專利名稱：川貝母類藥材聚合酶鏈反應－限制性酶切圖譜鑒定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥材種質的品質鑒定技術領域。
背景技術：
中藥川貝母為百合科植物川貝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫貝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肅貝母Fritillaria przewalskii Maxim、或梭砂貝母Fritillaria delavayi Franch.的干燥鱗莖，川貝母具有清熱潤肺，化痰止咳之功效，用于肺熱燥咳，干咳少痰，陰虛勞咳，咯痰帶血等癥的治療。由于川貝母的療效好，毒性低，自然資源有限，人工栽培困難，因此是貝母類藥材中最名貴的品種，市場價格很高。市場上可見用貝母屬其它種植物的小鱗莖冒充川貝母的現(xiàn)象。然而，用通常的型態(tài)及顯微等鑒定方法難以將川貝母與其偽品區(qū)別開來，因此尋找可靠的用于川貝母鑒定的方法是貝母藥材鑒定中的一個重要問題。川貝母主產于我國西南地區(qū)，由于其親緣關系較近，地理分布較為集中，因而具有相似的遺傳背景。通過比較各種貝母nrDNAITS區(qū)堿基序列，找到了川貝母與其它種類貝母DNA序列的差別，這種差別可通過聚合酶鏈反應(PCR)與限制性內切酶反應的片段多態(tài)性(RFLP)加以區(qū)別。但這種鑒別對于不同的物種，其所用的引物、限制性內切酶的種類及鑒別方法都不相同。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種準確鑒別川貝母的PCR-RFLP分子鑒定方法，包括川貝母的特征DNA堿基序列、一對PCR引物、一種限制性內切酶酶切位點及其鑒定方法。
本發(fā)明的技術方案如下首先從各藥材中提取總DNA，利用一對引物，用PCR方法擴增一段DNA片段，經純化后，對該片段進行DNA序列測定，建立各樣品的DNA序列數(shù)據(jù)庫，在比較數(shù)據(jù)庫DNA序列的基礎上，得到川貝母的特征DNA堿基序列為5’-TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC-3’，針對川貝母與其它種貝母DNA序列的差異，選擇合適的DNA限制性內切酶酶切位點，通過分析聚合酶鏈反應產物的限制性酶切圖譜差異，達到快速、準確鑒別川貝母的目的。對需要鑒定的貝母樣品，提取其DNA，在給定的PCR條件下，用一對引物(P1、P2)，供試品能夠擴增出一段DNA片段；用限制性內切酶Sma I或其同切酶對供試品的PCR擴增產物進行酶切后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，川貝母會出現(xiàn)119，188bp的條帶，而其它種類的貝母不出現(xiàn)上述兩條帶。當供試樣品經用本法進行PCR擴增，并對PCR產物進行限制性內切酶酶切后，經瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA片段的大小，便可準確地鑒定川貝母或非川貝母藥材。本發(fā)明設計的用于鑒別川貝母PCR-RFLP分子鑒定方法是采用以下步驟1、藥材DNA的提取按常規(guī)進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節(jié)至0.2～0.5μg/μl；2、擴增DNA片段，即進行聚合酶鏈反應，用于聚合酶鏈反應的一對引物的DNA序列為P15’-CGTAACAAG GTTTCC GTAGGT GAA-3’P25’-GCTACG TTC TTC ATC GAT-3’3、PCR擴增產物中加入限制性內切酶Sma I或其同切酶進行酶切，限制性內切酶Sma I或其同切酶的酶切位點為CCC^GGG；4、瓊脂糖凝膠電泳分析；5、鑒定結果的判斷，若出現(xiàn)119，188bp條帶則供試品為川貝母。
本發(fā)明的效果是可解決川貝母與其它種貝母相區(qū)別的鑒定難題，提供鑒定所需的一對PCR引物、PCR反應條件、川貝母的特征DNA堿基序列、一種限制性內切酶。川貝母較其它種類的貝母所含的有效成分有差別，毒性很小，且不易栽培，因此市場上川貝母的價格顯著高于其它種貝母。然而，川貝母與其它種貝母難以通過形態(tài)、顯微等特征來加以區(qū)別，因此，急需找到一種可靠的鑒別方法。本發(fā)明利用川貝母與其它種貝母藥材DNA序列的差異，建立了快速、便捷、可靠的PCR-RFLP鑒別方法，對于保證川貝母的藥材質量，打擊假冒川貝母的市場行為具有重要的價值。
具體實施例方式1、DNA的提取按常規(guī)進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節(jié)至0.2～0.5μg/μl；2、聚合酶鏈反應(1)聚合酶鏈反應以30μl為參考，各種物品的用量分別為10×PCR緩沖液 3μlMgCl2(25mM) 2.4μldNTP(各10mM) 0.6μl引物P1、P2(30pmol/μl) 各0.5μl供試品DNA模板 1～2μlTaqDNA聚合酶 1U(0.2μl)無離子水 補齊至30μl(2)PCR反應條件反應在PCR儀上進行，反應條件為95℃予變性3min，然后按以下條件進行30循環(huán)變性95℃20～40秒復性53℃20～40秒延伸72℃20～40秒循環(huán)結束后在72℃保持2～4分鐘補齊，反應結束后在4℃保存。
(3)PCR產物的電泳檢測取上述反應液4μl，與1μl載樣緩沖液混合，用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μL溴化乙錠，即EB)電泳檢測擴增結果，各種DNA樣品均能擴增出一條約307bp的DNA條帶；3、聚合酶鏈反應產物的限制性內切酶酶切反應DNA限制性內切酶酶切反應反應液參考體積為20μl，其中各種物品的用量為PCR產物 5～10μL10×R+限制性內切酶緩沖液 2μL限制性內切酶Sma I 5U無離子水補齊至20μL將反應液置37℃保溫3～4小時，反應結束后置于65℃水浴10分鐘，使酶失活；4、電泳觀察酶切結果酶切產物用2％瓊脂糖凝膠(含0.5μg/μl的溴化乙錠，即EB)，在4V/cm電場強度下電泳30～50分鐘，觀察電泳結果；
5、測定結果的判斷，使用限制性內切酶Sma I或其同切酶對聚合酶鏈反應擴增產物進行酶切，產生對川貝母與非川貝母具有鑒別性特征的酶切DNA片段長度圖譜。若供試品出現(xiàn)119，188bp的兩個片段，則為川貝母；若不出現(xiàn)上述兩個片段，則不為川貝母。川貝母類藥材聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜鑒定方法<110>中國藥科大學<120>川貝母類藥材聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜鑒定方法<160>3<210>1<211>24<212>DNA<213>川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，F(xiàn)ritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，F(xiàn)ritillaria przewalskii Maxim，F(xiàn)ritillaria delavayi Franch.)<400>1cgtaacaagg tttccgtagg tgaa<210>2<211>18<212>DNA<213>川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，F(xiàn)ritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，F(xiàn)ritillaria przewalskii Maxim，F(xiàn)ritillaria delavayi Franch.)<400>1gctacgttct tcatcgat<210>3<211>24<212>DNA<213>川貝母(Fritillaria cirrhosa D.Don，F(xiàn)ritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia，F(xiàn)ritillaria przewalskii Maxim，F(xiàn)ritillaria delavayi Franch.)<400>1tgcccgccct gcccgggacc tcgc
權利要求
1一對聚合酶鏈反應擴增引物的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為P15’-CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGT GAA-3’，P25’-GCT ACG TTC TTCATC GAT-3’。
2一種川貝母特有的DNA堿基序列，其特征在于DNA序列為5’-TGCCCGCCCT GCCCGGGACC TCGC-3’。
3一種川貝母聚合酶鏈反應-限制性酶切圖譜，其特征在于能夠識別川貝母特有DNA堿基序列的限制性內切酶Sma I及其同切酶對聚合酶鏈反應產物消化后的瓊脂糖凝膠電泳的特征圖譜。鑒定方法為(1)、藥材DNA的提取按常規(guī)進行，用無離子水將供試樣品的DNA濃度調節(jié)至0.2～0.5μg/μl；(2)、擴增DNA片段，用引物P1、P2進行聚合酶鏈反應(PCR)，得到聚合酶鏈反應擴增產物(3)、PCR擴增產物中加入限制性內切酶Sma I或其同切酶進行酶切，限制性內切酶Sma I或其同切酶的酶切位點為CCC^GGG；(4)、瓊脂糖凝膠電泳分析；(5)、鑒定結果的判斷若出現(xiàn)119，188bp的兩個片段，則供試品為川貝母，若不出現(xiàn)上述兩個片段，則供試品不為川貝母。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥材種質的品質鑒定技術領域，目的是提供一種準確鑒別川貝母與非川貝母類藥材的聚合酶鏈反應－限制性酶切圖譜分子鑒定方法(PCR－RFLP)。PCR擴增所用引物序列為P15’－CGT AAC AAG GTT TCC GTA GGTGAA－3’，P25’－GCT ACG TTC TTC ATC GAT－3’；川貝母的特征DNA堿基序列為5’－TGCCCGCCCTGCCCGGGACC TCGC－3’；限制性內切酶Sma I及其同切酶可識別并切割該序列。鑒定過程如下提取藥材DNA；用引物P1、P2進行PCR擴增；用限制性內切酶Sma I或其同切酶消化PCR產物；瓊脂糖凝膠電泳分析結果；通過與川貝母PCR－RFLP特征結果相比較，即可判斷供試品是否川貝母藥材。
文檔編號C12N15/10GK1487091SQ03131798
公開日2004年4月7日 申請日期2003年7月30日 優(yōu)先權日2003年7月30日
發(fā)明者李萍, 王沖之, 李 萍 申請人:中國藥科大學