專利名稱：納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù)，更具體地說，涉及納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和在基因雜交中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因研究帶動了20世紀(jì)整個生命科學(xué)的迅速發(fā)展；在21世紀(jì)，基因研究仍將推動生命科學(xué)研究向縱深發(fā)展?；驒z測不僅對生物學(xué)研究至關(guān)重要，而且對臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、農(nóng)業(yè)技術(shù)、環(huán)境監(jiān)控、法學(xué)鑒定等領(lǐng)域也具有極其重要的意義。
基因檢測一般采用直接測序或雜交檢測。直接測序就是直接分離、擴增、純化基因片段后，采用末端鏈終止反應(yīng)原理測定核酸中的每個核苷酸組成及其排列順序。測序方法有同位素、銀染、四色熒光標(biāo)記激光共聚焦測序等，這些方法都需要復(fù)雜的程序，昂貴的試劑和配套昂貴的設(shè)備。相比之下，雜交檢測進行基因檢測方法簡單、方便，因此，基因傳感器和基因芯片等基于雜交檢測。
傳統(tǒng)基因檢測進行基因探針的標(biāo)記方法有放射法、酶標(biāo)法、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記法等；近年來，銀染法也在DNA序列分析中得到廣泛應(yīng)用。放射法靈敏度高，但因其對環(huán)境有污染，正逐漸被非放射法所取代。酶標(biāo)法由于反應(yīng)過程復(fù)雜，酶催化底物反應(yīng)過快，顯色區(qū)域不集中，限制了它的使用，特別是不適合生物芯片領(lǐng)域的應(yīng)用?；瘜W(xué)發(fā)光標(biāo)記法、普通銀染法及一些其它的標(biāo)記方法則由于靈敏度較低而使其應(yīng)用受到很大限制。
基因芯片的出現(xiàn)使得大規(guī)模生物信息的同時存儲與處理成為現(xiàn)實。迄今，比較成熟的基因芯片檢測方法是激光掃描共聚焦顯微法，但其程序復(fù)雜，檢測設(shè)備昂貴，難于推廣和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有基因檢測技術(shù)存在的問題和不足，提供一種由納米微粒表面共價結(jié)合寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成的納米微粒標(biāo)記基因探針；本發(fā)明的另一個目的是提供一種本發(fā)明的納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法；本發(fā)明還有一個目的是將本發(fā)明的基因探針作為基因雜交檢測，特別適合于低集成度診斷型基因芯片的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，即將表面合成化學(xué)、生物化學(xué)及物理化學(xué)技術(shù)有機結(jié)合起來，解決目視法基因檢測技術(shù)設(shè)計與制造中的關(guān)鍵技術(shù)；提供雙探針雜交銀粒子著色進行微量DNA檢測與信息放大的最新工藝，進而研究具有實用價值的能夠用于多種目的基因檢測的目視法基因芯片檢測系統(tǒng)，如肝炎(七種肝炎病毒)等傳染性疾病或遺傳疾病臨床用目視法基因芯片診斷系統(tǒng)，推動基因診斷技術(shù)的進步。本發(fā)明包括三方面的內(nèi)容納米基因探針、該種探針的制備方法、該種探針的應(yīng)用。其創(chuàng)新點在于探針制備，納米放大，目視顯色主要技術(shù)，適用于各類用途的基因檢測，特別適合于低集成度基因芯片領(lǐng)域。
1、探針制備，即基因探針的制備。該探針是由納米微粒表面共價結(jié)合100～1000個寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成，納米微粒的化學(xué)組成包括金、銀原子，硫化鎘、氧化鐵、氧化硅等分子，微粒與寡核苷酸通過二硫鍵、醚鍵、硫胺酯鍵結(jié)合，寡核苷酸與微粒的結(jié)合處有脂肪烴臂，寡核苷酸為單鏈DNA或RNA。
探針的制備方法和注意事項包括如下①膠體金或納米微粒的制備，目前通過將氯金酸溶液煮沸還原法，通過添加還原劑和攪拌速度來控制粒徑。也可采用反向膠束法等方法制備。粒徑一般使用8～160納米。
②DNA探針分子設(shè)計及委托合成與修飾，要根據(jù)不同用途設(shè)計不同的DNA堿基順序并連接不同的基團，如用于交連到玻片上的探針，除了在5’端添加氨基等活性基團外，還應(yīng)增加脂肪酸鏈或非特異性核苷酸以克服雜交時的空間位阻。用于納米微粒標(biāo)記的DNA探針除了考慮雜交時的空間位阻外，更重要的是應(yīng)考慮使用易于與納米微粒交連固定的活性基團，如巰基(-SH)。
③納米標(biāo)記探針的自組裝合成與封閉，這是本發(fā)明實現(xiàn)與否的關(guān)鍵，只有嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，才能使多達成百上千的基因探針牢牢地以共價鍵結(jié)合到納米金上，使用牛血清白蛋白或聚乙二醇或鮭魚精子DNA封閉多余的活性位點后，經(jīng)過后續(xù)的雜交反應(yīng)，才能使銀粒子特異性富集。
2、納米放大，主要通過“金標(biāo)記寡核苷酸探針”或納米微粒探針與固定到波片、尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片上的雙探針與目的或待檢DNA片段特異性地互補雜交，通過氫鍵形成一種多級三維聚集的立體結(jié)構(gòu)，借重與基片上固定的探針形成化學(xué)鍵將雜交聚集體錨定在固體支持物上，實現(xiàn)雜交信號的分子聚集放大。
3、目視顯色，是在上述特異性的雜交聚集體形成的基礎(chǔ)上，將銀鹽(如硝酸銀)和還原劑添加在雜交體系中，首先通過靜電相互作用將帶正電荷的銀離子吸引到帶負(fù)電荷的核酸片段周圍和納米金球表面，再被還原成銀原子，在成核理論作用下沉積在雜交聚集體四周，顯示出銀灰色，從而將雜交信號放大100萬倍以上。在光學(xué)效應(yīng)上實現(xiàn)了目視顯色，觀察基因雜交結(jié)果。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果①具有靈敏度高、特異性好、簡便、快速、廉價的特點。
②既可用于單基因檢測，也可應(yīng)用于多基因集成檢測，如多種傳染性微生物病原的臨床檢測、癌癥早期診斷、遺傳病產(chǎn)前診斷與在體常規(guī)體檢，基因表達調(diào)控研究，特征基因表達譜檢測，基因文庫篩選等，尤其適用于低集成度基因芯片檢測，有很好的臨床使用價值。
③本發(fā)明所述的納米微粒也適用于采用免疫學(xué)原理的免疫組化檢測，如蛋白質(zhì)芯片檢測等。
四

圖1為本發(fā)明實施步驟方框圖；圖2為硅烷化處理反應(yīng)分子機理示意圖。
其中1-基因探針合成與修飾，2-納米粒子制備與表征，3-硅烷化處理4-金標(biāo)探針制備與表征，5-載體表面探針固定，6-雜交與納米放大，7-模式識別體系配套，8-基因目視檢測，9-結(jié)果分析。
由圖1可知，本發(fā)明的實現(xiàn)和應(yīng)用包括9大步驟每個步驟的技術(shù)要求都比較高，必須由專業(yè)技術(shù)人員嚴(yán)格控制工藝過程，方能達到新方法所述基因檢測的標(biāo)準(zhǔn)。
①基因探針合成與修飾1，主要是作好分子設(shè)計，一般借重分子生物學(xué)設(shè)計軟件完成。如上所述，要根據(jù)不同用途設(shè)計不同的DNA堿基順序并連接不同的基團。總的要求是便于探針與固相支持物交連固定和便于充分雜交。
②納米粒子制備與表征2，我們使用加熱還原法，也可使用反向膠束等其它方法。根據(jù)不同的基因檢測需要制備不同粒徑和外型的納米微粒。納米粒子的表征可以使用透射電子顯微鏡、瑞利(Rayleigh)散射光譜、X-射線衍射，現(xiàn)已有專門納米測量儀器出售。
③硅烷化處理3，使用現(xiàn)有基因芯片技術(shù)中的玻片處理方法，略加改進。
④納米標(biāo)記探針制備與表征4，指金標(biāo)基因探針的制備。要選用合適粒度的納米金，一般選用8～160nm(分辯率要求越高粒徑越小，濃度為10～20nM)與預(yù)先針對目的基因片段設(shè)計、合成并用烷基巰基修飾好的DNA寡核苷酸水溶液，濃度1～10μM(微摩爾)在溫度為15～40℃，控制反應(yīng)的PH值為6～8之間，時間為10～20小時，繼續(xù)在0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液中放置30～50小時后，12000～16000離心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液反復(fù)洗滌三次，最后加入0.3MNaCl，10mM磷酸緩沖液(pH7)，0.01％疊氮化納，4℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物冷藏保存。表征方法目前采用紫外吸收法和瑞利散射法。
⑤載體表面探針固定5，采用直接點樣法，探針濃度10-5～10-11摩爾。反應(yīng)過程中要保持潤濕和無菌狀態(tài)。
⑥雜交與納米放大6，如前所述。
⑦模式識別體系配套7，指事先設(shè)計規(guī)定好的結(jié)果判定方法、標(biāo)準(zhǔn)；與檢測相對應(yīng)的信號識別軟件及必要的識別、掃描和分析設(shè)備配套。
⑧基因目視檢測8，通過探針雜交后經(jīng)過納米放大銀染看是否顯色，顯出灰褐色的即為有基因雜交信號，可以用肉眼觀察直接判定檢測結(jié)果。
⑨結(jié)果分析9，將上述顯色結(jié)果，經(jīng)過模式識別和分析處理后，將檢測結(jié)果整理輸出。
由圖2可知，玻片表面在處理過程中經(jīng)過了一系列化學(xué)變化，通過硅烷化偶聯(lián)劑和/或手臂分子將寡核苷酸探針共價結(jié)合到玻片上，便于以后步驟的穩(wěn)定實施。固相載體如果用硝酸纖維素膜、尼龍膜、納米粒等可不用硅烷化處理，只需活化過程。
本發(fā)明流程如下1、基片表面處理以玻片為基片的檢測芯片為例用濃硝酸煮洗玻片10分鐘，再用蒸餾水洗3次，放入烘箱40℃烘干。
取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶聯(lián)劑PDITC(苯2異硫氰酸酯)加入容器中，再將玻片浸入其中40分鐘。用丙酮(分析純)洗滌玻片5次(5分鐘/次)，再將玻片烘干。
把玻片放入0.2％PDITC溶液中，置于烘箱中2小時(維持溫度37℃)。
從PDITC中取出玻片，先用甲醇洗滌5次(5分鐘/次)，再用丙酮洗滌2次，最后用雙蒸水洗滌一次，晾干。
將光密度值為1OD(吸光度值)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100μl(微升，容積單位)TE(Tris-EDTA緩沖液，分子生物學(xué)常用試劑)中，然后將單鏈DNA點在玻片上，將玻片在4℃放置5小時，轉(zhuǎn)入潮濕的環(huán)境下40℃放置2小時。
2、納米金微粒(膠體金)的制備(100ml)將0.01％的HAuClO4(氯金酸)加熱至沸。攪拌下加入2-4ml、1％的檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O)，繼續(xù)加熱煮沸15分鐘。停止加熱，攪拌下冷卻至室溫，用蒸餾水恢復(fù)至原體積，粒徑8～140納米。
3、納米金微粒探針的制備用0.1M Na2CO3(碳酸納)或1M Tris堿調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH至選定值，選擇pH7±0.5為反應(yīng)pH值。原則上可選擇待標(biāo)記核酸或蛋白質(zhì)等電點，也可略微偏堿。但通常最適反應(yīng)pH往往需經(jīng)多次試驗才能確定。
取制備好的納米金球1ml(14nm)，離心(10000轉(zhuǎn)左右)，去除沉淀物。再16000～25000轉(zhuǎn)離心30～5分鐘，去上清，再加入1ml(0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液，0.2％的PEG(聚乙二醇)或BSA(牛血清白蛋白))溶液，超聲旋起，重復(fù)3次，以除去雜物。
將1OD DNA溶解在100μlTE中，加入上述1ml納米金球溶液中，室溫放置1小時，然后在4℃放置過夜，離心洗滌去上清后加入終濃度為0.3M NaCl，10mM磷酸緩沖液，0.01％疊氮化納的溶液體系中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> 4、雜交取PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴增產(chǎn)物或直接提取的目標(biāo)序列溶解在100μlTE中，取1-10μl溶解到1-50ml 8×PBS(磷酸緩沖液)中(濃度大于100nM)，將固定好DNA的玻片與之雜交(50℃ 1小時，4℃放置過夜)，然后，加入納米金探針1-50μl(濃度大于5nM)，繼續(xù)雜交2～4小時。
5、染色(1)溶液配制A、銀顯影液*乳酸銀顯影液
a.10％阿拉伯膠水溶液或1％明膠60mlb.枸櫞酸緩沖液(pH3.5)10mlc.對苯二酚0.85g，加水15ml溶解d.乳酸銀0.11g，加水15ml溶解以上a～c用前混合過濾，最后加入d.注意避光.
*硝酸銀顯影液a.10％阿拉伯膠水溶液或1％明膠60mlb.枸櫞酸緩沖液(pH3.5)10mlc.對苯二酚1.7g，加水30ml溶解d.硝酸銀50mg，加水2ml溶解以上a～c用前混合過濾，最后加入d.注意避光。
以上兩種顯影液中，如以蒸餾水代替阿拉伯膠或明膠，則顯色速度明顯加快，要在鏡下控制顯色程度。
B、枸櫞酸緩沖液枸櫞酸(C6H8O7·H2O) 2.55g枸櫞酸三鈉(C6H5Na3O7·H2O) 2.35g加蒸餾水100ml溶解。
C、定影液20％硫代硫酸鈉(2)顯色步驟將雜交后的玻片取出，分別用8×PBN漂洗3次，每次2分鐘。銀染色反應(yīng)將基因芯片用去離子水洗滌3×6分鐘，除去Cl-(氯離子)，接著于0.2M pH3.5檸檬酸緩沖液中浸泡3分鐘，然后將玻片放入裝有顯影液的平皿中作用10～15分鐘，再將玻片放入定影液中3分鐘，取出用大量去離子水洗滌后，自然干燥。
判定凡是著色很深、呈均勻一致的灰黑色斑點，與背景反差強者判為強陽性(+++)；著色較深，與背景反差較強者判為陽性(++)；著色淡，與背景反差小者判為弱陽性(+)；不著色者判為陰性(-)。
②玻片的處理用濃硝酸煮洗玻片10分鐘，再用蒸餾水洗，放入烘箱烘干。
③寡核苷酸溶液的配制將光密度值為1.0(約33ug)的5’-氨基寡核苷酸溶解于100ulTE中，濃度約為3.35×10-5mol/L。5’-氨基寡核苷酸序列5’-NH2-GGACTT CTC TCA ATT TTC TAG GG-3’(2)玻片的硅烷化處理，捕獲DNA與玻片的交聯(lián)①活化取1.5毫升水，28毫升丙酮和600微升硅烷化偶聯(lián)劑加入一培養(yǎng)皿中，再將玻片浸入其中40分鐘。用丙酮洗滌玻片5次(5分鐘/次)，再將玻片烘干。
②PDC交聯(lián)把玻片放入0.2％PDITC溶液，置于烘箱中2小時(維持濕度37攝氏度)。從PDITC中取出玻片，先用甲醇洗滌5次(5分鐘/次)，再用丙酮洗滌2次，最后用雙蒸水洗滌一次，晾干。
③DNA探針的固定將單鏈乙丙型肝炎DNA探針點在玻片上不同的位點，然后將玻片在4℃放置5小時，潮濕的環(huán)境下40℃放置2～4小時。
(3)納米微粒金銀放大目視顯色法檢測基因①膠體金的制備，同上。
②在納米金球上修飾HS-DNA。技術(shù)同上，帶巰基修飾的乙丙肝病毒特異性基因探針通過專門設(shè)計軟件設(shè)計序列后委托專業(yè)公司合成HS-DNA。
(4)目的基因獲取與制備。用常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)提取病毒核酸或者以此作為模版進行PCR擴增，使病原基因達到檢測最低濃度。
(5)雜交。
取1OD目標(biāo)序列溶解在100ulTE中，取1-10μl溶解到1-50ml8×PBS中(濃度大于100nM)，將固定好DNA的玻片與之雜交(50℃ 2小時，4℃放置過夜)，然后，加入納米金探針1-50μl(濃度大于5nM)，繼續(xù)雜交2小時。
(6)染色①銀顯影液硝酸銀顯影液、枸櫞酸緩沖液同上配制。
②定影液20％硫代硫酸鈉③顯色將雜交后的玻片取出，分別用8×PBN漂洗3次，每次2分鐘。銀染色反應(yīng)將基因芯片用去離子水洗滌3×6分鐘，除去Cl-，接著于0.2M pH3.5檸檬酸緩沖液中浸泡3分鐘，然后將玻片放入裝有顯影液的平皿中作用10～15分鐘，再將玻片放入定影液中3分鐘，取出用大量去離子水洗滌后，自然干燥。
判定準(zhǔn)則同上。
(7)結(jié)果。
芯片上固定有乙肝病毒基因探針的點與對應(yīng)的乙肝病毒檢測金標(biāo)探針與乙肝陽性血清PCR擴增產(chǎn)物雜交后著色很深、呈均勻一致的灰黑色斑點，與背景反差強.顯色率100％，同瓊脂糖凝膠檢測符合率100％。而對照所用丁肝特異性cDNA作捕獲DNA探針，檢測乙肝陽性血清PCR擴增產(chǎn)物，呈空白斑點，不著色，判為陰性。
權(quán)利要求
1.一種納米微粒標(biāo)記基因探針，其特征在于該探針是由納米微粒表面共價結(jié)合100～1000個寡核苷酸單鏈基因探針分子構(gòu)成，納米微粒的化學(xué)組成包括金、銀原子，硫化鎘、氧化鐵、氧化硅分子，微粒與寡核苷酸通過二硫鍵、醚鍵、硫胺酯鍵結(jié)合，寡核苷酸與微粒的結(jié)合處有脂肪烴臂，寡核苷酸為單鏈DNA或RNA。
2.權(quán)利要求1所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法，其特征在于①膠體金或納米微粒的制備；②DNA探針分子設(shè)計及合成與修飾；③金納米基因標(biāo)記探針的自組裝合成與封閉。
3.權(quán)利要求1所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于該探針應(yīng)用于基因雜交檢測或低集成度診斷型基因芯片。
4.按權(quán)利要求2所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法，其特征在于金標(biāo)探針的自組裝合成選用粒度8～160nm的納米金，與預(yù)先針對目的基因片段設(shè)計、合成并用烷基巰基修飾好的DNA寡核苷酸水溶液，濃度1～10μM(微摩爾)在溫度為15～40℃，控制反應(yīng)的PH值為6～8，時間為10～20小時，繼續(xù)在0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液中放置30～50小時后，12000～16000離心去上清，加入0.1M NaCl，10mM磷酸緩沖液反復(fù)洗滌三次，最后加入0.3MNaCl，10mM磷酸緩沖液，0.01％疊氮化納，4℃保存。
5.按權(quán)利要求3所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于納米放大主要通過金標(biāo)記寡核苷酸探針與固定到玻片、尼龍膜、硝酸纖維素膜等基片上的雙探針與目的或待檢DNA片段特異性地互補雜交，通過氫鍵形成一種多級三維聚集的立體結(jié)構(gòu)，借重與基片上固定的探針形成化學(xué)鍵將雜交聚集體錨定在固體支持物上，實現(xiàn)雜交信號的分子聚集放大。
6.按權(quán)利要求3所述的一種納米微粒標(biāo)記基因探針的應(yīng)用，其特征在于目視顯色是在特異性的雜交聚集體形成的基礎(chǔ)上，將銀鹽和還原劑添加在雜交體系中，首先通過靜電相互作用將帶正電荷的銀離子吸引到帶負(fù)電荷的核酸片段周圍和納米金球表面，再被還原成銀原子，沉積在雜交聚集體四周，顯示出銀灰色。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因檢測技術(shù),具體地說,涉及納米微粒標(biāo)記基因探針及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供納米微粒標(biāo)記基因探針代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標(biāo)記探針以克服它們分別存在的問題和不足,使其從實驗室走向?qū)嶋H應(yīng)用。納米微粒標(biāo)記基因探針的制備方法是:膠體金或納米微粒的制備,DNA探針分子設(shè)計及合成與修飾,金標(biāo)探針的自組裝合成與封閉。該探針適用于各類用途的基因雜交檢測,進行納米放大和目視顯色;特別適用于低集成度診斷型基因芯片應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK1339609SQ0113352
公開日2002年3月13日 申請日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者龐代文, 王業(yè)富, 張志凌, 曹軍平, 蔡汝秀, 鄭鵠志 申請人:武漢大學(xué)