專利名稱：一種提取質(zhì)粒的試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物醫(yī)學領(lǐng)域的質(zhì)粒提取，尤其涉及在質(zhì)粒提取中去除內(nèi)毒素的試劑和方法。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒DNA是基因工程最常見的運載體，它可以把一個有用的目的DNA片段通過重組DNA技術(shù)，送進受體細胞中去進行繁殖和表達。因此質(zhì)粒提取的質(zhì)量對后續(xù)的分子生物學實驗的成功與否起著關(guān)鍵的作用。目前許多國內(nèi)外公司都研發(fā)和提供了質(zhì)粒提取試劑盒，但這些試劑盒提取質(zhì)粒時，需要經(jīng)過繁瑣的步驟，耗時長。且試劑盒中采用許多有毒化學物質(zhì)，即污染環(huán)境又會威脅到操作者的健康。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁中的一種成分，是一種脂多糖，在化學結(jié)構(gòu)上主要包括兩部分，即多糖和類脂A。其中類脂A是活性中心，也是毒性的基礎(chǔ)，主要有氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的長脂肪酸組成，在生理條件下具有疏水性和電負性。內(nèi)毒素只有當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來。內(nèi)毒素是熱源物質(zhì)，一旦含有內(nèi)毒素的物質(zhì)注入動物體內(nèi)可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等毒性作用。內(nèi)毒素在高溫、強酸、強堿條件下都非常穩(wěn)定。當前的醫(yī)學規(guī)定每毫克質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量小于100EU時可用于人體。在分子生物學實驗中，內(nèi)毒素的存在會降低質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和細胞表達的效率。因此在質(zhì)粒提取過程中，降低內(nèi)毒素的含量是質(zhì)粒提取的重要步驟之一。在傳統(tǒng)的堿裂解法提取質(zhì)粒的方法中，所得到`的質(zhì)粒中含有大量的內(nèi)毒素，會影響到后期的一系列實驗。在傳統(tǒng)的質(zhì)粒提取方法中，需要有冰浴的步驟。這個步驟不僅增加了質(zhì)粒提取的復雜程度、增加了額外的設備，同時也延長了質(zhì)粒提取的時間。

發(fā)明內(nèi)容
為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一是:一種提取質(zhì)粒DNA的試劑，包括:細胞懸浮液、細胞裂解液、緩沖液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、質(zhì)粒結(jié)合液和內(nèi)毒素去除顆粒溶液，其中:細胞懸浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl，2.7mmol/LKCl, I % Tween20, pH6.0-8.0，使用前加入 RNase A 并混合均勻，4°C貯存，以超純水為溶劑；細胞裂解液包括0.1-2.5mol/L NaOH，質(zhì)量體積百分比為0.05% -1%的SDS’以超純水為溶劑，室溫密閉貯存；緩沖液包括0.1-0.5mol/L(NH4)2HPO4 -NH4H2PO470.5_3mol/L KCl，pH3_5，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存；洗滌液I包括2-8M GuHCl,200m mol/L Tris，2M EDTA, 1.5mol/L NaCl，pH6.8_7.0，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存；洗滌液2包括50-100%乙醇；洗脫液為dH20 ;內(nèi)毒素去除顆粒溶液包括IOmg/ml能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的復合顆粒，含有0.02%疊氮鈉的20mM Tris-HCl，pH為7.5 ;質(zhì)粒結(jié)合液包括2-8M GuHCl, 10-50mM HEPES, pH6.8-8.2，以超純水為溶劑。進一步的，復合顆粒包括能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的特異性結(jié)合物和用于承載該特異性結(jié)合物的載體。
更進一步的，特異性結(jié)合物選自以下的至少一種:(1)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽；2)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆抗體、或單克隆抗體、或多克隆抗體和單克隆抗體的混合物。
內(nèi)毒素去除顆粒溶液可以包括多肽和載體的復合顆粒，或抗體和載體的復合顆粒，或多肽和載體的復合顆粒與抗體和載體的復合顆的混合物。進一步的，所述能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽選自以下序列的至少一種:序列 I keegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk序列 2 gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。進一步的，載體選自瓊脂糖凝膠顆粒、磁珠顆粒、乳膠顆?；蚰z體金顆粒。更進一步的，特異性結(jié)合物和載體之間以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亞胺或N-羥基琥珀酼亞胺作為偶聯(lián)劑。在一優(yōu)選的方案中，提取質(zhì)粒DNA的試劑還包括內(nèi)毒素去除液，所述內(nèi)毒去除溶液包括 2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114, ρΗ8.0,以超純水為溶劑。本發(fā)明的目的之二是:提取質(zhì)粒DNA的方法，包括以下步驟:(I)取2_4ml在培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-16小時的菌液，12，OOOXg離心I分鐘，棄盡上清；(2)加250 μ I細胞懸浮液以懸浮步驟I中的細菌，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；(3)向步驟2的細胞懸浮液中加入250 μ I細胞裂解液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，步驟3操作時間不超過5分鐘；(4)向步驟3中的透亮溶液中加350 μ I緩沖液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6_8次，12，000 Xg離心10分鐘；(5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒提取制備管，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液；(6)將制備管置回離心管，加500 μ I洗滌液I，12，000 Xg離心I分鐘，棄濾液；(7)將制備管置回離心管，加700 μ I洗滌液2，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液；再次加入700 μ I洗滌液2洗滌一次，12，000 X g離心I分鐘，棄濾液；(8)將制備管置回2ml離心管中，12，000 X g離心I分鐘；(9)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管中央加150 μ I洗脫液，室溫靜置I分鐘，12，OOOXg離心I分鐘；(10)棄制備管，加入內(nèi)毒素去除顆粒溶液50 μ 1，顛倒混勻5分鐘，I, OOOxg離心20秒；(11)小心吸取上清液150 μ I至一干凈離心管中，加入質(zhì)粒結(jié)合液300 μ 1，混合均勻；(12)將步驟11的混合液加入至一無內(nèi)毒素制備管中，12，OOOXg離心I分鐘；(13)將制備管置回離心管，加700 μ I洗滌液2，12，000 Xg離心I分鐘，棄濾液；再次加入700 μ I洗滌液2洗滌一次，12，000 X g離心I分鐘，棄濾液；(14)將制備管置回2ml離心管中，12，000 X g離心I分鐘；(15)將制備管置于一干凈的新離心管中；
(16)在制備管中加入60 μ I洗脫液以溶解質(zhì)粒DNA，室溫靜置I分鐘，12，OOOXg離心I分鐘，得質(zhì)粒。優(yōu)選的方案中，在步驟11加入質(zhì)粒結(jié)合液前，還包括以下步驟:在加入內(nèi)毒素去除顆粒溶液并混勻后，加入內(nèi)毒素去除液，劇烈混合I分鐘；將離心管置于42°C I分鐘后，12，OOOxg離心2分鐘，溶液分為無色上相和藍色下相；小心吸取無色上相于一干凈離心管中，加入質(zhì)粒結(jié)合液；所述內(nèi)毒素去除溶液包括2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114,pH8.0，以超純水為溶劑。本發(fā)明的有益效果是:利用本發(fā)明所述的含有內(nèi)毒素去除顆粒溶液的試劑和方法可以特異性地結(jié)合質(zhì)粒中的內(nèi)毒素，并通過后續(xù)的步驟將其去除。其操作步驟簡單、耗時短。利用內(nèi)毒素去除顆粒能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的特點，實現(xiàn)快速分離和去除內(nèi)毒素的效果。所獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高、純度好，所得的質(zhì)粒每毫克中內(nèi)毒素含量低于0.1EU/ μ g以下，符合臨床標準，可以用于內(nèi)毒素敏感細胞系，如Huh-7等的轉(zhuǎn)染操作。利用本發(fā)明所述的內(nèi)毒素去除液能將內(nèi)毒素溶解在有機相中，而質(zhì)粒溶解在水相中，這樣通過分相就可以進一步地將有機相中的內(nèi)毒素與水相中的質(zhì)粒分開，回收的質(zhì)粒純度高、濃度高，每毫克質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量低于50EU，可以運用于顯微注射或者基因疫苗。利用本發(fā)明所述的含有 去除內(nèi)毒素試劑的質(zhì)粒提取試劑和方法，提取得到的質(zhì)粒純度高，提取步驟簡單，操作條件溫和，沒有極端的例如冰浴的步驟。


圖1是采用本發(fā)明所述方法提取質(zhì)粒和采用現(xiàn)有技術(shù)所提取的質(zhì)粒的電泳對照圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體附圖對本發(fā)明進行詳細的說明。這些具體的實施例僅僅是在不違背本發(fā)明精神下的有限列舉，并不排除本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員把現(xiàn)有技術(shù)和本發(fā)明結(jié)合而產(chǎn)生的其他具體的實施方案。實施例1去除質(zhì)粒中內(nèi)毒素的試劑及其配制方法去除質(zhì)粒中內(nèi)毒素的試劑包括內(nèi)毒素去除顆粒溶液，所述溶液中包括能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的復合顆粒。該復合顆粒包括能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的特異性結(jié)合物和用于承載該特異性結(jié)合物的載體。所述特異性結(jié)合物選自以下的至少一種:(I)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽；2)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的抗體。所述能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽序列選自以下序列的至少一種:序列 I keegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk ；序列 2 gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。所述的抗體包括但不限于多克隆抗體、或單克隆抗體或它們的混合物，例如兔多克隆抗體、鼠單抗等。所述載體包括但不限于瓊脂糖凝膠顆粒、磁珠顆粒、乳膠顆粒或膠體金顆粒。
內(nèi)毒素去除顆粒溶液包括多肽和載體的復合顆粒，或抗體和載體的復合顆粒，或多肽和載體的復合顆粒與抗體和載體的復合顆的混合物制備包含能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽和磁珠復合顆粒的方法包括:以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳二亞胺(EDC)作為偶聯(lián)劑，將能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽(序列I)偶聯(lián)于包被了羧基的磁珠上，其中每I毫克磁珠中含有10微克多肽。所得復合顆粒的結(jié)合能力為Iyg內(nèi)毒素/mg磁珠，即Img磁珠上含有的10微克多肽能夠結(jié)合I微克的內(nèi)毒素。將結(jié)合了多肽的復合磁珠保存在含有0.02%疊氮鈉的20mM Tris-HCl, pH為7.5的溶液中，并且所述復合磁珠在該溶液中的濃度為10mg/ml。制備包含能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽和瓊脂糖復合顆粒的方法包括:直接將能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽(序列2)偶聯(lián)于N-羥基琥珀酼亞胺活化的瓊脂糖表面，例如瓊脂糖選用商品名NHS -ACTS印harose，貨號90-1004-00的瓊脂糖。其中每I克瓊脂糖中含有30毫克多肽，其結(jié)合能力為3mg內(nèi)毒素/g瓊脂糖，即I克瓊脂糖上含有的30毫克多肽能夠結(jié)合3毫克的內(nèi)毒素。將結(jié)合了多肽的復合瓊脂糖保存在含有0.02%疊氮鈉的20mMTris-HCl, pH為7.5的溶液中，并且所述復合瓊脂糖在該溶液中的濃度為10mg/ml。制備包含能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆兔抗體和磁珠復合顆粒的方法包括:以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞胺(EDC)作為偶聯(lián)劑，將能結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆兔抗體偶聯(lián)于包被了氨基的磁珠上，其中每I毫克磁珠中含有0.1毫克多抗，其結(jié)合能力為2 μ g內(nèi)毒素/mg磁珠。將結(jié)合了多抗的復合磁珠保存在含0.02%疊氮鈉、0.1 % BSA的20mMTris-HCl, pH7.5的溶液。復合磁珠溶液終濃度為10mg/ml。制備包含能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆兔抗體和瓊脂糖復合顆粒的方法包括:直接將能結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆兔抗體偶聯(lián)于N-羥基琥珀酼亞胺活化的瓊脂糖表面。例如瓊脂糖選用商品名NHS-ACTS印harose，貨號90-1004-00的瓊脂糖。其中每I克瓊脂糖中含有300毫克多抗，其結(jié)合能力為2mg內(nèi)毒素/g復合瓊脂糖。將結(jié)合了多抗的復合瓊脂糖保存在含0.02%疊氮鈉、0.1% BSA的20mM Tris-HCl, pH7.5的溶液。復合瓊脂糖溶液終濃度為 10mg/mlo在優(yōu)選的方案中去除質(zhì)粒中內(nèi)毒素的試劑中還包括內(nèi)毒素去除液。所述內(nèi)毒素去除液包括2mM Tris, 0.5% TritonX-114, pH8.0，以超純水為溶劑。在另一個方案中內(nèi)毒素去除液包括85mM Tris, 10% TritonX-114, pH8.0,以超純水為溶劑。實施例2質(zhì)粒提取試劑及其制備方法本實施例所述的用于提取質(zhì)粒的試劑包括:細胞懸浮液；細胞裂解液；緩沖液；洗滌液I ;洗滌液2 ;洗脫液；內(nèi)毒素去除顆粒溶液；質(zhì)粒結(jié)合液。其中:細胞懸浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl,
2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0 ;使用前往上述混合液中加入RNase A，混合均勻，4°C貯存。以超純水為溶劑。細胞裂解液包括0.lmol/L NaOH, 0.05% SDS (質(zhì)量體積百分比)，以超純水為溶
齊U。室溫密閉貯存。緩沖液包括0.1moVL(NH4)2HPO4.NH4H2PO4,0.5mol/L KCl，pH 為 3，以超純水為溶
齊U。室溫密閉貯存。洗滌液I 包括 2M GuHCl，200m mol/L Tri s’ 2M EDTA, 1.5mol/LNaCl，pH6.8，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存。洗滌液2包括50 %乙醇。洗脫液為dH20。內(nèi)毒素去除顆粒溶液為實施例1中所述的溶液。質(zhì)粒結(jié)合液包括2M GuHCl, IOmM HEPES, pH6.8，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存。實施例3添加了內(nèi)毒素去除液的質(zhì)粒提取試劑及其制備方法本實施例所述的提取質(zhì)粒的試劑包括:細胞懸浮液；細胞裂解液；緩沖液；洗滌液I ;洗滌液2 ;洗脫液；內(nèi)毒素去除顆粒溶液；質(zhì)粒結(jié)合液；內(nèi)毒素去除液。細胞懸浮液包括2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20，137mmol/L NaCl,
2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0 ;使用前往上述混合液中加入RNase A，混合均勻，4°C貯存。以超純水為溶劑。細胞裂解液包括2.5mol/L NaOH, I %的SDS (質(zhì)量體積百分比)，以超純水為溶劑。室溫密閉貯存。

緩沖液包括0.5moI/L (NH4)2HPO4.NH4H2PO4, 3mol/L KCl，pH 為 53，以超純水為溶
齊U。室溫密閉貯存。洗滌液I 包括 8M GuHCl,200m mol/L Tris,2M EDTA,1.5mol/LNaCl,3mol/LGuHCl, pH7.0，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存。洗滌液2包括100%乙醇。洗脫液為dH20。內(nèi)毒素去除顆粒溶液為實施例1中所述的溶液。質(zhì)粒結(jié)合液包括8M GuHCl, 50mM HEPES, pH8.2，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存。內(nèi)毒素去除液為實施例1中所述的溶液。實施例4利用實施例2所述試劑提取質(zhì)粒的方法提取方法包括以下步驟:(I)取2-4ml在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液，12，OOOXg離心I分鐘，
棄盡上清；(2)加本發(fā)明所述250μ I細胞懸浮液懸浮步驟I中的細菌，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；(3)向步驟2的細胞懸浮液中加入250 μ I細胞裂解液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5分鐘；(4)向步驟3中的透亮溶液中加本發(fā)明所述350 μ I緩沖液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，12，000 X g離心10分鐘；(5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒提取制備管，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液；(6)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述500μ I洗滌液1，12，OOOXg離心I分鐘，
棄濾液；(7)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述700 μ I洗滌液2，12，000 Xg離心I分鐘，棄濾液；以同樣的方法再用700 μ I洗滌液2洗滌一次，棄濾液；(8)將制備管置回2ml離心管中，12，000 X g離心I分鐘；
(9)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加本發(fā)明所述150μ I洗脫液，室溫靜置1分鐘，12，000 X g離心I分鐘；(10)棄制備管，加入本發(fā)明所述內(nèi)毒素去除顆粒溶液50 μ 1，顛倒混勻5分鐘，1, OOOxg 離心 20 秒；(11)小心吸取上清液150 μ 1至一干凈離心管中，加入本發(fā)明所述質(zhì)粒結(jié)合液300 μ 1，混合均勻；(12)將步驟11的混合液加入至一無內(nèi)毒素制備管中，12，OOOXg離心1分鐘；(13)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述700μ 1洗滌液2，12，OOOXg離心1分鐘，棄濾液；以同樣的方法再用700 μ I洗滌液2洗滌一次，棄濾液；(14)將制備管置回2ml離心管中，12，000 X g離心1分鐘；(15)將制備管置于一干凈的新離心管中；(16)在制備管中加入本發(fā)明所述60 μ 1洗脫液溶解質(zhì)粒DNA，室溫靜置1分鐘，12，OOOXg離心1分鐘，得質(zhì)粒DNA。實施例5利用實施例3所述試劑提取質(zhì)粒的方法提取方法包括以下步驟:(1)取2ml在培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液，12，OOOXg離心1分鐘，棄
盡上清；(2)加本發(fā)明所述250μ 1細胞懸浮液懸浮步驟I中的細菌，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；(3)向步驟2的細胞懸浮液中加入本發(fā)明所述250 μ I細胞裂解液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5分鐘；(4)向步驟3中的透亮溶液中加本發(fā)明所述350 μ 1緩沖液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，12，000 X g離心10分鐘；(5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒提取制備管，12，OOOXg離心1分鐘，棄濾液；(6)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述500μ I洗滌液1，12，OOOXg離心I分鐘，
棄濾液；(7)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述700 μ 1洗滌液2，12，000 Xg離心I分鐘，棄濾液；以同樣的方法再用700 μ 1洗滌液2洗滌一次，棄濾液；(8)將制備管置回2ml離心管中，12，OOOXg離心I分鐘；(9)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管膜中央加本發(fā)明所述150μ I洗脫液，室溫靜置1分鐘，12，000 X g離心I分鐘；(10)棄制備管，加入本發(fā)明所述內(nèi)毒素去除顆粒溶液50 μ 1，顛倒混勻5分鐘，
I,OOOxg 離心 20 秒；(11)小心吸取上清液150 μ 1至一干凈離心管中，加入本發(fā)明所述150 μ 1內(nèi)毒素去除液，劇烈混合1分鐘；(12)將離心管置于42°C 1分鐘后，12，OOOxg離心2分鐘,溶液分為無色水上相和藍色有機下相；(13)小心吸取無色上相于一干凈離心管中，加入本發(fā)明所述質(zhì)粒結(jié)合液300μ 1，混合均勻；(14)將步驟13的混合液加入至一無內(nèi)毒素的制備管中，12，OOOXg離心I分鐘；(15)將制備管置回離心管，加本發(fā)明所述700μ I洗滌液2，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液；以同樣的方法再用700 μ I洗滌液2洗滌一次，棄濾液；(16)將制備管置回2ml離心管中，12，000 X g離心I分鐘；(17)將制備管置于一干凈的新離心管中；(15)在制備管中加入本發(fā)明所述60μ I洗脫液溶解質(zhì)粒DNA，室溫靜置I分鐘。12，000Xg離心I分鐘。實施例6比較實驗I
分別利用實施例4所述的方法和杭州百邁生物技術(shù)有限公司的KBM MagPUre質(zhì)粒提取試劑盒(該試劑盒不含內(nèi)毒素去除試劑)提取TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液中的質(zhì)粒。經(jīng)測定，利用本發(fā)明含有內(nèi)毒素去除顆粒溶液的質(zhì)粒提取試劑所提取的質(zhì)粒中內(nèi)毒素的含量為0.035EU/ug，低于0.1EU/μ g質(zhì)粒。而利用KMB試劑盒所提取的質(zhì)粒中，內(nèi)毒素含量高達102.6EU/ug。實驗結(jié)果表明，利用本發(fā)明所述的試劑和提取方法能有效降低質(zhì)粒中內(nèi)毒素的含量，可以直接轉(zhuǎn)染內(nèi)毒素敏感細胞系，如Huh-7。實施例7比較實驗2方案1:利用杭州百邁生物技術(shù)有限公司的KBM MagPure質(zhì)粒提取試劑盒(不含內(nèi)毒素去除試劑)，提取TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液中的質(zhì)粒DNA。測定所提取質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量。方案2:利用實施例4所述的方法，提取TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液中的質(zhì)粒DNA。測定所提取質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量。方案3:利用實施例5所述的方法，提取TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液中的質(zhì)粒DNA。測定所提取質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量。經(jīng)測定，依照方案I所提取的質(zhì)粒中，內(nèi)毒素的含量為107.8EU/ug。依照方案2所提取的質(zhì)粒中，內(nèi)毒素的含量降至0.052EU/ug。依照方案3所提取的質(zhì)粒中，內(nèi)毒素含量僅為0.0WEU/yg質(zhì)粒，低于0.lEU/yg質(zhì)粒。實驗結(jié)果表明，利用本發(fā)明的含有內(nèi)毒素去除顆粒溶液的質(zhì)粒提取試劑所提質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量低。而當同時使用了內(nèi)毒素去除液后，所提取的質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量又進一步降低，所獲得的質(zhì)粒可以直接用于動物實驗的DNA疫苗顯微注射。

實施例8分別利用實施例5所述的方法和杭州百邁生物技術(shù)有限公司的KBM MagPure質(zhì)粒提取試劑盒提取YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液中的質(zhì)粒。如圖1所示的質(zhì)粒DNA電泳圖譜，M為DL1000分子量，I為利用KMB試劑盒所提取的質(zhì)粒圖譜。2是利用本發(fā)明所述質(zhì)粒提取試劑和方法提取的質(zhì)粒圖譜。圖中清晰地表明，兩種提取方法所提取的質(zhì)粒在純度和產(chǎn)量上有明顯區(qū)別。本發(fā)明所述試劑和方法提取的質(zhì)粒遠優(yōu)于傳統(tǒng)的質(zhì)粒提取方法。通過測定，本發(fā)明所述的無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取的質(zhì)粒含量為40 μ g，遠高于目前市場所售產(chǎn)品的提取率，并且內(nèi)毒素含量僅為0.021EU/u g°
實施例9利用包被二氧化硅的磁珠顆粒代替制備管提取大腸桿菌中的質(zhì)粒的提取方法，包括以下步驟:(I)取2ml在TB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(8-16小時)的菌液，12，000 X g離心I分鐘，
棄盡上清；(2)加本發(fā)明所述250μ I細胞懸浮液懸浮步驟I中的細菌，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；(3)向步驟2的細胞懸浮液中加入本發(fā)明所述250 μ I細胞裂解液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過5分鐘；(4)向步驟3中的透亮溶液中加本發(fā)明所述350 μ I中和液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，12，000 X g離心10分鐘；(5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到干凈離心管中，加入IOOul 10mg/ml 二氧化硅包被的磁珠顆粒和300ul異丙醇，顛倒混勻；(6)將離心管置于磁力架上，靜置I分鐘吸附磁珠，將上清吸棄。(7)移除磁力架，加500 μ I洗滌液I，顛倒混勻5次。(8)將離心管置于磁力架上，靜置I分鐘吸附磁珠，將上清吸棄。(9)移除磁力架，加700 μ I洗滌液2，顛倒混勻5次；(10)將離心管置于磁力架上，靜置I分鐘吸附磁珠，將上清吸棄；(11)重復步驟 9-10;(12)將離心管在空氣中干燥10分鐘；(13)移除磁力架，加本發(fā)明所述150μ I洗脫液，顛倒混勻5次，室溫靜置I分鐘；(14)將上清轉(zhuǎn)移至一干凈離心管中，加入本發(fā)明所述內(nèi)毒素去除顆粒溶液50 μ I,顛倒混勻5分鐘；(15)加入本發(fā)明所述200μ I內(nèi)毒素去除液，用力顛倒混勻；(16)將離心管置于42°C I分鐘后，12，OOOxg離心2分鐘，溶液至上而下分為無色水上相、藍色有機下相和磁珠層；(17)小心吸取無色上相于一干凈離心管中，加入質(zhì)粒結(jié)合液300μ 1，再加入IOOul 10mg/ml 二氧化硅包被的磁珠顆粒和200 μ I異丙醇，混合均勻；(18)將離心管置于磁力架上，靜置I分鐘吸附磁珠，將上清吸棄；(19)移除磁力架，加700 μ I洗滌液2，顛倒混勻5次；(20)將離心管置于磁力架上，靜置I分鐘吸附磁珠，將上清吸棄；(21)將離 心管在空氣中干燥10分鐘；(22)移除磁力架，加本發(fā)明所述60 μ I洗脫液，顛倒混勻5次，室溫靜置I分鐘。所得質(zhì)粒中內(nèi)毒素含量很低，符合醫(yī)學使用標準。提取的操作步驟簡單。
、序列表
<110>杭州百邁生物技術(shù)有限公司
<120一種提取質(zhì)粒的試劑和方法 <130>
<!60>2
<170>Patentln version 3.5
<210>I
<211>32 <212> PRT <213>人工序列
400 I
Lys Gln Glu Gly Leu Asp His Ser Asn Arg Lys Asn Phe Lys Leu Asn 151015
Arg Lys Leo He He Phe Phe Glu Gly Arg Arg He Lys Gly Asn Lys202530
<210> 2 <211> 37 <212> PRT <213〉人工序列
2
Gly Lys Pro Ser Glu Gly Gln Pro Ser Glu Ser Gln Pro Ser Glu Ser
I51015
Gly Asp Ser Gly GIn Ser Ser Pro Ser Lys Asp Glu Asn Gly Lys Gln202530
Fro Glu Lys Thr Pm 3權(quán)利要求
1.一種提取質(zhì)粒DNA的試劑，其特征在于包括: 細胞懸浮液、細胞裂解液、緩沖液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、質(zhì)粒結(jié)合液和內(nèi)毒素去除顆粒溶液，其中:細胞懸浮液包括 2mmol/L KH2PO4,1OmmoI/L Na2HPO4.12H20,137mmol/L NaCl，2.7mmol/L KC1,1% Tween20, pH6.0-8.0，使用前加入RNase A并混合均勻，4°C貯存，以超純水為溶劑； 細胞裂解液包括0.1-2.5mol/L NaOH，質(zhì)量體積百分比為0.05% -1%的SDS，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存；緩沖液包括 0.1-0.5moI/L (NH4)2HPO4.NH4H2PO4,0.5_3mol/L KCl，pH3_5，以超純水為溶齊U，室溫密閉貯存；洗滌液 I 包括 2-8M GuHCl, 200m mol/L Tris,2M EDTA, 1.5mol/LNaCl, ρΗ6.8-7.0，以超純水為溶劑，室溫密閉貯存； 洗滌液2包括50-100%乙醇； 洗脫液為dH20 ； 內(nèi)毒素去除顆粒溶液包括10mg/ml能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的復合顆粒，含有0.02%疊氮鈉的 20mM Tris-HCl，pH 為 7.5 ; 質(zhì)粒結(jié)合液包括2-8M GuHCl, 10-50mM HEPES, pH6.8-8.2，以超純水為溶劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求 1所述的試劑，其特征在于，復合顆粒包括能與內(nèi)毒素特異性結(jié)合的特異性結(jié)合物和用于承載該特異性結(jié)合物的載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，特異性結(jié)合物選自以下的至少一種:(I)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽；2)能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多克隆抗體、或單克隆抗體、或多克隆抗體和單克隆抗體的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，內(nèi)毒素去除顆粒溶液包括多肽和載體的復合顆粒，或抗體和載體的復合顆粒，或多肽和載體的復合顆粒與抗體和載體的復合顆的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于，所述能特異性結(jié)合內(nèi)毒素的多肽選自以下序列的至少一種:序列 lkeegldhsnrkn fklnrkliif fegrrikgnk序列 2gkpsegqpse sqpsesgdsg qsspskdeng kqpektp。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，載體選自瓊脂糖凝膠顆粒、磁珠顆粒、乳膠顆粒或膠體金顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于，特異性結(jié)合物和載體之間以1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳二亞胺或N-羥基琥珀酼亞胺作為偶聯(lián)劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，還包括內(nèi)毒素去除液，所述內(nèi)毒去除溶液包括 2-85mM Tris,0.5-10% TritonX-114, ρΗ8.0,以超純水為溶劑。
9.一種利用權(quán)利要求1至8之一所述的試劑提取質(zhì)粒DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取2-4ml在培養(yǎng)基中培養(yǎng)8-16小時的菌液，12，OOOXg離心I分鐘，棄盡上清； (2)加250μI細胞懸浮液以懸浮步驟I中的細菌，懸浮需均勻，不應留有小的菌塊；(3)向步驟2的細胞懸浮液中加入250μ I細胞裂解液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4-6次混合均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，操作時間不超過5分鐘； (4)向步驟3中的透亮溶液中加350μ I緩沖液，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，,12，OOOXg離心10分鐘； (5)吸取步驟4中的離心上清并轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒提取制備管，12，000Xg離心I分鐘，棄濾液； (6)將制備管置回離心管，加500μ I洗滌液1，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液； (7)將制備管置回離心管，加700μ I洗滌液2，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液；再次加Λ 700 μ I洗滌液2洗滌一次，12，000 X g離心I分鐘，棄濾液； (8)將制備管置回2ml離心管中，12，000Xg離心I分鐘； (9)將制備管移入新的1.5ml離心管中，在制備管中央加150 μ I洗脫液，室溫靜置I分鐘，12，000 Xg離心I分鐘； (10)棄制備管,往離心管中加入內(nèi)毒素去除顆粒溶液50μ I,顛倒混勻5分鐘，I, OOOxg離心20秒； (11)小心吸取上清液150μ I至一干凈離心管中，加入質(zhì)粒結(jié)合液300 μ 1，混合均勻； (12)將步驟11的混合液加入至一無內(nèi)毒素制備管中，12，OOOXg離心I分鐘； (13)將制備管置回離心管，加700μ I洗滌液2，12，000 Xg離心I分鐘，棄濾液；再次加入700 μ I洗滌液2洗滌一次，12，OOOXg離心I分鐘，棄濾液； (14)將制備管置回2ml離心管中，12，000Xg離心I分鐘； (15)將制備管置于一干凈的新離心管中； (16)在制備管中加入60μ I洗脫液以溶解質(zhì)粒DNA，室溫靜置I分鐘，12，000 X g離心I分鐘，得質(zhì)粒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，加入內(nèi)毒素去除顆粒溶液并混勻后，力口入內(nèi)毒素去除液，劇烈混合I分鐘；將離心管置于42°c I分鐘后，12，OOOxg離心2分鐘,溶液分為無色上相和藍色下相；小心吸取無色上相于一干凈離心管中，加入質(zhì)粒結(jié)合液；所述內(nèi)毒素去除溶液包括2-85mM Tris,0.5-10% Trito nX-114, pH8.0,以超純水為溶劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種提取質(zhì)粒的試劑和方法，它包括細菌裂解液、內(nèi)毒素去除顆粒溶液、內(nèi)毒素去除液、質(zhì)粒結(jié)合液、洗滌液和洗脫液等試劑。利用本發(fā)明所述試劑和方法提取質(zhì)粒，其操作步驟簡單，提取所消耗的時間短，能有效降低所提取質(zhì)粒中的內(nèi)毒素含量，所提取的質(zhì)粒中內(nèi)毒素的含量可降至0.1EU/μg以下，符合臨床標準，獲得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量高，純度好。
文檔編號C12N15/10GK103173438SQ20131012508
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月10日
發(fā)明者林源吉, 呂航 申請人:杭州百邁生物技術(shù)有限公司