5’端不受堿基限制的gRNA的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種5'端不受堿基限制的gRNA的制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases)以及轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸 酶 TALENs (transcription activator-like (TAL) effector nucleases)等基因組編輯技 術(shù)使得人們精確修飾基因組成為可能。在識別基因組上的DNA位點時，無論是鋅指核酸酶 還是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶都需要人工合成一個很大的識別蛋白，從實驗效率上來 講，大大地限制了這些技術(shù)的應(yīng)用。近2年來，一種稱之為CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9的技術(shù)涌現(xiàn)出來，由于其高效、設(shè)計簡 單、成本低廉，大大的提高了其可用性，使得人們快速編輯基因組成為可能。
[0003] CRISPR/Cas9系統(tǒng)原本是一種原核生物特有的針對外源性遺傳物質(zhì)的免疫系統(tǒng)， 通過序列特異的RNA介導(dǎo)，切割降解外源性DNA，從而提供免疫性。研究表明，原始的該系 統(tǒng)一共包含Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA以及RNase III四種成分。作為一種位點特異性 的基因編輯系統(tǒng)，其識別的特異性是由crRNA序列決定的，人工合成crRNA序列使得Cas9 系統(tǒng)識別并結(jié)合到與該crRNA互補的DNA序列上，最終介導(dǎo)Cas9蛋白特異性的切割該雜交 區(qū)域。除了 crRNA保證識別特異性外，一個被稱之為原型間隔序列毗鄰區(qū)（proto-spacer adjacent motif，PAM)的序列對于Cas9系統(tǒng)能夠有效穩(wěn)定的發(fā)揮作用有著重要的意義。該 序列其使得雙鏈RNA復(fù)合體與靶序列精準(zhǔn)的結(jié)合，并有效地避免了自身結(jié)合現(xiàn)象的發(fā)生。 為了進(jìn)一步的簡化操作過程，研究人員發(fā)現(xiàn)將crRNA和tracrRNA合并到在一起，同樣也能 被Cas9蛋白識別，并發(fā)揮相應(yīng)的剪切作用，并將其命名為 SgRNA(single guide RNA)。
[0004] 最新研究結(jié)果顯示，Cas9作為一種基因組編輯工具已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、植物、線 蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠和人的細(xì)胞模型之中。雖然該系統(tǒng)操作簡單、但是其仍然有自身的不 足。一是由于sgRNA對靶序列識別的長度只有20個堿基，且Cas9蛋白對sgRNA 5'端序列 與靶位點的錯配不敏感，這使得Cas9-sgRNA技術(shù)的脫靶率比較高。目前人們已經(jīng)可以利用 成對的突變Cas9突變核酸酶（Cas9D10A)，以及Cas9-FokI融合蛋白等造成雙位點識別切 害J，有效的提高了 Cas9-gRNA技術(shù)的特異性。二是Cas9系統(tǒng)的識別位點需要滿足（N2(]NGG) 的條件，它不像TALEN可以全基因組選擇，這就一定程度上限制了位點的選擇，理論上基因 組上每8個堿基才會出現(xiàn)這樣一個位點。再加上sgRNA需要promoter啟動，如目前最廣泛 應(yīng)用的U6啟動子。該啟動子還需要第一位為G堿基，以確保轉(zhuǎn)錄的有效性，使得位點選擇 變?yōu)椋℅N 19NGG)。如果換成體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA，則需要用到T7或者SP6啟動子，同樣這些 啟動子也需要受到起始堿基為G的限制，使得基因組上選擇位點的可能性變成了每32個堿 基才會出現(xiàn)一個位點。從單純的造成基因突變獲得突變體來看，雖然有這些限制存在，但是 我們依然可以很好的找到位點來達(dá)到我們的目的，但是基因編輯系統(tǒng)更為重要的意義在于 它可以精確的修飾基因組任意位置。研究表明，雙鏈DNA斷裂（Double strand break，DSB) 離修飾位點越近，其相應(yīng)的成功率就越高，這就使得突破位點選擇的一些限制顯得意義極 其重大。
[0005] 由于PAM區(qū)對于位點識別的必須性，使得PAM區(qū)不能夠變化，那就只能從啟動子 的限制方面開始著手。目前關(guān)于這方面國外已經(jīng)有些報道。VinodRanganathan等人通過 H1啟動子代替常用的U6啟動子，一定程度上提高了 gRNA的選擇性。Hwang等人報道gRNA 可以容忍5'端2個堿基的錯配，因此可以硬性加上2個G以滿足T7啟動子的需要，然而 Gagnon等人又報道任何改變5'端GG的方法將會降低gRNA的效率。目前關(guān)于這一點并沒 有一個統(tǒng)一的說法。除了加入堿基以及更換啟動子這些方法外，還有一些通過引入其他位 點再剪切掉的方法。Yangbin Gao等人報道通過在sgRNA的5'和3'端加上特異的核酶，就 可以在體外和體內(nèi)造成修飾的gRNA的自我剪切，從而突破sgRNA位點選擇的限制。該研究 小組證明他們的系統(tǒng)在酵母中可以實現(xiàn)EGFP基因的成功突變。但是該系統(tǒng)本身仍然存在 問題，一是不知道該系統(tǒng)能否在高等動物中有效。二是由于核酶本身的切割效率有限，而修 飾過的未剪切的sgRNA本身將失去活性，兩者混合是否會影響gRNA的效率，另外該報道是 陽性報道，只能說明可以成功，但是具體的突變效率不得而知。Shengdar Q Tsai等人最近 報道在gRNA前后加上可以被Csy4核酶特異識別并切割的20bp的位點，可以使得gRNA釋 放進(jìn)而行使功能，他們宣稱這種方法得到的gRNA的效率大約是U6啟動子方法的90%，給 在細(xì)胞水平上的位點突破提供了新的解決方案。但是文中所檢測的位點效率范圍為3%~ 40%，效率并不是特別的高，且不同的細(xì)胞效率相差也很大，這也給該方法在整體動物上的 應(yīng)用帶來了不確定性。
[0006]因此提供一種在整體動物水平上有效的突破gRNA的5'端限制的方法顯得十分有 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 基于此，有必要提供一種5'端不受堿基限制的的gRNA的制備方法。
[0008] -種5'端不受堿基限制的gRNA的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 提供Csy4蛋白；
[0010] 將所述Csy4蛋白特異性識別的識別序列插入到gRNA對應(yīng)的DNA序列的N20位點 之前得到第一序列，在啟動子后插入用于提高轉(zhuǎn)錄效率的增益序列得到第二序列，通過搭 橋PCR的方法將所述第一序列與所述第二序列連接得到pre-gRNA轉(zhuǎn)錄模板，接著利用轉(zhuǎn)錄 試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄得到pre-gRNA ;以及
[0011] 將所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA加入到反應(yīng)液中，充分反應(yīng)后提純20~30min 后提純，提純得到的gRNA即為所需的gRNA。
[0012] 在一個實施例中，所述提供Csy4蛋白的步驟包括：
[0013] 將Csy4蛋白的表達(dá)序列全長克隆到表達(dá)載體中得到表達(dá)質(zhì)粒，將所述表達(dá)質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；
[0014] 將轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的所述大腸桿菌接入LB培養(yǎng)基擴增，擴增完成后誘導(dǎo)表達(dá) 12h ~16h ;
[0015] 將誘導(dǎo)后的大腸桿菌菌液在冰上加入裂解液進(jìn)行裂解，裂解完成后離心取上清； 以及
[0016] 對所述上清進(jìn)行純化后得到所述Csy4蛋白。
[0017] 在一個實施例中，所述裂解液包括50mM的NaH2P04、300mM的NaCl、10mM的咪唑、 0? 2mg/mL的溶菌酶以及ImM的三（2-羧乙基）膦。
[0018] 在一個實施例中，所述識別序列為SEQ ID No. 1所示的序列。
[0019] 在一個實施例中，所述增益序列為SEQ ID No. 2所示的序列。
[0020] 在一個實施例中，所述gRNA對應(yīng)的DNA序列為針對絡(luò)氨酸激酶、綠色熒光蛋白、尿 卟啉原脫羧酶或E3泛素化連接酶的DNA序列。
[0021] 在一個實施例中，所述啟動子為T7啟動子或SP6啟動子。
[0022] 在一個實施例中，所述將所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA加入到反應(yīng)液中的操作 中，所述Csy4蛋白與所述pre-gRNA的摩爾比為10 :1。
[0023] 在一個實施例中，所述反應(yīng)液包括20mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸和lOOmM的KC1。
[0024] 在一個實施例中，所述充分反應(yīng)后提純后提純的操作為：25°C反應(yīng)20~30min后 提采用RNA純化試劑盒提純。
[0025] 這種gRNA的制備方法可以快速的、高效的在體外制備gRNA，經(jīng)過試驗驗證，制得 的gRNA的5'端不受堿基限制，并且該gRNA在整體動物模型上有效。
【附圖說明】
[0026] 圖1為一實施方式的5'端不受堿基限制的gRNA的制備方法的流程圖；
[0027] 圖2為實施例1制得的Csy4蛋白的蛋白電泳圖，其中，M泳道為Marker，NI泳道 為未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白電泳圖，I泳道為經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的蛋白電泳圖，P泳道為純化的Csy4 蛋白；
[0028] 圖3a為針對絡(luò)氨酸激酶的gRNA與cas9mRNA注射進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后的明場照片；
[0029] 圖3b為針對絡(luò)氨酸激酶的gRNA效率檢測電泳圖，其中，M泳道為Marker，Ct 1泳 道為未注射gRNA組，tyr泳道為針對絡(luò)氨酸激酶的gRNA會造成特定DNA片段發(fā)生切割；
[0030] 圖4a為針對綠色熒光蛋白的gRNA與cas9mRNA注射進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后的熒光加 明場照片；
[0031 ] 圖4b為針對綠色熒光蛋白的gRNA的電泳圖，其中，M泳道為Marker，Ctl泳道為 未注射gRNA組，EGFP泳道為針對綠色熒光蛋白的gRNA會造成特定DNA片段發(fā)生切割；
[0032] 圖5a為針對尿卟啉原脫羧酶的gRNA與cas9mRNA注射進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后的熒光 加明場照片；
[0033] 圖5b為針對尿卟啉原脫羧酶的gRNA的電泳圖，其中，M泳道為Marker，Ctl泳道為 未注射gRNA組，urod泳道為針對尿卟啉原脫羧酶的gRNA會造成特定DNA片段發(fā)生切割；
[0034] 圖6a為針對E3泛素化連接酶的gRNA與cas9mRNA注射進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后的明場 照片；
[0035] 圖6b為針對E3泛素化連接酶的gRNA的電泳圖，其中，M泳道為Marker，Ct 1泳道 為未注射gRNA組，mib泳道為針對E3泛素化連接酶的gRNA會造成特定DNA片段發(fā)生切割。
【具體實施方式】
[0036] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對gRNA的制備方法做進(jìn)一步的解釋說明。
[0037] 如圖1所示的一實施方式的gRNA的制備方法，包括如下步驟：
[0038] S10、提供 Csy4 蛋白。
[0039] Csy4蛋白為一種在綠膿桿菌中鑒定得到核酸內(nèi)切酶，其可以特異地識別20個堿 基并造成特異位點切割。
[0040] 本實施方式中，Csy4蛋白通過體外誘導(dǎo)表達(dá)得到。
[0041] 具體的，提供Csy4蛋白的步驟包括：將Csy4蛋白的編碼序列從質(zhì)粒 (Plasmid#44252, addgene)中PCR得到，通過酶切連接方法克隆到表達(dá)載體中，得到表達(dá)質(zhì) 粒，將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中；將轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體的大腸桿菌接入LB培養(yǎng)基擴增，擴 增完成后誘導(dǎo)表達(dá)12h~16h ;將誘導(dǎo)后的大腸桿菌菌液在冰上加入裂解液進(jìn)行裂解，裂解 完成后離心取上清；以及對上清進(jìn)行純化后得到Csy4蛋白。
[0042] 其中，誘導(dǎo)表達(dá)的操作中，通過加入誘導(dǎo)劑IPTG實現(xiàn)。裂解液包括50mM的NaH2P0 4、 300mM的NaCl、10mM的咪唑、0. 2mg/mL的溶菌酶以及ImM的三（2-羧乙基）膦。對上清進(jìn) 行純化的操作可以采用過鎳柱完成。
[0043] S20、將Csy4蛋白特異性識別的識別序列插入到gRNA對應(yīng)