被轉(zhuǎn)錄成DNA，并且整合到寄主的基因組之中，以“前病毒(proviral)DNA”的形式存在。EIAV與同屬于慢病毒屬的HIV(俗稱愛滋病毒)在基因組結(jié)構(gòu)、基因編碼蛋白及基因調(diào)控方式等方面有許多相似之處，因此該病毒成為研究慢病毒感染和致病機制及病毒酶功能的重要模型。檢測EIAV感染以血清學(xué)方法為主，通常是檢查馬的血液中是否含有EIAV的抗體。八十年代初，中國科學(xué)家沈榮顯等人在世界上首次發(fā)明馬傳染性貧血病毒疫苗，并且在全國推廣。雖然該疫苗有效地控制了EIAV病的蔓延，但由于注射疫苗使所有的馬匹都產(chǎn)生了EIAV的抗體，因此常規(guī)的血清學(xué)檢測方法不再能夠從EIAV疫苗接種的馬匹中區(qū)分EIAV的攜帶者。發(fā)明一種新的，快速、準(zhǔn)確的EIAV檢測方法就成了當(dāng)務(wù)之急。EIAV基因組編碼膜蛋白gag基因的序列相對比較保守，部分序列如下(GenBankNo.AF033820，901-1000)5′TCATGATAGATGGGGCTGGAAACAGAAATTTTAGACCTCTAACACCTAGAGGATATACTACTTGGGTGAATACCATACAGACAAATGGTCTATTAAATGA3′根據(jù)上面的序列，設(shè)計了RCA-RED的下列引物C-探針5′p-CTGTTTCCAGCCCCATCTATCTAGGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCCTCTAGGTGTTAGAGGTCT-OH3′其中，5’端的21個鹼基(CTGTTTCCAGCCCCATCTATC)是左靶標(biāo)區(qū)，與EIAV基因組序列905-925互補；3’端的20個鹼基(CCTCTAGGTGTTAGAGGTCT)是右靶標(biāo)區(qū)，與EIAV基因組序列933-952互補；兩個靶標(biāo)區(qū)之間的53個鹼基為間隔區(qū)，內(nèi)含P1互補區(qū)(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)，其中有一個HINDIII酶切位點AAGCTT，和P2區(qū)(CTCGACTTGGAACCTGAAGG)，其中有一個TAQI酶切位點TCGA。在上述四個區(qū)域之間，該C-探針上還有3個短片段，用作間隔，其中之一為EcoRI酶切位點GAATTC。G-探針5’p-AAAATTT-OH3’，與EIAV基因組序列926-932(AAATTTT)互補；P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，與C-探針上的P1互補區(qū)(GTCTGTGTACAAGCTTTCG)互補；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’與P2區(qū)序列相同。檢測步驟1、用DNA提取試劑盒(Promega，Qiagen等廠家產(chǎn)品)從馬的血液中提取DNA，用其中約100ng與C-探針和G-探針(各為50-100nM)在T4DNA連接酶緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反應(yīng)體積為50μl。在95℃加熱3分鐘，然后加5個衛(wèi)斯單位(WeissUnits)的T4DNA連接酶，37℃30分鐘；2、從上述反應(yīng)中取出25μl，與等體積的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分鐘后，再加0.2μMP2引物，50ngφ29DNA聚合酶，30℃60分鐘；3、加入等量的1∶1酚/氯仿混合液，混勻，離心5分鐘，取上層水相，加十分之一體積的3M醋酸鈉(pH6.0)，2.5倍體積的95％乙醇，14000rpm離心15分鐘，將沉淀溶解在10μl純水或TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；4、將上述DNA用EcoRI或HindIII或TaqI在15μl反應(yīng)體積中切割，其反應(yīng)條件分別是EcoRI100mMTris-HCl，pH7.5，50mMNaCl，10mMMgCl2，0.025％TritonX-100，37℃60分鐘；HindIII10mMTris-HCl，pH8.4，50mMNaCl，10mMMgCl2，1mMDTT，37℃60分鐘；TaqI10mMTris-HCl，pH8.4，100mMNaCl，10mMMgCl2，65℃60分鐘；5、加入3μl6X電泳樣品緩沖液(30％甘油，0.25％溴酚藍染料)，在3％的瓊脂糖或5％的聚丙烯酰胺中電泳，然后用溴化乙錠或硝酸銀染色，檢查100bpDNA帶。說明本方法也可以用來直接檢查EIAV的mRNA先從馬的血液中純化總RNA，然后與探針雜交。第二步中的DNA聚合酶可以是φ29DNA聚合酶，也可以是其他具有能夠使與模板互補的DNA鏈與模板脫離，并且缺少5’到3’外切酶活性的DNA聚合酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenowfragment)，噬熱菌VentRTMDNA聚合酶(NewEnglandBiolab)，噬菌體T5DNA聚合酶，噬菌體M2DNA聚合酶，等等。第三步(DNA純化和濃縮)可以省略，也可以用市場上銷售的DNA純化試劑盒來替代。如果省略第三步，可以把擴增的DNA直接用限制性內(nèi)切酶在相應(yīng)的緩沖液中切割。陰性對照可以使用來自健康馬匹的血液樣品，或來自無EIAV污染的馬細(xì)胞培養(yǎng)樣品。實例3應(yīng)用RCA-RED方法檢測大腸桿菌中的毒素基因大腸桿菌(Escherichiacoli)是食物和飲料中主要污染微生物，導(dǎo)致人畜腹泄，嚴(yán)重者能夠引起死亡。目前國際上傾向于將致瀉性大腸桿菌菌分為5類，包括腸產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌(Entero-toxigenicE.coli，ETEC)、腸致病性大腸埃希氏菌(Entero-pathogenicE.coli，EPEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(Entero-InvasiveE.coli，EIEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(Entero-HemorrhagicE.coli，EHEC)和腸集聚性粘附大腸埃希氏菌(Entero-AggregativeE.coli，EAggEC)。不同類型的病菌差異主要是因為它們攜帶的毒素基因，如熱敏性毒素(heat-labiletoxins，LTI，LTIIa，LTIIb)、熱穩(wěn)性毒素(heat-stabletoxins，STI，STII)、維羅毒素(verotoxin，VT1，VT2，VT2e)、志賀氏菌樣毒素(shiga-liketoxin，SLTI，SLTII)等。目前，檢查大腸桿菌的方法主要有細(xì)菌培養(yǎng)、血清學(xué)和生物化學(xué)方法。細(xì)菌培養(yǎng)需要時間較長，并且很難從培養(yǎng)物的形態(tài)上鑒定致病類型。血清學(xué)方法需要特異的抗體，生物化學(xué)方法比較繁瑣復(fù)雜。研究出一種能夠快速、準(zhǔn)確地從食物和飲水中檢測、鑒定出這些毒素基因的方法，具有重大的社會和經(jīng)濟意義。RCA-RED方法會在這方面具有巨大潛力。大腸桿菌基因組中，普遍存在一種叫做uspA(universalstressprotein)的基因，一般可以用來作為鑒定大腸桿菌的陽性參照。根據(jù)大腸桿菌的LTI和STI毒素基因以及uspA基因的核酸序列，設(shè)計出如下C-探針和G-探針uspA基因靶標(biāo)區(qū)序列(GenBankNo.AF346731，369-420)5′GGCTCGCCCATACAATGCGAAAGTTTCTCTGATCCACGTAGATGTAAACTAC3′C-探針5′p-CGCATTGTATGGGCGAGCCTAGTGACTTACGGTCTGTGTACAAGCTTTCGAAGGATCCCTCGACTTGGAACCTGAAGGATAGAATTCGTAGTTTACATCTACGTGGATCAGA-OH3′其中各區(qū)部分用空格分開，順序分別為左靶標(biāo)區(qū)，間隔，P1互補區(qū)(含HindIII位點)，間隔(含BamHI位點)，P2區(qū)(含TaqI位點)，間隔(含EcoRI位點)，右靶標(biāo)區(qū)。G-探針P-GAAACTTT-OH復(fù)制模板全長120；特異酶切位點BamHI。LTI基因靶標(biāo)區(qū)序列(GenBankNo.S60731，248-294)5′GATCACGCGAGAGGAACACAAACCGGCTTTGTCAGATATGATGACGG3′C-探針5′p-GTGTTCCTCTCGCGTGATCTGGTCTGTGTACAAGCTTTCGGATATCCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCCCGTCATCATATCTGACAAAG-OH3′其中各區(qū)部分用空格分開，順序分別為左靶標(biāo)區(qū)，間隔，P1互補區(qū)(含HindIII位點)，間隔(含EcoRV位點)，P2區(qū)(含TaqI位點)，間隔(含EcoRI位點)，右靶標(biāo)區(qū)。G-探針P-CCGGTTT-OH復(fù)制模板全長100；特異酶切位點EcoRV。STI基因靶標(biāo)區(qū)序列(GenBankNo.M25607，331-383)5′CCCTCTTTTAGTCAGTCAACTGAATCACTTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC3′C-探針5′p-GACTGACTAAAAGAGGGTAGGATATGTACATGAAGTACTTTGTCTGTGTACAAGCTTTCGAACCGGTACCTTACAGTTCTCGACTTGGAACCTGAAGGGAATTCGTAATTTTCTCTTTTGAAGAGTCAAC-OH3′其中各區(qū)部分用空格分開，順序分別為左靶標(biāo)區(qū)，間隔，P1互補區(qū)(含HindIII位點)，間隔(含KpnI位點)，P2區(qū)(含TaqI位點)，間隔(含EcoRI位點)，右靶標(biāo)區(qū)。G-探針P-TGATTCAGTT-OH復(fù)制模板全長140；特異酶切位點KpnI。上面的三組探針都使用如下復(fù)制引物P15’HO-CGAAAGCTTGTACACAGAC-OH3’，與C-探針上的P1互補區(qū)互補；P25’HO-CTCGACTTGGAACCTGAAG-OH3’與P2區(qū)序列相同。檢測步驟1、收集樣品水中的大腸桿菌通過離心方法收集，固體樣品上的大腸桿菌通過在無菌水中浸洗后離心收集。也可以將收集的樣品在培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-8小時，富集之后收集。分離出的細(xì)菌樣品或者用DNA提取試劑盒(Promega，Qiagen等廠家產(chǎn)品)提取DNA，或者直接加入無菌水，或0.5％Tween20，95℃5分鐘使細(xì)胞裂解，離心2分鐘后取上清液使用。2、取約100ng樣品DNA與上述三組C-探針和G-探針(各為50-100nM)分別或合在一起在T4DNA連接酶緩沖液(50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，10mMDTT，1mMATP，25μg/mlBSA)中混合，反應(yīng)體積為50μl。在95℃加熱3分鐘，然后加5個衛(wèi)斯單位(WeissUnits)的T4DNA連接酶，37℃30分鐘；3、從上述反應(yīng)中取出25μl，與等體積的下列混合液混合50mMTris-HCl，pH7.5，10mMMgCl2，1mMDTT，400μMdNTP，0.2μMP1引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃15分鐘后，再加0.2μMP2引物，150ngφ29DNA聚合酶，30℃60分鐘；4、加入等量的1∶1酚/氯仿混合液，混勻，離心5分鐘，取上層水相，加十分之一體積的3M醋酸鈉(pH6.0)，2.5倍體積的95％乙醇，14000rpm離心15分鐘，將沉淀溶解在10μl純水或TE緩沖液(10nMTris-HCl，pH7.5，0.1mMEDTA)中；5、將上述DNA用限制性內(nèi)切酶在15μl反應(yīng)體積中切割。6、加入3μl6X電泳樣品緩沖液(30％甘油，0.25％溴酚藍染料)，在3％的瓊脂糖或6％的聚丙烯酰胺中電泳，然后用溴化乙錠或硝酸銀染色，檢查100bpDNA帶。說明本方法中，uspA是鑒定大腸桿菌的探針，也是整個RCA-RED反應(yīng)的陽性對照。如果用BamHI切割后，應(yīng)該檢查出120bp的DNA帶，否則為試驗失敗。uspA的陰性對照為Pseudomonassp.，Klebsiellapneunomiae等細(xì)菌的DNA樣品。在三組探針單獨用來檢測時，EcoRI或HindIII或TaqI的切割應(yīng)該得到相同的結(jié)果，而EcoRV和KpnI的切割則分別檢測LTI和STI基因，其長度分別為100和140bp。在三組探針合在一起用來檢測時，EcoRI或HindIII或TaqI的切割應(yīng)該得到相同的結(jié)果，即全部為陽性時，應(yīng)該出現(xiàn)100，120，140bp三條帶。用BamHI或EcoRV或KpnI切割時，分別檢查uspA(120bp)，LTI(100bp)，和STI(140bp)的存在。RCA-RED試劑盒的組成1、從生物體內(nèi)提取、純化DNA或RNA，或DNA/RNA的試劑根據(jù)檢測對象的性質(zhì)(動物、植物、真菌、細(xì)菌等)，本試劑盒提供不同的試劑。這些試劑可以是自制的，也可以是從其他制造商處購買的；2、T4DNA連接酶及其反應(yīng)緩沖液；3、純凈水；4、DNA聚合酶(如φ29DNA聚合酶，T5DNA聚合酶，M2DNA聚合酶等)及其反應(yīng)緩沖液。這些酶可以是自制的，也可以是從其他廠家購買的；5、四種脫氧核苷酸，即dATP，dCTP，dGTP，dTTP；6、限制性內(nèi)切酶(如EcoRI，BamHI，HindIII，TaqI，SalI，EcoKV，Smal，等)及其反應(yīng)緩沖液每個試劑盒內(nèi)包括1-3種內(nèi)切酶，具體種類根據(jù)探針設(shè)計的不同而不同；7、特定目的基因的引物包括，但不限于C-探針，G-探針，P1、P2引物，如馬傳染性貧血前病毒DNA檢測試劑盒，地中海血病基因檢測試劑盒，大腸桿菌毒素基因檢測試劑盒，轉(zhuǎn)基因植物檢測試劑盒等；8、陽性目的基因?qū)φ眨?、正常生物樣品(陰性)對照；10、使用說明書。權(quán)利要求1.一種基因的等溫滾環(huán)復(fù)制與限制性內(nèi)切酶檢測方法，命名為RCA-RED，其基本步驟包括(1)、將DNA探針與待檢樣品的DNA或RNA混合，使DNA探針與目的基因雜交。該引物探針上有特定的限制性內(nèi)切酶切割位點；(2)、加入DNA連接酶，使DNA探針連接成環(huán)狀；(3)、加入DNA聚合酶和復(fù)制引物，今其以滾環(huán)方式復(fù)制并合成雙鏈DNA；(4)、加入限制性內(nèi)切酶，將復(fù)制的DNA切割成特定長度的片段；(5)、通過電泳，如平板瓊脂糖凝膠電泳，垂直聚丙烯酰胺電泳，毛細(xì)管電泳等，檢查特定長度的DNA片段；2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因的等溫滾環(huán)復(fù)制與限制性內(nèi)切酶檢測方法，其特征是RCA-RED引物的設(shè)計方法，包括在環(huán)狀復(fù)制模板上加入限制性內(nèi)切酶切割位點。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述方法而組裝的RCA-RED試劑盒，其中包括(1)、從生物體內(nèi)提取、純化DNA或RNA，或DNA/RNA的試劑；(2)、T4DNA連接酶及其反應(yīng)緩沖液；(3)、純凈水；(4)、DNA聚合酶及其反應(yīng)緩沖液；(5)、四種脫氧核苷酸，即dATP，dCTP，dGTP，dTTP；(6)、限制性內(nèi)切酶及其反應(yīng)緩沖液；(7)、針對特定目的基因設(shè)計的引物，包括，但不限于C-探針，G-探針，P1、P2引物；(8)、陽性目的基因?qū)φ眨?9)、正常生物樣品(陰性)對照；(10)、使用說明書。全文摘要本發(fā)明公開了一種基因的等溫滾環(huán)復(fù)制與限制性內(nèi)切酶檢測方法及其試劑盒,其主要內(nèi)容是,在試管內(nèi)用特定DNA探針與目的基因雜交,用DNA連接酶把探針連接成環(huán)之后,以滾環(huán)方式復(fù)制、擴增DNA模板,然后通過限制性內(nèi)切酶將擴增的DNA降解成一定長度的片段,最后通過電泳來檢測目的基因是否被擴增。與通用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相比,用本方法檢測特定的基因序列不需要價格昂貴的DNA擴增儀,可以直接檢測DNA和RNA分子,具有簡單、方便、經(jīng)濟、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點?？捎糜诎▌游铩⒅参锖臀⑸锏幕驒z測和基因擴增。試劑盒根據(jù)檢測對象的性質(zhì)(動物、植物、真菌、細(xì)菌等)提供不同的試劑,令檢測更方便。文檔編號C12Q1/68GK1384208SQ0113343公開日2002年12月11日申請日期2001年11月7日優(yōu)先權(quán)日2001年11月7日發(fā)明者葛莘申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)糖業(yè)研究院