一種甾醇內(nèi)酯及其在制備抗補(bǔ)體藥物中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及甾醇內(nèi)酯類化合物Fortisterol在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。本發(fā)明從馬勃的子實(shí)體中分離得到化合物Fortisterol，結(jié)構(gòu)為B環(huán)內(nèi)酯化的麥角甾醇。采用現(xiàn)代藥理研究方法證實(shí)其對補(bǔ)體系統(tǒng)經(jīng)典途徑和旁路途徑激活均有較強(qiáng)的抑制作用，其CH50和AP50值分別為0.033±0.006mg/ml、0.072±0.012mg/ml，可用于制備補(bǔ)體抑制劑。
【專利說明】
一種甾醇內(nèi)酯及其在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]
[0002] 本發(fā)明屬中藥制藥領(lǐng)域，涉及留醇內(nèi)酯及其再制備抗補(bǔ)體藥物中的用途，尤其是 馬勃中一種留醇內(nèi)酯Fortisterol及其在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 研究公開了補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活會引發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA)、急性呼吸窘迫綜合征（ARDS)等多種重大疾病，然而，目前臨床實(shí)踐中對此類疾病尚 缺乏較為理想的治療藥物。多年來抗補(bǔ)體藥物的研究一直是世界藥學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)， 從天然產(chǎn)物中研究開發(fā)補(bǔ)體抑制劑是近年來一個(gè)受到越來越多關(guān)注的重要研究領(lǐng)域，其具 有成本低、毒性低等特點(diǎn)。國內(nèi)外學(xué)者已從包括海洋生物在內(nèi)的多種天然產(chǎn)物中分離得到 多種具有補(bǔ)體系統(tǒng)抑制作用的單體化合物，為抗補(bǔ)體藥物的研究與開發(fā)提供了廣闊的前 景。
[0004] 馬勃又名馬灰包、灰包子等，是一種常見的以藥用為主的大型真菌，具有消 月中、止血、清肺、利咽、解毒等作用，為灰包科真菌脫皮馬勃（Lasiosphaerafenzlii Reich·)、大馬勃（Calvatia gigantea(Batsch ex Pers.)Lloyd)或紫色馬勃（Calvatia lilacina(Mont. et Berk. )Lloyd)的干燥子實(shí)體。有研究對已有的化學(xué)成分研究表明其 主要活性成分為留醇，此外還含有萜類、脂肪酸及其酯、氨基酸、多糖等，具有抗菌、抗炎、止 咳、抗腫瘤、抑制自由基等藥理活性。有研究最初從中國南海海綿BiemnafortisTopsent 分離得到相關(guān)化學(xué)成分的化合物[Huang X C，GuoY W，Song G Q.Fortisterol，a novel steroid with an unusual seven-membered lactone ring B from the Chinese marine sponge BiemnafortisTopsent[J]· JAsian Nat. Prod. Res.，2006, 8, 485-489.]，但未見該 化合物的抗補(bǔ)體活性報(bào)道。
[0005] 本申請的發(fā)明人擬提供從馬勃中分離得到的一種留醇內(nèi)酯Fortisterol及其在 制備臨床上急需高效、低毒、專一的新型補(bǔ)體抑制劑中的用途。從馬勃中分離得到一種甾醇 內(nèi)酯Fortisterol，為首次從馬勃中分離得到。結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特，為B環(huán)內(nèi)酯的麥角留醇結(jié)構(gòu)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種新型補(bǔ)體抑制劑，尤其是提供留醇內(nèi)酯Fortisterol在 制備抗補(bǔ)體藥物中的用途。
[0007] 本發(fā)明從馬勃中分離得到的一種留醇內(nèi)酯Fortisterol，該化合物結(jié)構(gòu)新穎獨(dú)特， 為B環(huán)內(nèi)酯的麥角留醇結(jié)構(gòu)；
[0008] 通過下述方法：取藥材馬勃子實(shí)體，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次，每次2h，合并 提取液并濃縮得浸膏，加水混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取5次，合并 萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物；將乙酸乙酯萃取部位經(jīng)硅膠（200-300目）柱色譜 分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫，得到10個(gè)流份（Fr. 1-10)，其中流份 Fr. 7再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1)、S印hadex LH-20柱色 譜（氯仿-甲醇，1:1)和反相HPLC(甲醇-7K，20:80-80:20,梯度洗脫）等手段純化，分離 得到化合物Fortisterol。
[0009] 本發(fā)明所述的留醇內(nèi)酯類化合物Fortisterol具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0010]
[0011] 所述化合物 Fortisterol :白色粉末，分子式 C2SH4Q03, EI-MS m/z :424[M] +。 i-NMRGOOMHz, CDC13) δ Η:5· 75(H, s), 5. 73(H, s), 5. 25(lH，m), 5. 14(lH，m), 1. 24(3H, s), 1. 02 (3H, d, J = 6. 5Hz), 0. 92 (3H, d, J = 6. 8Hz), 0. 84 (3H, d, J = 8. 4Hz), 0. 82 (3H, d, J = 8. 4Hz)，0· 64 (3H, s) · 13C-NMR (100MHz, CDC13) δ c: 33. 9 (C-l)，33. 2 (C-2)，198. 5 (C-3)，114. 7 (C-4), 173. 8(C-5), 162. 4(C-6), 113. 3(C-7), 159. 5 (C-8), 47. 2 (C-9), 40. 3 (C-10), 22. 6 (C -11)，39. 2 (C-12)，45. 9 (C-13)，58. 1 (C-14)，25. 3 (C-15)，27. 7 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C -18)，19. 9 (C-19)，40. 3 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 7 (C-22)，132. 8 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)，19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0012] 本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理研究方法，對中藥馬勃中分離得到的單體化合物進(jìn)行抗 補(bǔ)體活性評價(jià)，從馬勃子實(shí)體的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位中分離得到留醇內(nèi)酯 類化合物Fortisterol，經(jīng)過體外抗補(bǔ)體活性試驗(yàn)測定，證實(shí)其對補(bǔ)體系統(tǒng)的經(jīng)典途徑 和旁路途徑激活均有較強(qiáng)的補(bǔ)體抑制作用，其CH 5。和AP 5。值分別為0. 033 ± 0. 006mg/ ml、0. 072±0. 012mg/ml。陽性對照肝素 CH5。和 AP 5。值分別為 0. 026±0. 005mg/ml、 0· 054±0· 016mg/ml。
【附圖說明】
[0013] 圖1是馬勃中化合物Fortisterol的提取分離流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 實(shí)施例1制備馬勃中化合物Fortisterol
[0015] 取藥材馬勃子實(shí)體25kg，粉碎，用95 %乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h， 合并提取液并濃縮得浸膏〇.85kg，加水（4L)混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和 正丁醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物160g。將乙酸乙酯萃取 部位經(jīng)硅膠（200-300目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫， 得到10個(gè)流份（Fr. 1-10)，其中流份Fr.7(8g)再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇， 30:1,20:1，10:1,5:1,3:1)、S印hadex LH-20 柱色譜（氯仿-甲醇，1:1)和反相 HPLC(甲 醇-水，20:80-80:20,梯度洗脫）等手段純化，分離得到化合物Fortisterol ;
[0016] 所述化合物 Fortisterol :白色粉末，分子式 C2SH4Q03, EI-MS m/z :424 [Μ]+。 i-NMRGOOMHz, CDC13) δ Η:5· 75(H, s), 5. 73(H, s), 5. 25(lH，m), 5. 14(lH，m), 1. 24(3H, s), 1. 02 (3H, d, J = 6. 5Hz), 0. 92 (3H, d, J = 6. 8Hz), 0. 84 (3H, d, J = 8. 4Hz), 0. 82 (3H, d, J = 8. 4Hz)，0· 64 (3H, s) · 13C-NMR (100MHz, CDC13) δ c: 33. 9 (C-l)，33. 2 (C-2)，198. 5 (C-3)，114. 7 (C-4), 173. 8(C-5), 162. 4(C-6), 113. 3(C-7), 159. 5 (C-8), 47. 2 (C-9), 40. 3 (C-10), 22. 6 (C -11)，39. 2 (C-12)，45. 9 (C-13)，58. 1 (C-14)，25. 3 (C-15)，27. 7 (C-16)，56. 3 (C-17)，12. 4 (C -18)，19. 9 (C-19)，40. 3 (C-20)，21. 0 (C-21)，134. 7 (C-22)，132. 8 (C-23)，42. 8 (C-24)，33. 0 (C-25)，19. 6 (C-26)，19. 9 (C-27)，17. 6 (C-28)。
[0017] 實(shí)施例2體外抗補(bǔ)體經(jīng)典途徑試驗(yàn)
[0018] 取補(bǔ)體（豚鼠血清）0. 04ml，加入巴比妥緩沖液（BBS)配制成1:10的溶液，用BBS 對倍稀釋成 1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640 和 1:1280 的溶液；取 1:1000 溶血素、2% 羊紅細(xì)胞（SRBC)各0. lml及各濃度補(bǔ)體0. 2ml溶于0. 2ml BBS中，混勻，37°C水浴30min后 放入低溫高速離心機(jī)，在4000rpm、4°C條件下離心5min，分別取每管上清0. 2ml于96孔板， 在405nm測定其吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組（0. lml 2% SRBC、0. lml溶血素溶于0. 4ml 三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率，以補(bǔ)體稀釋度為X軸，溶 血百分率為Y軸作圖，選擇達(dá)到相似高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正常溶血所 需的臨界補(bǔ)體濃度，取臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按上述方法于405nm下測定吸光度； 實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對照組、補(bǔ)體組和全溶血組；將供試品吸光度值扣除相應(yīng)供試品對照 組吸光度值后計(jì)算溶血率，以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作圖，計(jì)算50% 抑制溶血所需供試品的濃度（CH 5。），結(jié)果為0. 033±0. 006mg/ml，陽性對照肝素 CH5。值為 0. 026±0. 005mg/ml。
[0019] 實(shí)施例3體外抗補(bǔ)體旁路途徑試驗(yàn)
[0020] 取補(bǔ)體（人血清）0.2ml，加入AP稀釋液（巴比妥緩沖液，pH = 7.4,含5mM Mg2+，8mM EGTA)配制成 1:5 的溶液，并對倍稀釋成 1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320 和 1:640的溶液；取各濃度補(bǔ)體0. 15ml、AP稀釋液0. 15ml及0. 5 %兔紅細(xì)胞（RE)0. 20ml，混 勾，37°C水浴30min后置于低溫高速離心機(jī)，在4000rpm、4°C條件下離心5min。分別取每管 上清0. 2ml于96孔板，在405nm測定吸光度；實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置全溶血組（0. 20ml 0. 5 % RE溶 于0. 3ml三蒸水），以三蒸水溶血管的吸光度作為全溶血標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算溶血率，以補(bǔ)體稀釋度 為X軸，溶血百分率為Y軸作圖，選擇達(dá)到相似高溶血率的最低補(bǔ)體濃度作為確保體系能正 常溶血所需的臨界補(bǔ)體濃度，取確定的臨界濃度的補(bǔ)體與供試品混勻，按上述方法于405nm 下測定其吸光度，實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置供試品對照組、補(bǔ)體組和全溶血組。將供試品吸光度值扣除 相應(yīng)供試品對照組吸光度值后計(jì)算溶血率，以供試品濃度作為X軸，溶血抑制率作為Y軸作 圖，計(jì)算50%抑制溶血所需供試品的濃度（APJ，結(jié)果為0. 072±0. 012mg/ml，陽性對照肝 素 AP5。值為 0· 054±0· 016mg/ml。
[0021 ] 本發(fā)明中實(shí)驗(yàn)采用的試劑均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 結(jié)構(gòu)如下式的醬醇內(nèi)醋Fortisterol在制備抗補(bǔ)體藥物中的用途，2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的醬醇內(nèi)醋化Kisterol通過下述方法 制備： 取藥材馬勃子實(shí)體，粉碎，用95%乙醇回流提取3次，每次化，合并提取液并濃縮得 浸膏，加水混懸，分別W等體積石油酸、乙酸乙醋和正下醇萃取5次，合并萃取液并濃縮 至干，得乙酸乙醋萃取物；將乙酸乙醋萃取部位經(jīng)硅膠200-300目柱色譜分離，依次W二 氯甲燒-甲醇50:1-0:1梯度洗脫，得到10個(gè)流份（化.1-10)，其中流份化.7再經(jīng)硅膠 柱色譜其中，二氯甲燒-甲醇，30:1，20:1，10:1,5:1,3:1、S巧hadex LH-20柱色譜其中氯 仿-甲醇，1:1和反相HPLC其中甲醇-水，20:80-80:20,梯度洗脫、純化，分離得到化合物 FortisterolD3. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的醬醇內(nèi)醋化Kisterol對補(bǔ)體系統(tǒng)的 經(jīng)典途徑有補(bǔ)體抑制作用。4. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的醬醇內(nèi)醋化Kisterol對補(bǔ)體系統(tǒng)的 旁路途徑激活有補(bǔ)體抑制作用。
【文檔編號】C07J73/00GK105985403SQ201510052358
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月1日
【發(fā)明人】陳道峰, 范明松
【申請人】復(fù)旦大學(xué)