測(cè)定急性呼吸窘迫綜合征(ards)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法、監(jiān)測(cè)患者的ards的發(fā)展和治療 ...的制作方法
【專利說明】測(cè)定急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)相關(guān)生物標(biāo)志物的方法、監(jiān)測(cè)患者的ARDS的發(fā)展和治療的方法發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于監(jiān)測(cè)患者的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的發(fā)展和用于治療患者的急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的方法。用于監(jiān)測(cè)ARDS的發(fā)展的方法基于將在較晚時(shí)間點(diǎn)提取的樣品中獲得的生物標(biāo)志物的水平或活性與先前時(shí)間點(diǎn)提取的樣品中的相同生物標(biāo)志物的水平或活性進(jìn)行比較。某些生物標(biāo)志物的水平或活性的有利變化表示疾病消退(患者恢復(fù))，相反地，某些生物標(biāo)志物的水平或活性的不利變化表示疾病惡化。例如，如果所監(jiān)測(cè)的一種或多種生物標(biāo)志物的水平或活性停止顯示有利變化或開始顯示不利變化，則通過給予可用于治療ARDS的治療活性劑，加強(qiáng)對(duì)患者的治療。
[0002]本發(fā)明另外涉及用于同時(shí)確定患者樣品中的多種生物標(biāo)志物的方法，其中所述生物標(biāo)志物與ARDS有關(guān)。確定了生物標(biāo)志物的水平或活性。本發(fā)明還涉及可用于進(jìn)行所述方法的診斷試劑盒，特別是包含適用于生物芯片技術(shù)的芯片(例如微陣列)的試劑盒。
[0003]發(fā)明背景
本文用于說明本發(fā)明的背景的出版物和其它材料，具體地說提供關(guān)于實(shí)踐的另外的詳情的案例，通過引用予以結(jié)合。
[0004]多重測(cè)定，即用于樣品中多種分析物的同時(shí)檢測(cè)或定量的方法是本領(lǐng)域本身眾所周知的。這類測(cè)定是在單一輪中同時(shí)測(cè)量多種分析物的測(cè)定。多重測(cè)定可根據(jù)每次測(cè)定可測(cè)量多少分析物來分類:分析物的量的范圍在從幾種(至少兩種)開始直到非常高的數(shù)目。商品化多重測(cè)定通常被設(shè)計(jì)用于同時(shí)檢測(cè)多達(dá)約50種分析物。這些方法可用于核酸和蛋白質(zhì)(例如抗體)的分析。還可測(cè)量碳水化合物和其它化學(xué)化合物。
[0005]多重方法可以以許多備選方式進(jìn)行。
[0006]作為實(shí)例可提及微陣列，其是同時(shí)確定許多生物分析物的固體支持物上的2D陣列。在蛋白質(zhì)微測(cè)定(例如抗體微測(cè)定)中，將不同的抗體以預(yù)定方式在固體支持物上固定到分開的位置上。這些抗體用作能夠俘獲存在于樣品中的分析物(蛋白質(zhì))的俘獲分子。
[0007]作為市購可得的測(cè)定的實(shí)例可提及Luminex? xMAP技術(shù)，其是直接在微量滴定板中進(jìn)行的基于珠粒的測(cè)定。各測(cè)定含有不同微球的混合物(珠?；旌衔?，其中各珠粒類型由用于分析物分類的各熒光色調(diào)限定，并在其表面上攜帶特異性俘獲試劑，例如特異性蛋白質(zhì)(抗體)。在珠?；旌衔锱c患者樣品溫育期間，互補(bǔ)反應(yīng)配偶體(抗原)與在微球上的俘獲抗體結(jié)合。在第二溫育步驟中，用攜帶特異性熒光標(biāo)志物的標(biāo)記抗體檢測(cè)結(jié)合的抗原。結(jié)合的分析物(抗原)的量與檢測(cè)抗體的熒光強(qiáng)度正相關(guān)，這允許定量分析物。珠粒的分類和抗原的定量用Luminex分析系統(tǒng)進(jìn)行，該系統(tǒng)基于使用兩種不同激光的流式細(xì)胞術(shù)的技術(shù)。
[0008]還提出了使用用于疾病的診斷和預(yù)后的多連續(xù)生物標(biāo)志物(multiplesequential b1markers)。
[0009]Chirag R Parikh 等，Crit Care Med 2008，第 36 卷，第 4 期(Suppl);第S159-S165頁，提出使用用于評(píng)價(jià)AKI (急性腎損傷)的持續(xù)時(shí)間和用于預(yù)測(cè)有關(guān)透析需要和死亡率的總體預(yù)后的多連續(xù)生物標(biāo)志物。生物標(biāo)志物是血漿組(plasma panel)中的NGAL (嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂籠蛋白)和胱抑蛋白C和尿液組(urine panel)中的NGAL、IL-18 (白介素-18)和IQM-1 (腎損傷分子-1)。
[0010]O Beran等，Eur J Clin Microb1l Infect Dis (2009) 28:793-799描述了生物標(biāo)志物例如IL-6 (白介素-6)、IL-1ra (白介素-1受體拮抗劑)、IL-1 β (白介素-1 β )、IL-8 (白介素-8)、MIP-1 β (巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1 β )和MCP-1 (單核細(xì)胞化學(xué)引誘蛋白-1)的序貫分析及其與MD (侵入性腦膜炎球菌病)的相關(guān)性及其嚴(yán)重性。
[0011]WO 2009/053523，F(xiàn)aron Pharmaceuticals 0y，公開了 CD73 是用于監(jiān)測(cè)患者的炎性疾病，具體地說SIRS (全身炎癥反應(yīng)綜合征)、ALI (急性肺損傷)、ARDS和MOF (多器官衰竭)的有用生物標(biāo)志物。在不同時(shí)間點(diǎn)從患者中提取組織液樣品，確定樣品中的CD73活性。發(fā)現(xiàn)CD73活性水平的提高與疾病的消退相關(guān)。
[0012]迄今為止，無人提出將多連續(xù)生物標(biāo)志物用于監(jiān)測(cè)患者的ARDS的發(fā)展。特別是，無人提出將由⑶73和IL-6組成或包括⑶73和IL-6的一組生物標(biāo)志物用于此目的。
[0013]發(fā)明概述
本發(fā)明的目的在于提供在該病況的治療期間跟蹤ARDS的嚴(yán)重性的方法和手段。通常ARDS患者接受最合理的重癥監(jiān)護(hù)，但更重要的是，使用生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)任何藥物治療正成為評(píng)價(jià)治療功效的非常有價(jià)值的資源。一種這樣的治療是Traumakine? FP-1201 (干擾素β )，已顯示該治療降低ARDS患者的死亡率。通過獲得有關(guān)患者病況的有價(jià)值的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)，I⑶醫(yī)生可使患者的護(hù)理最優(yōu)化。
[0014]因此，在一方面中，本發(fā)明涉及同時(shí)確定從患者中提取的樣品中的多種ARDS相關(guān)生物標(biāo)志物的方法，其中生物標(biāo)志物之一是⑶73蛋白。按照本發(fā)明，所述方法包括以下步驟
i)通過將樣品加入識(shí)別生物標(biāo)志物的結(jié)合劑中，定量所述樣品中生物標(biāo)志物的水平，
或
?)通過采用薄層色譜法或通過將所述樣品加入生物標(biāo)志物的底物中，并監(jiān)測(cè)所述底物的變化確定所述樣品中生物標(biāo)志物的活性。
[0015]在另一方面中，本發(fā)明涉及在用于同時(shí)確定從患者中提取的樣品中的多種ARDS相關(guān)生物標(biāo)志物的生物親和力測(cè)定方法中使用的診斷試劑盒，其中包括⑶73和其它生物標(biāo)志物的生物標(biāo)志物的數(shù)目為至少2種、優(yōu)選2-50種、最優(yōu)選2-8種。按照本發(fā)明，所述試劑盒包含
-固定在固體支持物或能夠固定在固體支持物上的一組俘獲結(jié)合劑，其中各俘獲結(jié)合劑對(duì)待確定的某種生物標(biāo)志物特異，和
-一組標(biāo)記的生物親和力組分，其中這類標(biāo)記的生物親和力組分各自具有對(duì)某種固定化生物標(biāo)志物特異的生物親和力，或其中這類標(biāo)記的生物親和力組分各自具有與某種固定化生物標(biāo)志物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)的能力。
[0016]在第三方面中，本發(fā)明涉及用于監(jiān)測(cè)患者的ARDS的發(fā)展的方法，其中確定了在不同時(shí)間點(diǎn)從患者中提取的樣品中的至少2種、優(yōu)選2-50種、最優(yōu)選2-8種ARDS相關(guān)生物標(biāo)志物，且其中生物標(biāo)志物之一是⑶73蛋白，所述方法基于將在較晚時(shí)間點(diǎn)提取的樣品中獲得的生物標(biāo)志物的水平或活性與在先前時(shí)間點(diǎn)提取的樣品中的同一生物標(biāo)志物的水平或活性進(jìn)行比較，其中某種生物標(biāo)志物的水平或活性的有利變化表示疾病消退，且其中某種生物標(biāo)志物的水平或活性的不利變化表示疾病惡化。
[0017]在第四方面中，本發(fā)明涉及用于通過給予患者有效治療ARDS的治療活性劑來治療患有ARDS的患者的方法，其中按照本發(fā)明，用于監(jiān)測(cè)ARDS的發(fā)展的一種或多種生物標(biāo)志物，
-一停止顯示有利變化，或 -一開始顯示不利變化就開始給藥。
[0018]附圖簡(jiǎn)述
圖1A顯示具有能夠結(jié)合俘獲結(jié)合劑的點(diǎn)的支持物，
圖1B顯示俘獲結(jié)合劑在其上固定的圖1A的支持物，
圖1C顯示在其上待確定的生物標(biāo)志物已經(jīng)固定在俘獲結(jié)合劑上的圖1B的支持物，
圖1D顯示在其上標(biāo)記的結(jié)合劑已經(jīng)固定在待確定的生物標(biāo)志物上的圖1C的支持物，圖2顯示標(biāo)記的抗體，其包含定向到生物標(biāo)志物的第一抗體和攜帶標(biāo)記并與第一抗體的Fe區(qū)結(jié)合的第二抗體的套件，
圖3顯示所測(cè)量的生物標(biāo)志物的水平隨時(shí)間而變的一組曲線。B1-B4的直線表明隨時(shí)間的變化是有利的。B5的虛線意味著其水平的降低表示不利變化。
[0019]圖4a-4h顯示從ALI或ARDS恢復(fù)的一組患者的8種生物標(biāo)志物隨時(shí)間而變的水平或活性(圖4a-4g顯示水平；圖4h顯示活性)。
[0020]圖5顯示作為實(shí)例的從ALI或ARDS恢復(fù)的一名患者的可溶性⑶73隨時(shí)間而變的活性和水平(濃度)兩者。從相同樣品的等分試樣中測(cè)量可溶性CD73活性(■，左y軸)和可溶性⑶73濃度(.，右y軸)。圖5顯示活性和濃度測(cè)量相當(dāng)?？梢钥闯觯?3 (圖5)和IL-6 (圖4b)值顯示在血漿濃度中的顯著變化，這表明了有利變化。
[0021]發(fā)明詳述
樣品可以是任何組織液，其浸潤(rùn)并圍繞著細(xì)胞。該術(shù)語包括例如血漿、血清、全血、淋巴、尿液、滲出液(胸膜、腹膜)和腦脊液。
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