顯著差異性。事實上，對于金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的PGN，產(chǎn)生等于最大反應的50%的反應(EC50)的濃度為約20ng/mL，對于藤黃微球菌的為1500ng/mL，并且對于那些從酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌和大腸桿菌K12提取的為大于2000ng/mL。
[0105]然而，這些差異在意料之中，因為PGN根據(jù)其細胞來源具有不同結構，這導致炎癥反應性具有顯著差異。這些觀察強調(diào)了確定內(nèi)標以能夠按PGN的當量單位來表示結果的重要性。
[0106]可能改變HEK-TLR2細胞的反應的另一種因素是PGN的大小，這會影響其溶解性和對TLR2的反應性。因此，這些高分子的純化程序可對這些細胞的反應具有顯著影響，因為提取條件可改變PGN的大小，或甚至引起部分降解。為測試這種假設，以3個單獨批次的從金黃色葡萄球菌提取的PGN來再現(xiàn)這些測定:2個西格瑪批次(目錄號77140:批次1，0001442777 ;批次 2，BCBH7886V)和 I 個英瓦沃珍批次(編號 tlrl-pgnsa)。
[0107]結果顯示三個批次之間的反應性的差異性(圖4)。事實上，這三個批次的EC50值分別為4ng/mL、20ng/mL和400ng/mL。這些數(shù)據(jù)指示，存在即使這些批次是從同一供應商獲得并且通過相同程序預先提取，從相同細菌物種提取的PGN顯示反應性差異的風險。因此，似乎需要引入用于校正曲線的內(nèi)標，以避免與PGN差異性相關的誤差并將結果表示為“活性” PGN的量。
[0108]PAM3Cys-Ser- (Lys) 4三鹽酸鹽(PAM3 (cys);圖5)是一種三酰基化合成脂肽，其模擬細菌脂肽的結構并用作TLR2的強激動劑。由于具有均質結構，其常用作用于校正表達TLR2受體的細胞的反應的陽性對照。
[0109]因此，在本發(fā)明測試中用PAM3(cys)替代PGN來再現(xiàn)這些實驗。如所預期，HEK-TLR2細胞顯示關于這種化合物的強反應性。此外，劑量-反應曲線的形狀類似于在PGN存在下獲得的曲線，且估計EC50為10ng/mL (圖6)。這些結果指示，PAM3 (cys)誘導相當于最高反應性PGN的反應，但與后者相反，其不展示結構差異性。因此，這種合成脂肽可用于校正PGN的各批次并用于建立標準化校正曲線，其將容許以“活性’TGN的量，即以產(chǎn)生與用等量PAM3 (cys)所獲得的TLR2反應相同的TLR2反應的PGN的量使結果公式化。
[0110]通過以下方式相對于PAM3 (cys)校正每一批次的PGN，比較每一劑量-反應曲線的線性部分的斜率，并計算校正因子用于在PAM3 (cys)曲線上重疊PGN曲線。在圖6中所呈現(xiàn)的實例中，估計批次1、2和3的校正因子分別為0.4、2和40。這意味著獲得與PAM3(cys)所誘導反應相同的反應需要的批次I的PGN少2.5倍，但需要的批次2的PGN多2倍并且需要的批次3的PGN多40倍。在校正PGN的原始量之后，可見到所有點都在一個相同曲線上對準，其可在用PAM3(cys)獲得的曲線上重疊(圖7)。因此，使用該內(nèi)標使得可能獲得所有批次的PGN的經(jīng)校正濃度，并建立針對活性PGN校正的劑量-反應曲線。
[0111]通過應用這種方法，HEK-TLR2細胞反應的標準曲線在介于0.5ng/mL與200ng/mL之間的活性PGN濃度下(圖8)或在介于13ng/g與5400ng/g之間的葡萄糖聚合物下具有一個線性區(qū)域。
【主權項】
1.一種測定葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的方法，該方法包含: a)通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該葡萄糖聚合物樣品； b)使處理后的樣品或其稀釋物與重組細胞接觸，該重組細胞表達外源TLR2受體(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2受體相關的信號傳導路徑的報道基因，所述報道基因編碼有色或熒光蛋白質或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質； c)測量該報道基因信號；和 d)使用PGN的量與該報道基因信號的強度之間的對應性的校正曲線來確定該樣品中的PGN的量。2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該樣品使得可能破碎并分解該樣品中所含的PGN，具體地以使得其能活化該TLR2受體。3.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于處理該樣品使得可能生成主要具有約120kDa 大小的 PGN。4.根據(jù)權利要求1到3中任一項所述的方法，其特征在于該報道基因是分泌的堿性磷酸酶。5.根據(jù)權利要求1到4中任一項所述的方法，其特征在于該細胞是HEK-Blue?hTLR2細胞系的細胞。6.根據(jù)權利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校正曲線是用源自選自以下的細菌的PGN來制備:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)和酸熱脂環(huán)酸芽抱桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，優(yōu)選地金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。7.根據(jù)權利要求1到6中任一項所述的方法，其特征在于該方法包含使用源自選自以下的細菌的PGN制備該校正曲線的預備步驟:金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草桿菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。8.根據(jù)權利要求6或7所述的方法，其特征在于PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校正曲線是用內(nèi)標標準化或校正，該內(nèi)標是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser- (Lys) 4 三鹽酸鹽。9.根據(jù)權利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校正曲線是用內(nèi)標來制備，該內(nèi)標是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地 PAM3Cys-Ser- (Lys) 4 三鹽酸鹽。10.根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于該方法包含使用內(nèi)標制備校正曲線的預備步驟，該內(nèi)標是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser- (Lys) 4三鹽酸鹽。11.根據(jù)權利要求1到10中任一項所述的方法，其特征在于如果需要，稀釋該樣品，以生成對應于該校正曲線的線性部分的報道基因信號。12.根據(jù)權利要求1到11中任一項所述的方法，其特征在于該樣品是艾考糊精溶液的樣品。13.—種用于測定葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的試劑盒，該試劑盒包含: -重組細胞，其表達外源TLR2受體(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2受體相關的信號傳導路徑的報道基因，所述報道基因編碼有色或熒光蛋白質或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質；和 -PGN的量與該報道基因信號強度之間的對應性的校正曲線；SPGN標準品，優(yōu)選地源自選自以下的細菌:金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草桿菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌，優(yōu)選地源自金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌；或內(nèi)標，該內(nèi)標為TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser- (Lys) 4三鹽酸鹽； -任選地使用說明，和用于預處理該樣品的溶液。14.根據(jù)權利要求13所述的試劑盒，該試劑盒還包含內(nèi)標，該內(nèi)標是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser- (Lys) 4三鹽酸鹽。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于測定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的生物學方法。該PGN測定包括：a)通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該葡萄糖聚合物樣品；b)使處理后的樣品或其稀釋物與重組細胞接觸，該重組細胞表達外源TLR2(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2相關的信號傳導路徑的報道基因。該報道基因編碼有色或熒光蛋白質或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質；c)測量該報道基因信號；和d)使用PGN的量與該報道基因信號強度之間的關聯(lián)性的標準曲線來確定該樣品中PGN的量。
【IPC分類】G01N33/50
【公開號】CN105122059
【申請?zhí)枴緾N201480018300
【發(fā)明人】皮埃爾·拉諾, 馬克·比蓋特, 羅塞利納·伯納德, 法布里斯·阿蘭, 馬蒂厄·卡龐捷, 安納斯·丹伊斯, 赫拉·海新納-伽爾比
【申請人】羅蓋特兄弟公司
【公開日】2015年12月2日
【申請日】2014年3月25日
【公告號】CA2904965A1, WO2014154651A1