一種檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種定性檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。該酶聯(lián)免疫試劑盒包括：包被釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體、底物顯色液、濃縮洗滌劑、終止液、樣品稀釋液和陰陽(yáng)性對(duì)照品。本發(fā)明還公開了一種應(yīng)用上述酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的方法，它包括以下步驟：首先進(jìn)行樣品前處理，然后用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，最后分析檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明提供的檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、費(fèi)用低廉、靈敏度高、能夠現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控且適合大量樣本篩查。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒
[0001]專利申請(qǐng)?zhí)?
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種定性檢測(cè)人血清中抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0003]克羅恩病(又稱局限回腸炎、局限性腸炎、節(jié)段性腸炎和肉芽腫性腸炎)是一種自身免疫性腸粘膜疾病，它在慢性炎癥性腸病中有很高的復(fù)發(fā)率?？肆_恩病病變呈節(jié)段性分布，可累及口腔到肛門的各段消化道，多位于結(jié)腸和回腸，是一種全壁性炎癥?？肆_恩病的主要臨床表現(xiàn)包括疲勞、右下腹不明原因的疼痛、腹瀉(大多數(shù)伴有貧血)，同時(shí)可能伴有不明原因的發(fā)熱、惡心和嘔吐?？肆_恩病的發(fā)病過(guò)程呈現(xiàn)漸進(jìn)式的特點(diǎn)。大約一半的克羅恩病患者中會(huì)出現(xiàn)腸外繼發(fā)的表現(xiàn)。這些腸外癥狀主要包括關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎、皮膚病、眼部發(fā)炎等，并且這些癥狀多數(shù)會(huì)隨著慢性炎癥性腸病的治療而消失。此外，克羅恩病的并發(fā)癥還包括機(jī)械性腸梗阻(約20?30%的患者會(huì)有此癥狀)，皮膚、腸、膀胱、陰道、肛門、直腸瘺，內(nèi)部及腹膜后膿腫，腸出血，中毒性巨結(jié)腸，小腸癌，骨質(zhì)疏松和膽結(jié)石等多種癥狀。在歐美國(guó)家人群中，克羅恩病的發(fā)病率為每10萬(wàn)人中有150個(gè)人。每年新增的病例大約為每10萬(wàn)人中有7-8人，且在過(guò)去20年中呈現(xiàn)出持續(xù)的增長(zhǎng)?？肆_恩病在不同性別的人群中的發(fā)病率相當(dāng)。其發(fā)病年齡主要集中在16-35歲和60歲以上的成年人，且在同一家庭的不同成員中的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，顯現(xiàn)了一定的遺傳相關(guān)性。目前，對(duì)于克羅恩病的治療主要包括了藥物治療(如糖皮質(zhì)激素類，TNF阻斷劑)，手術(shù)干預(yù)(如切除受累腸部位)，飲食及心理治療等方法。
[0004]抗釀酒酵母抗體是克羅恩病的一個(gè)血清學(xué)診斷的指標(biāo)。1988年，Main等在慢性炎癥性腸病患者的血清中檢測(cè)到抗釀酒酵母抗體，他們認(rèn)為更多的抗體與釀酒酵母的結(jié)合和克羅恩病中多種感染因素提示了次級(jí)免疫反應(yīng)的失效，這種反應(yīng)是胰腺分泌物介導(dǎo)的一種免疫系統(tǒng)的特異性反應(yīng)?？贯劸平湍缚贵w可通過(guò)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)。抗釀酒酵母抗體與克羅恩病的疾病表型和嚴(yán)重性密切相關(guān)。在克羅恩病患者中，抗釀酒酵母抗體IgA和IgG類抗體陽(yáng)性率為73%。因此，可以通過(guò)檢測(cè)抗釀酒酵母抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)克羅恩病的診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一是提供一種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，可簡(jiǎn)化操作、提高分析靈敏度、成本低廉的人抗釀酒酵母IgG類抗體的定性酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供一種定性檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0007]本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)原理如下:
[0008]用釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖包被微孔板，制成固相載體，往包被抗原的微孔中分別加入樣本，孵育后洗滌，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的酶標(biāo)抗體，室溫孵育，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人抗釀酒酵母IgG類抗體呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，與臨界值相比較，從而判定樣本中人抗釀酒酵母IgG類抗體的存在與否。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案:本檢測(cè)試劑盒由1.酶標(biāo)抗體溶液試劑瓶、2.底物顯色液試劑瓶、3.終止液試劑瓶、4.濃縮洗滌液試劑瓶、5.樣品稀釋液試劑瓶、6.陽(yáng)性對(duì)照品試劑管、
7.陰性對(duì)照品試劑管、8.酶標(biāo)板、9.盒體所組成。試劑瓶1-7和酶標(biāo)板均放置在盒體內(nèi)。
[0010]酶標(biāo)板是包被釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖抗原的96孔聚苯乙烯微量反應(yīng)板。
[0011]本發(fā)明試劑盒中所涉及試劑的配制方法為:
[0012]a.酶標(biāo)抗體溶液的配制:辣根過(guò)氧化物酶-羊抗人IgG抗體原液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司(貨號(hào):AP112P)，用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑(購(gòu)自美國(guó)Thermo scientific公司，貨號(hào):37552)按1: 30000的比例配制成工作濃度灌裝入試劑瓶中；
[0013]b.底物顯色液的配制:單組份四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液購(gòu)自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司(貨號(hào):TMB-S-004)，灌裝入試劑瓶中。
[0014]c.終止液的配制:2mol/L H2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
[0015]d.濃縮洗滌液的配制(20XPBST):2.7M NaCl，94mM KCl,0.2M Na2HPO4,40mMNaH2PO4,1 % Tween-20,調(diào)pH值為7.4。灌裝入試劑瓶中。
[0016]e.樣品稀釋液的配制:含I % BSA,0.01 %硫柳汞、pH7.4的PBS溶液(135mMNaCl，
4.7mM KCl，1mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4)，灌裝入試劑瓶中。
[0017]f.陽(yáng)性對(duì)照品的配制:用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200稀釋陽(yáng)性血清，灌裝入試劑管中；
[0018]g.陰性對(duì)照品的配制:用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200稀釋陰性血清，灌裝入試劑管中；
[0019]釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖包被的酶標(biāo)板制備方法:釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖購(gòu)自德國(guó)Sigma公司(貨號(hào):M7504)，聚苯乙烯微量反應(yīng)酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司(貨號(hào):42592)。將釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖溶解于含0.01%硫柳汞的碳酸鹽緩沖液(15mM Na2CO3,34.9mM NaHCO3，調(diào)pH 9.6)中，終濃度為10ug/ml。取配制包被抗原溶液100 μ L，加入反應(yīng)板孔中，4°C冰箱中放置12-16h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液(含0.05 % Tween-20的PBS溶液，pH7.4)洗滌3次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在已包被抗原的酶標(biāo)板小孔中加 100 μ L 的封閉液(含 I % BSA、0.01 %硫柳汞、0.05% Tween-20 的 PBS 溶液，ρΗ7.4)，37°C恒溫培育lh，用洗滌液洗滌3次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在室溫下放置Ih自然晾干后封裝。
[0020]本發(fā)明的定性檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒的檢測(cè)方法是將樣品溶液加入酶標(biāo)板小孔中，同時(shí)設(shè)置空白、陰性和陽(yáng)性對(duì)照孔，室溫培育30min，倒出孔內(nèi)液體，重復(fù)用洗滌液洗滌3次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標(biāo)抗體溶液于酶標(biāo)板小孔中，室溫培育30min，用洗滌液重復(fù)洗3次，吸干；加入顯色溶液到待測(cè)酶標(biāo)板小孔中，室溫恒溫培育15min，再加入終止液，立即顯黃色；用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450m處測(cè)定吸收值。將樣品孔的吸收值減去空白孔的吸收值后，再與參考值進(jìn)行比較，從而判斷樣品中是否檢測(cè)出人抗釀酒酵母IgG類抗體。
[0021]本發(fā)明所制備的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適用于血清樣品中人抗釀酒酵母IgG類抗體的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1為試劑盒檢測(cè)原理示意圖。
[0023]圖2為人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]實(shí)施例1試劑盒中各組分的制備
[0025]1.包被抗原的聚苯乙烯微量反應(yīng)板:取10 μ g/ml濃度的包被抗原溶液100 μ L，加入到酶標(biāo)板小孔中，搖勻，置4°C冰箱中放置12-16h。倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌，重復(fù)3次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，吸干。在已包被抗原的酶標(biāo)板小孔中加100 μ L封閉液，室溫培育lh，用洗滌液洗滌3次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打，吸干，在室溫下放置Ih自然晾干后封裝。
[0026]2.酶標(biāo)抗體溶液的配制:用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 30000的比例配制成工作濃度后，灌裝入試劑瓶中；
[0027]3.底物顯色液的配制:將購(gòu)買的單組份四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色液直接灌裝入試劑瓶中。
[0028]4.終止液的配制:將98%的濃硫酸(18.4mol/L)加入到超純水中配制成2mol/LH2SO4溶液，灌裝入試劑瓶中。
[0029]5.濃縮洗滌液的配制(20XPBST):按 2.7M NaCl、94mM KC1、0.2M Na2HP04、40mMNaH2PO4,1 % Tween-20, pH值7.4的配方配制濃縮洗滌液，灌裝入試劑瓶中。
[0030]6.樣品稀釋液的配制:配制含I % BSA,0.01 %硫柳汞、pH7.4的PBS溶液(135mMNaCl, 4.7mM KCl，1mM Na2HPO4, 2mM NaH2PO4)，灌裝入試劑瓶中。
[0031]7.陽(yáng)性對(duì)照品的配制:用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200的比例稀釋陽(yáng)性血清，灌裝入試劑管中；
[0032]8.陰性對(duì)照品的配制:用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 200的比例稀釋陰性血清，灌裝入試劑管中。
[0033]將上述的試劑瓶、試劑管及酶標(biāo)板裝入外包裝盒內(nèi)，組成人抗釀酒酵母IgG類抗體酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
[0034]實(shí)施例2試劑盒的檢測(cè)方法
[0035]實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑均應(yīng)提前平衡至室溫(試劑不能直接在37°C溶解)；試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋，血清按1: 200比例稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)要求。
[0036]1.編號(hào):將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽(yáng)性對(duì)照2孔、空白對(duì)照2孔(空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)抗體溶液，其余各步操作相同)。
[0037]2.加樣:分別在陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照各100 μ I。然后在待測(cè)樣品孔中加入用樣品稀釋液稀釋后的待測(cè)樣品100 μ I。加樣時(shí)，將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
[0038]3.溫育:室溫溫育30分鐘。
[0039]4.配液:將20倍濃縮洗滌液加蒸餾水稀釋至400ml后備用。
[0040]5.洗滌:棄去酶標(biāo)板內(nèi)液體，倒扣吸水紙上，輕拍幾次吸干液體。每孔加洗滌液200 μ 1，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，倒扣吸水紙上，輕拍幾次吸干溶液。
[0041 ] 6.加酶:每孔加酶標(biāo)抗體溶液100 μ I，空白孔除外。
[0042]7.溫育:操作同3。
[0043]8.洗滌:操作同5。
[0044]9.顯色:每孔加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液100 μ 1，輕輕震蕩混勻，室溫避光顯色15分鐘。
[0045]10.終止:每孔加入終止液100 μ 1，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。
[0046]11.測(cè)定:選擇450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度(0D值)。測(cè)定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
[0047]本發(fā)明試劑盒提供的檢測(cè)結(jié)果分析過(guò)程為:
[0048]1.試驗(yàn)有效性:
[0049](I)試劑空白標(biāo)準(zhǔn):空白對(duì)照孔平均吸光度值< 0.1 ;
[0050](2)陽(yáng)性對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn):(陽(yáng)性對(duì)照孔平均吸光度值-空白對(duì)照孔平均吸光度值)彡1.00 ;
[0051](3)陰性對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn):(陰性對(duì)照孔平均吸光度值-空白對(duì)照孔平均吸光度值)彡0.3o
[0052]2.臨界值計(jì)算:臨界值=(陰性對(duì)照孔平均吸光度值-空白對(duì)照孔平均吸光度值)+0.33。
[0053]3.檢測(cè)結(jié)果的解釋:
[0054](I)當(dāng)(樣品平均吸光度值-空白對(duì)照孔平均吸光度值)<臨界值，結(jié)果為陰性，血清樣本中未檢測(cè)出人抗釀酒酵母IgG類抗體；
[0055](2)當(dāng)(樣品平均吸光度值-空白對(duì)照孔平均吸光度值)>臨界值，結(jié)果為陽(yáng)性，血清樣本中檢測(cè)出人抗釀酒酵母IgG類抗體。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于定性檢測(cè)人抗釀酒酵母IgG類抗體的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于它包含以下組分:(I)包被了釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖抗原的酶標(biāo)板；(2)酶標(biāo)抗體溶液；(3)底物顯色液；⑷濃縮洗滌液；(5)終止液；(6)樣品稀釋液；(7)陽(yáng)性對(duì)照品；(6)陰性對(duì)照品O2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)抗體為羊抗人抗體，其標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶，酶標(biāo)抗體溶液為用辣根過(guò)氧化物酶穩(wěn)定劑按1: 30000比例稀釋酶標(biāo)抗體原液而成。3.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液為pH值7.4，0.01mol/L的含有0.8%?1.2%吐溫20、0.1%硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為質(zhì)量百分含量；終止液為2mol/L的硫酸；樣品稀釋液為pH值7.4,0.01mol/L的含有I %牛血清白蛋白、0.1 %硫柳汞防腐劑的磷酸鹽緩沖液，所述百分含量為質(zhì)量百分含量。4.一種定性檢測(cè)樣品中人抗釀酒酵母IgG類抗體的方法，包括步驟:(I)樣品前處理；(2)用權(quán)利要求1?3之任一所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)；(3)分析檢測(cè)結(jié)果。5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中試劑盒檢測(cè)為向包被有釀酒酵母細(xì)胞壁甘露聚糖抗原的酶標(biāo)板微孔中加入樣品溶液，溫育后洗滌拍干，再加入酶標(biāo)抗體，溫育后洗滌拍干，顯色、終止，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值。
【文檔編號(hào)】G01N33/543GK105987995SQ201510060697
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月4日
【發(fā)明人】徐安龍, 張廣獻(xiàn), 梁東, 荊琛峰, 周靖宇, 吳赟, 張鴻運(yùn), 覃偉恒, 吳松青, 嚴(yán)萬(wàn)兩
【申請(qǐng)人】東莞博捷生物科技有限公司, 東莞中山大學(xué)研究院, 廣東中大南海海洋生物技術(shù)工程中心有限公司