專利名稱：檢測類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母以及生物 測試方法，具體的說是涉及一種利用酵母雙雜交技術(shù)獲得的包含重組維曱
酸X受體基因的雙雜交酵母，以及利用該酵母來檢測類/抗維曱酸化合物，
特別是環(huán)境中的類/抗維曱酸化合物的生物測試方法。
背景技術(shù)：
環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物，亦被稱為環(huán)境激素，是指人類在生產(chǎn)、生活 過程中釋放到環(huán)境中的某些有毒化學(xué)物質(zhì)，它們與人體和動物體內(nèi)的激素 具有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并能夠產(chǎn)生類似激素的作用。它們進(jìn)入體內(nèi)，擾亂 了激素的正常分泌，使人和動物的生理過程發(fā)生紊亂，導(dǎo)致生殖、免疫等
功能發(fā)生障礙。環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾物的干擾效應(yīng)包括雌激素干擾效應(yīng)、 雄激素干擾效應(yīng)、維曱酸干擾效應(yīng)等。維曱酸(retinoicacid， RA)也稱為視 黃酸，是指天然或人工合成的維生素A的衍生物，具有重要生理活性，特 別是對生物體的胚胎發(fā)育、器官形成、生殖等具有重要作用。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)持 久性有毒有機(jī)污染物(POPs)的暴露與生物體內(nèi)維曱酸平衡的破壞相關(guān)，盡 管這類具有維曱酸干擾活性的化合物在環(huán)境中濃度極小，但是其一旦進(jìn)入 人體和動物體內(nèi)，可以與特定的維曱酸受體結(jié)合形成復(fù)合物，啟動/抑制下
游基因的表達(dá)，干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的正常功能。90年代對維曱酸X受體作 用機(jī)制的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了維曱酸X受體的共激活因子(coactor),并建 立了新的受體作用理論(參見，Hong, H., Kohlit, K., Trivedit, A., Deborah, L., Johnson, D丄.和Stallcup, M.R., 1996, Natl. Acad. Sci. USA. 93:4948-4952 )。 該理論認(rèn)為，維曱酸(或者環(huán)境中類/抗維曱酸物質(zhì))與相應(yīng)維曱酸X受 體的配體結(jié)合區(qū)(LBD)結(jié)合后引起構(gòu)象改變，進(jìn)一步結(jié)合共激活因子， 促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。
對環(huán)境中維曱酸干擾效應(yīng)的研究剛剛起步，目前報(bào)道應(yīng)用較多的為化 學(xué)分析和生物測試方法?；瘜W(xué)分析需要高分辨色譜/高分辨質(zhì)譜，除了分析費(fèi)用高外，對儀器設(shè)備條件和人員素質(zhì)有相當(dāng)嚴(yán)格的要求。另外一種廣泛
采用的是利用重組維曱酸X受體酵母菌(Yeast Estrogen Screen, YES)進(jìn)行 測試，這種測試?yán)玫氖侵亟M維曱酸X受體及受體共激活因子TIF2構(gòu)建 的雙雜交酵母(參見，Nishikawa, J丄，Mamiya， S.， 2004， Environ. Sci. Technol. 38:6271-6276)。目前，通常采用報(bào)道基因的方法指示外界干擾、
如化合物暴露等對基因轉(zhuǎn)錄的影響。在雙雜交酵母方法中，通常采用的
Z基因是一種常用的編碼p-半乳糖苷酶的報(bào)道基因，其產(chǎn)物p-半乳糖苷酶 具有強(qiáng)的酶催化活性，能夠與特定底物反應(yīng)生成新的有色化合物，易于檢 測。因此，通過簡單測定(3-半乳糖苷酶的活性，就能夠表征對基因轉(zhuǎn)錄的 影響。Nishiham等報(bào)道的雙雜交酵母方法采用的是Y190酵母菌林作為載 體，隨著技術(shù)的發(fā)展采用Y187(含有雙拷貝數(shù)的編碼|3-半乳糖苷酶的ZacZ 基因)釀酒酵母菌抹作為載體，由于其高的P-半乳糖苷酶表達(dá)量，則更能 提高整個方法的靈敏度與準(zhǔn)確性，減少假陽性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一種用于檢測樣品中類/抗維曱酸化合物的雙 雜交酵母，在此基礎(chǔ)上建立一種檢測類/抗維曱酸化合物的生物測試方法。 該檢測方法快速簡便，成本低廉，省時省力，應(yīng)用廣泛，所需樣品量少。
本發(fā)明是通過下述方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明的 一 個方面提供了 一種用于檢測環(huán)境樣品中的類/抗維甲酸化 合物的雙雜交酵母，其中，該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒和 pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒包含 維曱酸X的受體基因，pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維曱酸X受體共激活因子基因片段。
優(yōu)選地，所述維曱酸X受體基因?yàn)槭缶S曱酸X受體基因或具有如SEQ ID No.l所示序列的鼠維曱酸X受體基因片段。
所述的雙雜交酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) RXR-GRIP1,其保藏編號為CGMCC No .2305。該酵母已于2007年12 月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC,北 京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)進(jìn)行了生物材 料保藏。
優(yōu)選地，所述類維曱酸化合物選自天然維甲酸化合物、有機(jī)錫化合物、酚類化合物或其代謝后具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物、 有機(jī)氯農(nóng)藥類化合物中的一種或幾種，所述抗維曱酸化合物選自酚類化合 物或其代謝后具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物、鄰苯二甲酸酯類化合物、有機(jī)氯農(nóng) 藥類化合物中的一種或幾種。
本發(fā)明的另一個方面還提供了一種制備雙雜交酵母的方法，其中，該
方法包括以下步驟
(1) 純化包含維曱酸X受體基因的pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒；
(2) 純化包含維曱酸X受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl酵 母表達(dá)質(zhì)粒；
(3) 構(gòu)建雙雜交酵母，用所述的pGBT9-RXR質(zhì)粒和所述的 pGAD424-GRIPl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞中，形成雙雜交酵母，此處的酵 母細(xì)胞優(yōu)選Y187釀酒酵母細(xì)胞。
具體而言，pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒用pGBT9-RXR(日本大阪大學(xué) Nishikawa教授惠贈。參見Nishikawa, J.I., Mamiya, S., 2004， Environ. Sci. Technol. 38: 6271-6276)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在含有氨爺青霉素的培養(yǎng) 基中篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并純化。
pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒用pGAD424-GRIPl (美國加州大學(xué) Stallcup教授惠贈。參見Li, H.W.， Kim,丄H.， Koh， S.S., Stallcup， M.R. 2003. J.Biol. Chem. Biol. 279(6):4212-4220.)轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，在含有氨爺 青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并純化。
優(yōu)選地，所述的形成雙雜交酵母之后還篩選所述的雙雜交酵母。
所述的篩選所述的雙雜交酵母優(yōu)選是采用營養(yǎng)缺陷型篩選和菌落轉(zhuǎn) 移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選所述雙雜交酵母。
所述的菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析優(yōu)選是采用添加維曱酸的X-gal緩沖液的 菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析。具體而言，在上述方法中，構(gòu)建雙雜交酵母時，同時 加入pGBT9-RXR質(zhì)粒和pGAD424-GRIPl質(zhì)?；旌暇鶆颍⒓尤敫惺軕B(tài) Y187釀酒酵母細(xì)胞孵育，得到雙雜交酵母。
所述維曱酸優(yōu)選為9-順維甲酸，所述X-gal緩沖液優(yōu)選為20mg 'ml/1 5-溴-4-氯-3-吲哚-P -D-半乳糖苷的二曱基曱酰胺溶液。
所述營養(yǎng)缺陷型篩選中采用的培養(yǎng)基優(yōu)選為不添加亮氨酸和色氨酸 的SD培養(yǎng)基，(即SD/-Trp/-Leu )其中包含20 mg/L腺嘌呤半硫酸鹽、20 mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L —水合鹽酸組氨酸、30 mg/L異亮氨酸、30 mg/L鹽酸賴氨酸、20mg/L曱硫氨酸、50mg/L苯丙氨酸、200 mg/L蘇氨酸、 30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嘧啶、150 mg/L纈氨酸和6.7g/L無氨基酸酵 母氮源。
具體而言，在上述方法中，篩選雙雜交酵母時，采用營養(yǎng)缺陷型篩選 和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵母通過營養(yǎng) 缺陷型培養(yǎng)基(SD/-Trp/-Leu )粗篩出陽性菌落，進(jìn)一步使用菌落轉(zhuǎn)移濾 膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#干燥濾膜上，液氮反復(fù)凍融，破碎 細(xì)胞；將l并濾膜置于含維曱酸的X-gal緩沖液的2弁濾膜上，3(TC孵育至 出現(xiàn)明顯藍(lán)色菌落，將顯色菌落繼續(xù)培養(yǎng)備用。
本發(fā)明的再一個方面還提供了一種利用所述的雙雜交酵母檢測環(huán)境 中類維甲酸化合物的生物測試方法，該方法包括如下步驟
(1 )首先將所述雙雜交酵母細(xì)胞分別接種于已知系列濃度維曱酸培 養(yǎng)液，形成菌液，暴露培養(yǎng)2-4小時；
(2) 暴露培養(yǎng)結(jié)束后，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的 反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)30-60分鐘，檢測上清液在420nm處的吸光度值，并以此 作為表示p-半乳糖苷酶活性的參數(shù)；
(3) 根據(jù)所述的系列濃度維曱酸相對于它所對應(yīng)的p-半乳糖苷酶活 性的參數(shù)繪制p-半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(4) 將所述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-p-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測反應(yīng)上清液在420nm處 的吸光度值，對照所述的誘導(dǎo)劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中 類維曱酸化合物的含量。
優(yōu)選地，所述的待測樣品優(yōu)選為環(huán)境樣品中的有機(jī)溶劑提取液，其中 的類維曱酸化合物濃度為1(T9~ 1O一mol/L。
優(yōu)選地，繪制誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線具體步驟為將維曱酸溶解到二甲基亞砜 (DMSO)中，此處的維曱酸優(yōu)選9-順維曱酸，制備一系列的9-順維曱酸 標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液，濃度范圍2xl(T7 2xlO"mol/L,按照0.5%的比例添加 9-順維曱酸標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液到雙雜交酵母細(xì)胞菌液中，制備暴露液；將暴 露液接種至96孔板中(200)aL/孔)；30。C培養(yǎng)2小時后檢測600nm處的吸 光度值；再將含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液加入到96孔 板中；30。C下充分反應(yīng)后，添加1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)；在420nm 處用分光光度計(jì);險(xiǎn)測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，并以此作為表示P -半乳糖苷酶的參數(shù)，繪制9-順維曱酸對雙雜交酵母細(xì)胞的P-半乳糖香酶 活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。
P-半乳糖苷酶活性u的計(jì)算公式如下u = (As-AB)/t .V .D .ODs, 式中，u為P -半乳糖苷酶活性；t為反應(yīng)時間(min ); V為測試體積(mL); D為稀釋因子；ODs為測試樣品在595nm處的吸光度值；As為測試樣品 在420nm處的吸光度值OD42Q; AB為空白對照在420nm處的吸光度。
所述纟企測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加二曱基亞石風(fēng) (DMSO)溶解的待測樣品到含有雙雜交酵母細(xì)胞的菌液中，制備暴露液； 暴露液接種至96孔板中(200pL/孔)；30。C培養(yǎng)2小時后4企測600nm處的 吸光度值；再將含有過量鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液加入到96 孔板中；30。C下充分反應(yīng)后，添加lmol L"的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)；在 420nm處用分光光度計(jì)4企測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，來4企測待測化 合物是否具有維曱酸X受體誘導(dǎo)活性，即將測得的結(jié)果與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線比 較，進(jìn)而可以計(jì)算出環(huán)境樣品中類維曱酸化合物的含量，從而評價環(huán)境中 類維曱酸化合物的毒性效應(yīng)。
本發(fā)明的再一個方面還提供了一種利用所述的雙雜交酵母檢測抗維 曱酸化合物的生物測試方法，該方法具體包括如下步驟
(1 )首先將雙雜交酵母細(xì)胞分別與接種于已知系列濃度的抗維曱酸 化合物培養(yǎng)液，形成菌液，并向所述的菌液中添加已知濃度維曱酸，共培 養(yǎng)2-4小時；
(2) 培養(yǎng)結(jié)束后，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷反應(yīng)液 進(jìn)行反應(yīng)，直到菌液出現(xiàn)黃色，；險(xiǎn)測上清液在420nm處的吸光度值，并以 此作為表示p-半乳糖苷酶活性的參數(shù)；
(3) 根據(jù)所述的系列濃度的抗維曱酸化合物相對它所對應(yīng)的P-半乳 糖苷酶活性的參數(shù)繪制|3-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲 線；
(4) 將所述的菌液與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳 糖苷反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測反應(yīng)上清液在420nm處的吸光度 值，對照步驟(3)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中抗維甲酸化合物的含量。
優(yōu)選地，在所述步驟(l)中，所述的維曱酸為9-順維曱酸，濃度為 5xlO-7~ 5xlO_6mol/L。
優(yōu)選地，待測樣品為環(huán)境樣品中的有機(jī)溶劑提取液，其中抗維曱酸化合物濃度為10'8 ~ 10'5 mol/L。
優(yōu)選地，在步驟(1)中，將所述的雙雜交酵母細(xì)胞接種前，調(diào)節(jié)維 曱酸培養(yǎng)液在600nm處的吸光度值為0.1-0.2,并且在步驟(2)培養(yǎng)結(jié) 束后，調(diào)節(jié)菌液在600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
具體而言，在上述檢測環(huán)境中抗維甲酸化合物的生物測試方法中，雙 雜交酵母細(xì)胞的培養(yǎng)方法為將上述的雙雜交酵母細(xì)胞接種到不添加亮氨 酸和色氨酸的SD培養(yǎng)基，(即SD/-Trp/-Leu )中，檢測菌液600nm處的吸 光度值為0.1-0.2， 3(TC培養(yǎng)24小時后調(diào)整酵母菌液600nm處的吸光度 值為0.7-0.8。
繪制誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線具體步驟為將9-順維曱酸溶解到二曱基亞砜 (DMSO)中，制備9-順維曱酸標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液(lxl(T3mol/L);將維曱 酸抑制劑五氯酚溶解到DMSO中，制備一系列的五氯酚標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液 (濃度范圍2xl(T7 ~ 2xlO"mol/L ),按照0.5 %的比例添加9畫順維曱酸和五 氯酚標(biāo)準(zhǔn)濃度反應(yīng)液到RXR-GRIP1酵母菌液中，制備暴露液；將暴露液 接種至96孔板中(200pL/孔)；30。C培養(yǎng)2-4小時后4全測600nm處的吸光 度值；再將含有過量鄰硝基苯-P -D-p比喃半乳糖香的反應(yīng)液加入到96孔板 中；30。C下充分反應(yīng)后，添加1 mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)；在420nm 處用分光光度計(jì)檢測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度值，并以此作為表示P-半乳糖苷酶的參數(shù)，繪制五氯酚對雙雜交酵母細(xì)胞RXR-GRIP1的P-半乳 糖苷酶活性抑制的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。
所述的檢測樣品的具體步驟為按照0.5%的比例添加9-順維曱酸和 二曱基亞砜(DMSO)溶解的待測樣品的雙雜交酵母細(xì)胞RXR-GRIP1菌 液中，制備暴露液；暴露液接種至96孔板中(200pL/孔)；3(TC培養(yǎng)2小 時后檢測600nm處的吸光度值；再將含有過量鄰硝基苯-13 -D-吡喃半乳糖 香的反應(yīng)液加入到96孔板中；30。C下充分反應(yīng)后，添加lmol/L的碳酸鈉 溶液終止反應(yīng)；在420nm處用分光光度計(jì)檢測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度 值，來檢測待測化合物是否具有維曱酸X受體抑制活性，即將測得的結(jié)果 與上述標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，進(jìn)而可以計(jì)算出環(huán)境樣品中抗維曱酸化合物的含 量，從而評價環(huán)境中抗維曱酸化合物的毒性效應(yīng)。
本發(fā)明提供的用于檢測環(huán)境樣品中類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母 以及生物檢測方法的優(yōu)益之處在于1)本發(fā)明的雙雜交酵母細(xì)胞 RXR-GRIP1能夠同時表達(dá)維曱酸X受體蛋白、維甲酸X受體共激活因子蛋白，支持最新的受體作用理論，最能模擬哺乳動物細(xì)胞內(nèi)維曱酸x受體
的作用機(jī)制，采用Y187釀酒酵母細(xì)胞作為載體，表達(dá)基因產(chǎn)生的p-半乳 糖苷酶的酶活性大大增強(qiáng)，易于檢測，很適合作為化合物毒性篩選、環(huán)境 樣品類/抗維曱酸效應(yīng)評價方面的試驗(yàn)研究；2)酵母細(xì)胞試驗(yàn)快速、簡便 可以對大量環(huán)境樣品或化學(xué)物質(zhì)的內(nèi)分泌干擾物效應(yīng)進(jìn)行前期篩選，為活 體試驗(yàn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，彌補(bǔ)了活體試驗(yàn)試驗(yàn)周期長，費(fèi)用高的不足； 3)添加9-順維甲酸(5xl。-6 mol'L")的X-gal緩沖液在菌落轉(zhuǎn)移濾膜分 析中的應(yīng)用，大大的縮短了操作時間，相當(dāng)程度上減輕了假陽性結(jié)果千擾 的可能性；4)利用SD/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行酵母培養(yǎng)，能夠 有效防止雙雜交酵母細(xì)胞的回復(fù)突變，減輕傳代過程中質(zhì)粒丟失的情況， 使得雙雜交酵母細(xì)胞的蛋白表達(dá)穩(wěn)定，試驗(yàn)測試結(jié)果之間的平行性較好； 5 )利用重組維曱酸X受體基因雙雜交酵母進(jìn)行類維曱酸污染物的篩選和 毒性毒理研究時，致毒機(jī)理明確，操作簡便，省時省力，所需樣品量少， 成本低廉；6)本發(fā)明重組了幾乎全長的維曱酸X受體共激活因子GRIP1 基因(>99%)，能夠更好的與維曱酸X受體反應(yīng)，增強(qiáng)p-半乳糖苷酶的酶 活性，提高反應(yīng)靈敏度。7)本發(fā)明同時檢測了環(huán)境樣品中的類維曱酸化 合物和抗維曱酸化合物，與類維曱酸化合物的單因素檢測相比能夠更全面 的反映環(huán)境樣品對維曱酸X受體的干擾作用；8 )與Nishikawa文獻(xiàn)(參見， Nishikawa， J丄，Mamiya, S., 2004, Environ. Sci. Technol. 38: 6271-6276 )報(bào)道 克隆維曱酸X受體共激活因子TIF2基因片H采用酵母細(xì)胞Y190作為 載體細(xì)胞不同的是，本發(fā)明克隆維曱酸X受體共激活因子GRIP1基因或 基因片段(>99%)采用釀酒酵母細(xì)胞Y187構(gòu)建雙雜交酵母，因此在測定 環(huán)境化合物的維曱酸干擾效應(yīng)時具有更高的靈敏度和反應(yīng)活性， RXR-GRIP1酵母誘導(dǎo)的最大酶活性值是RXRI3-TIF2酵母誘導(dǎo)的最大酶 活性值的3.4倍。


圖1表示9-順維曱酸對釀酒酵母CGMCCNo.2305以及RXR-TIF2酵 母酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較。其中橫坐標(biāo)是9-順維曱 酸濃度，縱坐標(biāo)是9-順維曱酸誘導(dǎo)的(3-半乳糖苷酶活性；其中口表示9-順維曱酸對RXR-TIF2酵母誘導(dǎo)效應(yīng)；固表示9-順維曱酸對釀酒酵母 CGMCC No.2305誘導(dǎo)效應(yīng)。圖2表示五氯酚對9-順維甲酸(5xl(T6mol/L ) i秀導(dǎo)釀酒酵母CGMCC No.2305活性抑制的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)是五氯酚濃度， 縱坐標(biāo)是五氯酚抑制的(3-半乳糖苷酶活性；
圖3表示結(jié)合環(huán)境水樣前處理方法，利用釀酒酵母CGMCC No.2305 生物方法測試某污水處理廠不同處理出水樣品類/抗維曱酸效應(yīng)的結(jié)果；其 中橫坐標(biāo)是某污水處理廠不同處理工藝，縱坐標(biāo)是釀酒酵母CGMCC No.2305的測試結(jié)果；其中B表示樣品的類維曱酸誘導(dǎo)效應(yīng)；口表示樣品 的抗維甲酸抑制效應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的雙雜交酵母RXR-GRIP1是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的RXR-GRIP1菌抹，其保藏編號為CGMCC No .2305。該酵 母已于2007年12月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心(CGMCC,北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院」微生物研究所，郵編 100101)進(jìn)行了生物材料保藏。
以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1:雙雜交酵母RXR-GRIP1細(xì)胞的制備
1. 純化包含維曱酸受體基因片段(即SEQ ID No.l所示序列)的 pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒。
用10|liL誘飾質(zhì)粒pGBT9-RXR (日本大阪大學(xué)Nishikawa教授惠贈) 轉(zhuǎn)化100|uL感受態(tài)大腸桿菌DH5 oc,在含有氨千青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽 性克隆，提取質(zhì)粒并純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA大小，同 時對質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定，測序引物為pGBT9通用引物(測序工作由 北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨千青霉素的培養(yǎng)基 包含100mg/L氨節(jié)青霉素、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl 和15g/L瓊脂糖。
2. 純化包含維甲酸X受體共激活因子基因片段(即SEQ ID No.2所 示序列)的pGAD424-GRIPl酵母表達(dá)質(zhì)粒。
用lO^L靶質(zhì)粒pGAD424-GRIPl (美國加州大學(xué)Stallcup教授惠贈) 轉(zhuǎn)化100(iL感受態(tài)大腸桿菌DH5 cx ,在含有氨千青霉素的培養(yǎng)基中篩選陽 性克隆，提取質(zhì)粒并純化。0.8。/。瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA大小，同 時對質(zhì)粒DNA進(jìn)行序列測定，測序引物為pGAD424通用引物(測序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成)。所述含有氨千青霉素的培養(yǎng)
基包含100mg/L氨芐青霉素、10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L NaCl和15g/L瓊脂糖。
3. 構(gòu)建雙雜交酵母RXR-GRIP1。
同時加入O.l(ig pGBT9-RXR質(zhì)粒和O.lpg pGAD424-GRIPl質(zhì)?；旌?均勻，并加入0.1mL新鮮制備的感受態(tài)Y187釀酒酵母細(xì)胞，200rpm， 30 。C孵育30min。加入70pL 二曱基亞砜(DMSO )混合均勻后，42。C水浴放 置15min;細(xì)胞迅速轉(zhuǎn)移到冰浴，靜置l-2min,構(gòu)建雙雜交酵母 RXR-GRIP1。
4. 篩選雙雜交酵母RXR-GRIP1。
在上述方法中，篩選雙雜交酵母RXR-GRIP1時，采用營養(yǎng)缺陷型篩 選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜交酵母，雙雜交酵母通過營 養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基(SDATrpALeu )粗篩出陽性菌落，進(jìn)一步使用菌落轉(zhuǎn)移 濾膜分析方法，將菌落影印到無菌的1#干燥濾膜上，液氮反復(fù)凍融3~5 次，破碎細(xì)胞；將1 #濾膜置于含9-順維曱酸(5 x l(T6mol/L )的X-gal緩 沖液的2#濾膜上，3CTC孵育直到克隆出現(xiàn)明顯的藍(lán)色。顯色的菌落即為 陽性菌落，陽性菌落繼續(xù)培養(yǎng)24小時后備用。所述SD/-Trp/-Leu包含20 mg/L腺噤呤半硫酸鹽、20mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L—水合鹽酸組氨酸、 30mg/L異亮氨酸、30mg/L鹽酸賴氨酸、20 mg/L曱疏氨酸、50 mg/L苯 丙氨酸、200 mg/L蘇氨酸、30 mg/L酪氨酸、20 mg/L尿嘧啶、150 mg/L 纈氨酸、6.7g/L無氨基酸酵母氮源；X-gal緩沖液為20mg/L 5-溴-4-氯-3-丐l咮-13 -D-半乳糖苷的二曱基曱酰胺溶液。
實(shí)施例2:
利用雙雜交酵母RXR-GRIP1 (釀酒酵母CGMCC No .2305 )測定9-順維甲酸的誘導(dǎo)效應(yīng)來繪制標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)曲線
酵母細(xì)胞培養(yǎng)將制備的雙雜交酵母RXR-GRIP1細(xì)胞接種到 SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，(培養(yǎng)基組成與實(shí)施例1中相同)檢測菌液 600nrn處的吸光度值(以培養(yǎng)基為空白)，調(diào)節(jié)吸光度值為0.1~0.2， 30°C 空氣浴搖床中培養(yǎng)24小時調(diào)整菌液600nm處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取菌懸液0.995mL至對應(yīng)的Eppendorf管中，加入5pL DMSO (空白)或5pL用DMSO溶解的9-順維甲酸；將以上溶液各200|iL依次轉(zhuǎn)移到96孔々反中。然后于130rpm， 30。C于96孔才反搖床振蕩培養(yǎng)2 小時；培養(yǎng)結(jié)束后，首先4會測600nm處的吸光度值；去除150pL酵母菌 液；加入120pL測試緩沖液(每100mL基礎(chǔ)緩沖液中加入3.33mL濃度為 0.1%的SDS溶液和270pL P-巰基乙醇)和20pL氯仿，在30。C的恒溫?fù)u床 上預(yù)培養(yǎng)10min;再加入40pL鄰硝基苯-卩-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液 (0.04g/L),啟動酶反應(yīng)，隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，可以逐漸看到培養(yǎng)液呈現(xiàn) 越來越強(qiáng)的黃色；30。C下充分反應(yīng)后，添加100jiL碳酸鈉溶液(1 mol/L) 終止反應(yīng)；取200|iL上清液在420nm處用分光光度計(jì)4金測終產(chǎn)物鄰硝基 酚鈉的吸光度值，并以此作為表示(3-半乳糖苷酶的參數(shù)，繪制9-順維曱酸 對雙雜交酵母細(xì)胞RXR-GRIP1的p-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān) 系標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
卩-半乳糖苷酶活性u的計(jì)算公式如下u = (As-AB)/tV'DODs,式 中，u為卩-半乳糖苷酶活性；t為反應(yīng)時間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；ODs為測試樣品595nrn處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42(); As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-P -D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液包含21.51g/L Na2HP04 12H20 、 6.22g/L NaH2P04 2H20 、 0.75g/L KC1 、 0.25g/L MgS04 . 7H20、 0.04g/L鄰硝基苯-p -D-吡喃半乳糖苷。
相同的方法4企測9-順維曱酸對雙雜交酵母RXR-TIF2細(xì)胞(日本大阪 大學(xué)Nishikawa教授惠贈)P-半乳糖苷酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲 線。
由圖1可知，9-順維曱酸對雙雜交酵母RXR-GRIP1細(xì)胞p-半乳糖苷 酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的EC5o值為1.0xl(T7mol/L,在 5xl(T9~5xlO-6 mol/L范圍內(nèi)存在線性關(guān)系；同時，RXR-GRIP1酵母誘導(dǎo) 的酶活性值明顯高于RXR-TIF2酵母，RXR -GRIP1酵母誘導(dǎo)的最大酶活 性值約是RXR-TIF2酵母誘導(dǎo)的最大酶活性值的3.4倍；初步表明雙雜交 維曱酸X激素受體基因酵母RXR-GRIP1測評體系，具有更高的靈敏度， 可以作為環(huán)境中類維曱酸化合物的毒性效應(yīng)的定量分析標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例3:利用雙雜交酵母RXR-GRIP1 (釀酒酵母CGMCC No .2305 ) 測定五氯酚的抑制效應(yīng)來繪制抑制曲線。
酵母細(xì)胞培養(yǎng)將制備的雙雜交酵母RXR-GRIP1細(xì)胞接種到SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基(組成與實(shí)施例2中相同)中，；險(xiǎn)測菌液600nm 處的吸光度值(以培養(yǎng)基為空白)，調(diào)節(jié)吸光度值為0.1-0.2, 30。C空氣浴 搖床中培養(yǎng)24小時后調(diào)整菌液600nm處的吸光度值為0.7-0.8。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取菌懸液0.995mL至對應(yīng)的Eppendorf管中，加入5pL 9-順維曱酸和5pL用DMSO溶解的五氯酚；將以上溶液各200|iL依次轉(zhuǎn) 移到96孔板中。然后于130rpm, 30°C于96孔板搖床振蕩培養(yǎng)2小時；培 養(yǎng)結(jié)束后，首先4企測600nm處的吸光度值；去除150pL酵母菌液；加入 120pL測試緩沖液(每100mL基礎(chǔ)緩沖液中加入3.33mL濃度為0.1%的 SDS溶液和270pL p-巰基乙醇)和20(iL氯仿，在30°C的恒溫?fù)u床上預(yù)培 養(yǎng)10min;再加入40pL鄰硝基苯-卩-D-他喃半乳糖苷的反應(yīng)液(0.04g/L )， 啟動酶反應(yīng)，隨著進(jìn)一步的培養(yǎng)，可以逐漸看到培養(yǎng)液呈現(xiàn)越來越強(qiáng)的黃 色；30。C下充分反應(yīng)后，添加100pL碳酸鈉溶液(1 mol/L)終止反應(yīng)；取 200pL上清液在420nm處用分光光度計(jì)檢測終產(chǎn)物鄰硝基酚鈉的吸光度 值，并以此作為表示p-半乳糖苷酶的參數(shù)，繪制五氯酚對9-順維曱酸誘導(dǎo) 雜交酵母細(xì)胞RXR-GRIP1的(3-半乳糖苦酶活性抑制的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲 線(圖2)。
P-半乳糖苦酶活性u的計(jì)算公式如下u = (As-AB)/t'V.D'ODs,式 中，u為卩-半乳糖苷酶活性；t為反應(yīng)時間(min); V為測試體積(mL); D 為稀釋因子；ODs為測試樣品595nrn處的吸光度值；As為測試樣品在 420nm處的吸光度值OD42Q; As為空白對照在420nm處的吸光度。
上述含有過量鄰硝基苯-P -D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液包含21.51g/L Na2HP04 . 12H20 、 6,22g/L NaH2P04 . 2H20 、 0.75g/L KC1 、 0.25g/L MgS04 . 7H20、 0.04g/L鄰硝基苯-(3 -D-吡喃半乳糖苷。
由圖2可知，五氯酚對雙雜交酵母RXR-GRIP1細(xì)胞P-半乳糖苷酶活 性抑制在lxl(T9-lxl(T5 mol/L測試濃度范圍內(nèi)存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān) 系線性關(guān)系；IC2o值(抑制20%的效應(yīng)所需化合物的濃度)為1.0xl(T7mol/L， 初步表明雙雜交維甲酸X受體基因酵母測評體系可以作為環(huán)境中抗維曱 酸化合物的毒性效應(yīng)的測評體系。
實(shí)施例4:利用雙雜交酵母RXR- GRIPl(釀酒酵母CGMCC No .2305 )
生物測試方法評價環(huán)境樣品的類/抗維甲酸污染物毒性。
分別釆集某市污水處理廠進(jìn)水、不同處理工藝出水作為樣品。釆用本發(fā)明所述的樣品前處理方法提取樣品中的類/抗維曱酸污染物，將提取到的
有機(jī)溶劑在高純氮?dú)庵写蹈桑尤隓MSO溶解并制備成在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范 圍內(nèi)任一濃度的測試用樣品溶液。
利用實(shí)施例2中所述的雙雜交酵母RXR-GRIP1生物測試方法評價環(huán) 境樣品的類維曱酸污染物毒性，測定結(jié)果參照圖l繪制的誘導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)曲線， 表示成為9-順維曱酸的當(dāng)量濃度；同時利用實(shí)施例3中所述的雙雜交酵母 RXR-GRIP1生物測試方法評價環(huán)境樣品的抗維曱酸污染物毒性，測定結(jié) 果參照圖2繪制的抑制曲線，表示成為五氯酚的當(dāng)量濃度，見圖3。
從圖3可以看出，該污水處理廠的不同處理工藝階段出水中均不含有 類曱維甲酸物質(zhì)，抗維曱酸物質(zhì)則有檢測五氯酚的當(dāng)量濃度范圍為0~ 2xl(T5g/L,該處理工藝對抗維曱酸物質(zhì)能夠有很好的去除。圖3的結(jié)果表 示可以用本發(fā)明提出的方法，判斷環(huán)境樣品中類/抗維曱酸污染物的毒性當(dāng)
量或其潛在生態(tài)毒性的大小。序列表
<110> 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心
<120> 檢測類/抗維曱酸化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法 <130> DIC07110127 <160> 2
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 1025
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 1
ggcagagttg actgtatcgc cggattcgat tcggtacagg aggagcgtca gcggggaaag 60 gacaaggatg gggatgggga gggggctggg ggagcccccg鄉(xiāng)agatgcc tgtggacagg 120 atcctggagg cagagcttgc tgtggaacag aagagtgacc agggcgttga gggtcctggg 180 ggaaccgggg gtagcggcag cagcccagat gaccctgtga ctaacatctg gcaggcactg 240 acaaacagct attcacgctt gttgagtggg cgaaaaggat cccacacttt tcctccttgc 300 ctctggatga tcaggtcata ttgctgcggg caggctggaa tgaactcctc attgcctcct 360
tttcacaccg atccattgat gttcgagatg gcatcctcct tgccacaggt cttcacgtgc 420accgcaactc agcccattca gccgaggggg gagccatcgg gggatccgcc tgctgacaga 480 gctagtgtcc aaaatgcgtg acatgaggat ggacaagaca gagcttggcc gcctgagggc 540 aatcattctg tttaatccag atgccaaggg cctctccaac cctagtgagg tggaggtcct 600 gcgggagaaa atgtatgcat cactggagac ctactgcaaa acagaaagta ccctgaacca 660 gcagggacgg tttgccaagc tgctgctacg tcttcctgcc ctccggtcca ttggccttaa 720 gtgtctagag catctgtttt tcatcaagct cattggtgaa cacccccatc gacacc加c 780 tcatggaatg cttgagctcc ccatcaactg acctaatcaa gcttatcgat accggcgacc 840 tgcagccagc taattccggg cgaatttctt atgattatga tttttatatt aatacgttaa 900 aaaaaaataa atgaatacaa tttaaaggac tcttaagttt aaaagaaatt cttaatctgg 960 ataactcttc ctgaagtcag ttgcttctcg aaataaagag gagaacttat tgagaaactc 1020 tcagg
1025
<210> 2
<211> 4374
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 2
ggagaaaaca cctctgaccc gtccagggca gagaccagaa aacgcaagga atgtcccgac 60
18cagctcggac cc汪gccccaa aaggagcact gagaaacgga accgcgagca ggagaataag 120
tacatagagg agctggccga tctgatcttc gcaaacttta atgatattga caacttcaac 180
ttcaaacctg acaaatgtgc catcctaaaa gaaactgtga agcagatccg ccagatcaaa 240
gagcaagaga aagcagcagc tgccaacata gatgaagtgc agaagtcaga tgtgtcgtcc 300
acggggcagg gtgtcatcga caaggatgca ctggggccca tgatgcttga ggccctcgat 360
gggttcttct tcgttgtgaa cctggaaggc agtgtggtgt tcgtgtcaga gaatgtgaca 420
cagtatctac ggtataacca agaagagctg atgaacaaga gtgtctacag catcctgcat 480
gtcggggacc acactgaatt tgtcaagaac ctgctgccaa agtccatggt gaatggagga 540
tcctggtctg gagaacctcc caggcggacg agccatacct tcaactgtcg catgctggtg 600
aagcctttgc cagattcaga agaggaaggc catgatagcc aggaagccca tcagaaatac 660
gaggcgatgc agtgcttcgc tgtgtctcag cccaagtcca tcaaagagga aggcgaagat 720
ttgcagtcct gcttgatttg tgtggcacga agagtcccca tgaaggaaag accaactctt 780
ccctcatcag aaagctttac cacccgccag gacctccaag gcaagateac ttcactggac 840
actagcacca tgagagccgc catgaagccg ggctgggaag atctggtaag aagatgcatt 900
cagaagttcc acacacagca tgaaggggag tctctatcat atgccaagag gcatcaccat 960
gaagttctga gacaagggtt ggcgttcagt cagatctatc gtttttcttt gtctgatggc 1020actctcgttg ctgcacaaac caagagcaaa ctcatccgtt ctcagactac taatgagcct 1080 cagcttgtaa tatctttaca eatgcttcac agagagcaga atgtatgtgt aatgaatccg1140 gatctgactg gacaagcgat ggggaagcca ttgaatccaa ttagctctag cagccctgcc 1200 caccaggccc tgtgcagtgg gaacccaggt caggacatga ccctcggtag caatataaat 1260 tttcccatga atggcccaaa ggaacaaatg ggcatgccta tgggcaggtt tggtggttct 1320 gggggcatga accatgtgtc aggcatgcag gcaaccactc ctcagggtag taactatgca 1380 ctcaaaatga acagtccctc gcaaagcagc cccggcatga acccggggca agccagctcc 1440 gtgctctccc caaggcagcg catgagcccc ggcgtggctg gcagtcctcg catcccaccc 1500 agtcagtttt cccctgcagg aagcttgcat tcccctgtgg gagtttgcag cagcacagga 1560 aatagccata gttataccaa cagttccctc aatgcactgc aagccctcag cgagggccat 1620 ggggtctcac tcgggtcctc gctggcttca ccggacctaa aaatgggcaa tttgcaaaac 1680 tccccagtta atatgaatcc tcccccactc agcaagatgg gaagcttgga ctccaaagac 1740 tgttttggac tttatgggga gccctcagaa ggtacaactg gacaagcaga ggccagctgc 1800 catcctgaag aacaaaaggg gcccaatgat tccagcatgc cccaggcggc cagcggggac 1860 agggctgagg gacacagccg gctgcatgac agcaaagggc agaccaaact cctgcagctg 1920
ctgaccacca agtccgacca gatggagcct tcacccttgc ccagctcctt gtcggacaca 1980<formula>formula see original document page 21</formula><formula>formula see original document page 22</formula>ataagtcaac aacctgatec tggctttact ggggctacga ctccccagag tcctctaatg 3960
tctccccgga tggcacatac tcagagtccc atgatgcagc agtctcaagc caacccagcc 4020
taccagccca cctcagacat gaatggatgg gcacagggga gcatgggtgg aaacagcatg 4080
ttctcacagc agtccccacc acactttggg caacaagcaa acaccagcat gtatagtaac 4140
aacatgaaca tcagtgtgtc gatggcaacc aacacgggtg gcttgagcag catgaaccag 4200
atgacatgcc agatgagcat gacctcagtg acctccgtgc ctacgtcagg actgccctcc 4260
atgggtcccg agcaggtcaa tgaccctgct ctgaggggag gcaacctttt cccaaaccaa 4320
ctgcctggaa tggacatgat caagcaggag ggagatgcat ctcggaaata ctgc 437權(quán)利要求
1. 一種用于檢測樣品中類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母，其特征在于，該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒，并且所述pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒包含維甲酸X的受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維甲酸X受體共激活因子基因片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述維曱酸X 受體基因?yàn)槭缶S曱酸X受體基因或具有如SEQ ID No.l所示序列的鼠維曱 酸X受體基因片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的雙雜交酵母，其特征在于，該雙雜交酵 母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae ) RXR-GRIP1，其保藏編號為 CGMCC No .2305。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1 、 2或3所述的雙雜交酵母，其特征在于，所述類 維曱酸化合物選自天然維曱酸化合物、有機(jī)錫化合物、酚類化合物或其代 謝后具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物、鄰苯二甲酸酯類化合物和有機(jī)氯農(nóng)藥類化合 物中的一種或幾種，并且所述的抗維甲酸化合物選自酚類化合物或其代謝 后具有酚類結(jié)構(gòu)的化合物、鄰苯二曱酸酯類化合物和有機(jī)氯農(nóng)藥類化合物中的一種或幾種。
5. —種制備權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母的方法，其特征 在于，該方法包括以下步驟(1) 純化包含維甲酸X受體基因的pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒；(2) 純化包含維曱酸X受體共激活因子基因的pGAD424-GRIPl酵 母表達(dá)質(zhì)粒；(3) 構(gòu)建雙雜交酵母，用所述的pGBT9-RXR質(zhì)粒和所述的 pGAD424-GRIPl質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母細(xì)胞中，形成雙雜交酵母。
6. 根據(jù)權(quán)利要5所述的方法，其特征在于所述的形成雙雜交酵母之后 還篩選所述的雙雜交酵母。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述的篩選雙雜交 酵母是采用營養(yǎng)缺陷型篩選和菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析相結(jié)合的方法篩選雙雜 交酵母。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述的菌落轉(zhuǎn)移濾 膜分析是采用添加維曱酸的X-gal緩沖液的菌落轉(zhuǎn)移濾膜分析，并且所述 維曱酸優(yōu)選為9-順維甲酸，所述X-gal緩沖液優(yōu)選為20mg . mL"的5-溴 -4-氯-3-吲哚-(3 -D-半乳糖苷的二曱基甲酰胺溶液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的制備方法，其特征在于，所述營養(yǎng)缺陷 型篩選中采用的培養(yǎng)基為不添加亮氨酸和色氨酸的SD培養(yǎng)基，其中包含 20 mg/L腺噪呤半硫酸鹽、20 mg/L鹽酸精氨酸、20 mg/L —水合鹽酸組氨 酸、30mg/L異亮氨酸、30mg/L鹽酸賴氨酸、20 mg/L曱碌^氨酸、50 mg/L 苯丙氨酸、200mg/L蘇氨酸、30mg/L酪氨酸、20mg/L尿嗜咬、150mg/L 纈氨酸和6.7g/L無氨基酸酵母氮源。
10. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母用于檢測類維曱酸化合 物的生物測試方法，該方法包括如下步驟(1) 首先將雙雜交酵母細(xì)胞分別接種于已知系列濃度維曱酸培養(yǎng)液， 形成菌液，培養(yǎng)2-4小時；(2) 培養(yǎng)結(jié)束后，向菌液中加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng) 液進(jìn)行反應(yīng)30-60分鐘，檢測上清液在420nm處的吸光度值，并以此作為 表示p-半乳糖苷酶活性的參數(shù)；(3 )根據(jù)所述的系列濃度維曱酸相對于它所對應(yīng)的P-半乳糖苷酶活 性的參數(shù)繪制|3-半乳糖苦酶活性的誘導(dǎo)劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線；(4)將所述雙雜交酵母細(xì)胞與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷的反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測反應(yīng)上清液在420nm處 的吸光度值，對照所述的p-半乳糖苷醇活性的誘導(dǎo)劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲 線計(jì)算出待測樣品中類維曱酸化合物的含量，所述的待測樣品優(yōu)選為環(huán)境 樣品中的有機(jī)溶劑提取液，其中的類維甲酸濃度為1(T9~ l(T7mol/L。
11. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的雙雜交酵母用于檢測抗維曱酸化合 物的生物測試方法，該方法具體包括如下步驟(1 )首先將雙雜交酵母細(xì)胞分別與接種于已知系列濃度的抗維曱酸 化合物的培養(yǎng)液，形成菌液，并向所述的菌液中添加已知濃度維曱酸，共 培養(yǎng)2-4小時，所述的維曱酸優(yōu)選濃度為5xl(T7 ~5xl(T6mol/L的9-順維甲 酸；(2)培養(yǎng)結(jié)束后，向菌液中加入鄰硝基苯-(3-D-吡喃半乳糖苷反應(yīng)液 進(jìn)行反應(yīng)，直到菌液出現(xiàn)黃色，4企測上清液在420nm處的吸光度值，并以此作為表示P-半乳糖苷酶活性的參數(shù)；(3) 根據(jù)所述的系列濃度的抗維曱酸化合物相對它所對應(yīng)的(3-半乳 糖苷酶活性的參數(shù)繪制P-半乳糖香酶活性誘導(dǎo)的劑量-效應(yīng)關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲 線；(4) 將所述的菌液與待測樣品共培養(yǎng)，加入鄰硝基苯-P-D-吡喃半乳 糖苷反應(yīng)液進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后檢測反應(yīng)上清液在420nm處的吸光度 值，對照步驟(3)制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測樣品中抗維甲酸化合物的 含量。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的生物測試方法，其特征在于，待測樣品為 環(huán)境樣品中的有機(jī)溶劑提取液，并且所述的抗維曱酸化合物的濃度為 10-8~ l(T5 mol/L。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的生物測試方法，其特征在于，在步 驟(l)中，將所述的雙雜交酵母細(xì)胞接種前，調(diào)節(jié)維曱酸培養(yǎng)液在600nm 處的吸光度值為0.1-0.2，并且在步驟(2)培養(yǎng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)菌液在600nm 處的吸光度值為0.7 ~ 0.8。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于檢測環(huán)境樣品中類/抗維甲酸化合物的雙雜交酵母及其制備方法，其中該酵母中含有pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒，其中pGBT9-RXR酵母表達(dá)質(zhì)粒包含維甲酸X受體基因，pGAD424-GRIP1酵母表達(dá)質(zhì)粒包含具有如SEQ ID No.2所示序列的維甲酸X受體共激活因子基因片段。本發(fā)明提供還提供了一種所述的雙雜交酵母檢測環(huán)境中類/抗維甲酸化合物的生物測試方法。采用該方法，使得β-半乳糖苷酶的表達(dá)增強(qiáng)，檢測靈敏度大大提高，構(gòu)建的酵母細(xì)胞基因性狀穩(wěn)定，易于培養(yǎng)、篩選，整個類/抗維甲酸效應(yīng)的篩選過程操作簡單，所需樣品量少，成本低廉。
文檔編號C12N1/19GK101469316SQ20071030851
公開日2009年7月1日 申請日期2007年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月29日
發(fā)明者劍 李, 王子健, 饒凱鋒, 梅 馬 申請人:中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心