專(zhuān)利名稱(chēng)：具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光pcr檢測(cè)探針、試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于沙門(mén)氏菌屬檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有市場(chǎng)上銷(xiāo)售的沙門(mén)氏菌屬熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒和沙門(mén)氏菌屬熒光PCR試劑盒，這些試劑盒是運(yùn)用熒光PCR技術(shù)檢測(cè)出沙門(mén)氏菌屬的全部種類(lèi)。但現(xiàn)有技術(shù)的PCR檢測(cè)沙門(mén)氏菌屬均為普通PCR方法，其檢測(cè)靈敏度較低，檢測(cè)速度較慢，PCR擴(kuò)增時(shí)間太長(zhǎng)，電泳成本較高且時(shí)間長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于:提供一種具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針，從而實(shí)現(xiàn)將具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌能從眾多的沙門(mén)氏菌屬的種類(lèi)中迅速準(zhǔn)確檢測(cè)出來(lái)。本發(fā)明要解決的又一技術(shù)問(wèn)題在于:提供一種具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，以利于方便快捷地將致病性沙門(mén)氏菌檢出。本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題在于:提供一種具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)方法，從而將具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌能從眾多的沙門(mén)氏菌屬的種類(lèi)中迅速準(zhǔn)確檢測(cè)出
來(lái)。 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是:具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針，為T(mén)aqman熒光探針,具有序列為:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
所述Taqman熒光探針與特異性引物spVR-P35_P36配套使用進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。進(jìn)一步地，所述特異性引物spvR-P35_P36為:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。本發(fā)明還提供毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其包括所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液、Taq酶、沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照及沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照；所述沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液包括所述具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針以及所述引物P35和引物P36。進(jìn)一步地，所述沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為鼠傷寒沙門(mén)氏菌DNA提取液；所述沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為大腸埃希氏菌DNA提取液。進(jìn)一步地，所述試劑盒中的相對(duì)規(guī)格為:沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液為500 ML，Taq酶為5U/ML 20 ML，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為0.5 mL，沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為0.5 mL ;所述檢測(cè)試劑盒
還包括一細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。進(jìn)一步地，所述沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液組成及配比為:不含MgCl2的10 X PCR緩沖液 2.5iiL，25 mmol/L MgCl2 3 u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物P36各0.5iiL，10iimol/L的TaqMan探針0.5 y L ;或者，單次反應(yīng)25 y L PCR反應(yīng)液組成及配比為:Mg2+ Plus 的 10 XPCR 緩沖液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/U L 的 Taq DNA 聚合酶 0.25 ii L，25 ii mol/L 的 TaqMan 探針 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P35為 0.5 ii L，50 ii mol/L 的引物 P36 為 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 為 2 y L,超純水 17.75 u L。本發(fā)明還提供具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟:
步驟1:模板DNA提??；
步驟2:配制熒光PCR反應(yīng)體系，并設(shè)定空白、沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照、沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照，所述熒光PCR反應(yīng)體系包括上述具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針；
步驟3:設(shè)定PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)；
步驟4:結(jié)果判斷:根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)照空白管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管擴(kuò)增曲線(xiàn)，確定樣品的擴(kuò)增結(jié)果。進(jìn)一步地，步驟2中所述沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為鼠傷寒沙門(mén)氏菌DNA提取液；所述沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為大腸埃希氏菌DNA提取液。進(jìn)一步地，所述步驟2的熒光PCR反應(yīng)體系25 L單次反應(yīng)時(shí)組成及配比如下: 10 X PCR 緩沖液 Mg2+ Plus 3.0il L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。
下，pH9.0, 1.0% Triton X-100
dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L25 u mol/L TaqMan 探針:0.5 U L50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超純水:17.75iiL
所述PCR反應(yīng)條件為95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40個(gè)循環(huán)，4°C保存。本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明利用特異性引物和探針，運(yùn)用熒光PCR技術(shù)將具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌能從眾多的沙門(mén)氏菌屬的種類(lèi)中迅速檢測(cè)出來(lái)，而具有毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌種類(lèi)，均為高致病性沙門(mén)氏菌，可以引起人類(lèi)和動(dòng)物致病，也是食源性疾病的重要病原菌之一。故本發(fā)明《具毒素質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒》不僅用于食品檢測(cè)，也可應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷。 本發(fā)明的具毒素質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針、試劑盒及檢測(cè)方法，能快速檢測(cè)出具有毒性質(zhì)粒的有致病作用的沙門(mén)氏菌，比普通PCR的檢測(cè)速度更快，不僅大大節(jié)省PCR的擴(kuò)增時(shí)間，也節(jié)省了電泳的成本和時(shí)間，有助于對(duì)人和動(dòng)物常見(jiàn)沙門(mén)氏菌病的早期臨床診斷和食物、水源、環(huán)境中沙門(mén)氏菌的跟蹤監(jiān)測(cè)，并對(duì)于公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和口岸檢疫中的致病性沙門(mén)氏菌的檢出具有重要的實(shí)際意義。


圖1 (縱座標(biāo)表示的是熒光強(qiáng)度，橫座標(biāo)表示是循環(huán)數(shù))是本發(fā)明實(shí)施例的具毒素質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒檢測(cè)圖譜，其中從下往上9條曲線(xiàn)分別表示:1:大腸埃希氏菌(陰性對(duì)照)、S空白對(duì)照、1:鼠傷寒沙門(mén)氏菌、I豬霍亂沙門(mén)氏菌、￡樣品分離株沙門(mén)氏菌、S雞白痢沙門(mén)氏菌、T雞傷寒沙門(mén)氏菌、I'羊流產(chǎn)沙門(mén)氏菌、I；腸炎沙門(mén)氏菌。
具體實(shí)施例方式以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌菌株對(duì)小鼠的毒力要比其相應(yīng)的無(wú)質(zhì)粒菌株強(qiáng)至數(shù)百甚至數(shù)萬(wàn)倍，截至目前已先后在鼠傷寒、豬霍亂、腸炎、羊流產(chǎn)、雞傷寒、雞白痢等沙門(mén)氏菌中鑒定出不同分子量的毒力質(zhì)粒，由于不同血清型沙門(mén)氏菌的毒力質(zhì)粒(spv)中存在一個(gè)含毒力基因的高度保守的IOkb左右的區(qū)域，因此通過(guò)對(duì)此保守區(qū)的檢測(cè)，可以鑒定出常見(jiàn)的具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌。本發(fā)明基于最常見(jiàn)的具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌種類(lèi)，在普通PCR的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一條具有序列特異性的Taqman熒光探針；最終連同常規(guī)的DNA提取液，沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液、Taq酶等組裝成一套具毒素質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒。

從NCBI 的 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索 S.typhimurium, S.choleraesuis,S.enteritidis, S.gall1-narum各代表菌株公布的spvR基因序列如序列表中SEQ ID N0.1，遞交NCBI進(jìn)行Blast檢索，并遞交EBI利用ClustalW(l.82)軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)。通過(guò)Blast檢索和多重序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)spvR基因序列具有很強(qiáng)的保守性，結(jié)合多重PCR考慮，利用Primer Premier 5軟件設(shè)ii 對(duì)特異性引物spvR_P35_P36,與此同時(shí),設(shè)計(jì)出一條Taqman突光探針,具體結(jié)果如下:
上游引物:
P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266
18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物:
P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738
18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO FO Taqman突光探針:
5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723
19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO
運(yùn)用這條Taqman突光探針，同時(shí)與特異性引物spvR_P35_P36配套使用，在RocheIightcycler系列熒光定量PCR儀上進(jìn)行熒光PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果同時(shí)檢測(cè)出6種具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌，特異性和靈敏性好。其最大的優(yōu)點(diǎn)及積極效果是:能快速檢測(cè)出具有毒性質(zhì)粒及有致病作用的沙門(mén)氏菌。本發(fā)明比普通PCR的檢測(cè)速度更快，不僅大大節(jié)省PCR的擴(kuò)增時(shí)間，也節(jié)省了電泳的成本和時(shí)間。本發(fā)明進(jìn)一步建立具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒，用于對(duì)人和動(dòng)物常見(jiàn)沙門(mén)氏菌病的早期臨床診斷和食物、水源、環(huán)境中沙門(mén)氏菌的跟蹤監(jiān)測(cè)，并對(duì)于公共衛(wèi)生、食品衛(wèi)生、畜牧獸醫(yī)和口岸檢疫中的致病性沙門(mén)氏菌的檢出具有重要的實(shí)際意義。該毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR快速檢測(cè)試劑盒具體組成及其功用作為一實(shí)施例如下表1，但需說(shuō)明的是，表中所述規(guī)格及數(shù)量可適當(dāng)調(diào)整和選擇，也可選擇其它規(guī)格及數(shù)量:
權(quán)利要求
1.具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針,為T(mén)aqman熒光探針,具有序列為: 5’ -FAM-AGG GCT GGC GAT GTT ACT C-TAMRA-3’705-723 19bp Tm= 57.4 GC=57.9HO DO FO 所述Taqman熒光探針與特異性引物spVR-P35_P36配套使用進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)。
2.如權(quán)利要求1所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針，其特征在于:所述特異性引物spvR-P35-P36為: 上游引物: P35:5’ -GGA AAT CGG ACC TAC GGG-3’249-266 18bp Tm=57.4 GC=61.1% HO DO FO 下游引物: P36:5’ -AAT CCC AGA GCC CGA CAG-3’755-738 18bp Tm=57.7 GC=61.1% HO DO F0。
3.具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括如權(quán)利要求廣2中任一項(xiàng)所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針。
4.如權(quán)利要求3所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液、Taq酶、沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照及沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照；所述沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液包括所述具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針以及所述引物P35和引物P36。
5.如權(quán)利要求4所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為鼠傷寒沙門(mén)氏菌DNA提取液；所述沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為大腸埃希氏菌DNA提取液。
6.如權(quán)利要求4所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒相對(duì)規(guī)格為:沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液為500 ML，Taq酶為5U/ML 20 ML，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為0.5 mL,沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為0.5 mL ;所述檢測(cè)試劑盒還包括一細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒。
7.如權(quán)利要求6所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述沙門(mén)氏菌PCR反應(yīng)液組成及配比為:不含MgCl2的10 X PCR緩沖液2.5 ii L，25 mmol/L MgCl2 3u L, 10 mmol/L dNTPs 0.5 u L, 10 ii mol/L 的引物 P35 和引物 P36 各 0.5 y L，lOumol/L的TaqMan探針0.5 ii L ;或者，單次反應(yīng)25 ii L PCR反應(yīng)液組成及配比為:Mg2+Plus 的 10 X PCR 緩沖液 3.0ii L，25mM each 的 dNTP Mixture 0.5u L,5 U/u L 的 Taq DNA聚合酶 0.25ii L，25 u mol/L 的 TaqMan 探針 0.5 y L，50 y mol/L 的引物 P35 為 0.5 y L，50 u mol/L 的引物 P36 為 0.5 y L，50 y g/mL 模板 DNA 為 2 y L,超純水 17.75 u L。
8.具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟: 步驟1:模板DNA提??； 步驟2:配制熒光PCR反應(yīng)體系，并設(shè)定空白、沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照、沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照，所述熒光PCR反應(yīng)體系包括如權(quán)利要求f 2中任一項(xiàng)所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針； 步驟3:設(shè)定PCR反應(yīng)條件進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)； 步驟4:結(jié)果判斷:根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)照空白管、陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管擴(kuò)增曲線(xiàn)，確定樣品的擴(kuò)增結(jié)果。
9.如權(quán)利要求8所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于:步驟2中所述沙門(mén)氏菌陽(yáng)性對(duì)照為鼠傷寒沙門(mén)氏菌DNA提取液；所述沙門(mén)氏菌陰性對(duì)照為大腸埃希氏菌DNA提取液。
10.如權(quán)利要求8所述的具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)方法，其特征在于:所述步驟2的熒光PCR反應(yīng)體系25 ii L單次反應(yīng)時(shí)組成及配比如下:·10 XPCR 緩沖液 Mg2+ Plus 3.0ii L: 500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris Cl,在 25。。下，pH9.0, 1.0% Triton X-100dNTP Mixture 25mM each:0.5 u L·5 U/u L Taq DNA 聚合酶:0.25 U L·25 u mol/L TaqMan 探針:0.5 U L·50 ii mol/L 引物 35: 0.5 u L·50 ii mol/L 引物 36: 0.5 u L·50 u g/mL 模板 DNA: 2 u L超純水:17.75iiL 所述PCR反應(yīng)條件 為95°C，5 min ；95°C , 5s, 60 V，40 s, 40個(gè)循環(huán)，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具毒性質(zhì)粒沙門(mén)氏菌熒光PCR檢測(cè)探針、試劑盒及檢測(cè)方法，該熒光PCR檢測(cè)探針具有序列為5’-FAM-AGGGCTGGCGATGTTACTC-TAMRA-3’，705-723，19bp，Tm=57.4，GC=57.9，H0，D0，F(xiàn)0，Taqman熒光探針與特異性引物spvR-P35-P36配套使用進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，從而將具有毒性質(zhì)粒的沙門(mén)氏菌能從眾多的沙門(mén)氏菌屬的種類(lèi)中迅速準(zhǔn)確檢測(cè)出來(lái)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103243159SQ20131012455
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月11日
發(fā)明者馬立農(nóng) 申請(qǐng)人:深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院