優(yōu)選地合成脂肽，具體地PAM3CyS-Ser-(LyS)4三鹽酸鹽(Pam3 (cys)，PAM或Pam表示棕櫚酸)(見圖5)。因此，優(yōu)選地用內(nèi)標(biāo)對PGN的量與該報(bào)道基因信號強(qiáng)度之間的對應(yīng)性的校正曲線進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或校正，該內(nèi)標(biāo)是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser-(Lys) 4三鹽酸鹽。這種內(nèi)標(biāo)優(yōu)選地是合成的或具有明確限定的結(jié)構(gòu)/組成。該校正或標(biāo)準(zhǔn)化是通過以下方式來實(shí)施:比較每個(gè)劑量-反應(yīng)曲線的線性部分的斜率并計(jì)算校正因子，容許用校正標(biāo)準(zhǔn)品獲得的曲線與PGN標(biāo)準(zhǔn)品的曲線重疊。
[0064]例如，該校正曲線可使用0.001ng/mL到1000ng/mL、特別地0.01ng/mL到10ng/mL的PGN濃度獲得。
[0065]這個(gè)校正曲線可僅用PGN獲得，或用已向其添加確定量的PGN的葡萄糖聚合物溶液獲得。應(yīng)注意，所用葡萄糖聚合物溶液可包含3.75% (重量/體積)，優(yōu)選地3%的葡萄糖聚合物。
[0066]PGN的量與報(bào)道基因信號強(qiáng)度之間的對應(yīng)性的這個(gè)曲線還可用內(nèi)標(biāo)(該內(nèi)標(biāo)是TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser-(Lys)4三鹽酸鹽)獲得，特別地用相同細(xì)胞，在相同條件下，以遞增劑量的TLR2激動劑內(nèi)標(biāo)來獲得。這種內(nèi)標(biāo)優(yōu)選地是合成的或具有明確限定的結(jié)構(gòu)/組成。正如對于PGN —般，其可在葡萄糖聚合物不存在下，或優(yōu)選地在葡萄糖聚合物存在下獲得。
[0067]通常，該校正曲線是經(jīng)典的S型細(xì)胞反應(yīng)曲線(圖1)。
[0068]-部分(A)對應(yīng)于以低PGN濃度獲得的反應(yīng)，低于這些濃度給出TLR2的有效活化。因此，這個(gè)非線性區(qū)域?qū)?yīng)于該方法的檢測限。為了包括該方法的差異性，將這個(gè)檢測閾值估計(jì)為背景噪聲值(在不存在刺激時(shí)獲得的反應(yīng))的三倍；
[0069]-部分(B)由于觀察到線性反應(yīng)而最令人關(guān)注。這個(gè)具有有效反應(yīng)的區(qū)域使得可能測定細(xì)胞反應(yīng)與PGN水平之間的直接關(guān)系。因此，這是測定區(qū)域；
[0070]-部分(C)對應(yīng)于在過高濃度的PGN存在下細(xì)胞反應(yīng)的飽和。事實(shí)上，存在TLR2受體的飽和。
[0071]考慮該校正曲線的線性部分；這個(gè)部分對應(yīng)于一個(gè)區(qū)域(部分B)，其中PGN的量與報(bào)道基因信號成正比。
[0072]在樣品可能被PGN嚴(yán)重污染的情形中，將需要執(zhí)行若干次連續(xù)稀釋以仍舊定位于線性區(qū)域中。另外，如果希望提高測定的靈敏度，那么低濃度的PGN需要一個(gè)濃縮樣品的步驟。
[0073]任選地，該方法還包含使用對照細(xì)胞的測定，該對照細(xì)胞不表達(dá)TLR2，更一般地不表達(dá)先天免疫受體。例如，可使用HEK-Blue? Null2細(xì)胞系。這是一種對照系，其使用可用于驗(yàn)證，葡萄糖聚合物樣品不會通過固有機(jī)制誘導(dǎo)酶的產(chǎn)生。
[0074]本發(fā)明還涉及一種測定葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的試劑盒，所述試劑盒包含:
[0075]-重組細(xì)胞，其表達(dá)外源TLR2受體(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2受體相關(guān)的信號傳導(dǎo)路徑的報(bào)道基因，所述報(bào)道基因編碼有色或熒光蛋白質(zhì)或編碼其活性可用或不用底物來測量的蛋白質(zhì)。應(yīng)注意，該細(xì)胞優(yōu)選地是HEK-Blue? hTLR2細(xì)胞系。作為陰性對照，該試劑盒還可包含不表達(dá)先天免疫受體的細(xì)胞，例如HEK-Blue? Null2細(xì)胞系。
[0076]-PGN的量與報(bào)道基因信號強(qiáng)度之間的對應(yīng)性的校正曲線；或經(jīng)校正的PGN標(biāo)準(zhǔn)品，其優(yōu)選地源自選自以下的細(xì)菌:金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、大腸桿菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌，優(yōu)選地金黃色葡萄球菌；或內(nèi)標(biāo)，其為TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地PAM3Cys-Ser-(Lys) 4三鹽酸鹽。任選地，該試劑盒可包含二者，即校正曲線以及源自與用于制備這個(gè)校正曲線的微生物相同的微生物的經(jīng)校正的PGN標(biāo)準(zhǔn)品。
[0077]-任選地使用說明，用于預(yù)處理該樣品的溶液、用于測量報(bào)道基因的反應(yīng)的試劑、微孔板等。
[0078]優(yōu)選地，該試劑盒還包含內(nèi)標(biāo)，其為TLR2激動劑，優(yōu)選地脂肽，具體地 PAM3Cys-Ser- (Lys) 4 三鹽酸鹽。
【附圖說明】
[0079]圖1:細(xì)胞反應(yīng)隨PGN的濃度遞增而變的理論曲線。
[0080]圖2:用HEK-Blue?-hTLR2細(xì)胞獲得的細(xì)胞反應(yīng)隨金黃色葡萄球菌的PGN水平而變的校正曲線。
[0081]圖3:隨來自不同細(xì)菌物種的PGN的濃度遞增而變的HEK-Blue?-hTLR2細(xì)胞的反應(yīng)。
[0082]圖4:隨從不同批次獲得的金黃色葡萄球菌的PGN的濃度遞增而變的HEK-Blue?-hTLR2 細(xì)胞的反應(yīng)。
[0083]圖5 =PAM3Cys-Ser- (Lys) 4 三鹽酸鹽(PAM3 (cys))的結(jié)構(gòu)。
[0084]圖6:在HEK-Blue?_hTLR2細(xì)胞中由金黃色葡萄球菌的PGN和PAM3 (cys)誘導(dǎo)的反應(yīng)的比較。
[0085]圖7:隨經(jīng)校正PGN濃度而變的HEK-Blue?_hTLR2細(xì)胞的反應(yīng)。
[0086]圖8:HEK-Blue?-hTLR2細(xì)胞的反應(yīng)隨經(jīng)校正活性PGN濃度而變的校正曲線。
[0087]實(shí)例
[0088]該測定是基于表達(dá)TLR2受體的細(xì)胞系對PGN的特異性識別以及基于可通過與TLR2相關(guān)的信號傳導(dǎo)路徑的活化來測量的酶活性的產(chǎn)生。
[0089]細(xì)胞物質(zhì)
[0090]對于涉及這種測定法的實(shí)驗(yàn)，使用兩個(gè)系:
[0091]-HEK-Blue? hTLR2細(xì)胞系(HEK-TLR2):針對TLR2配體的特異性反應(yīng)，對于可溶PGN具有強(qiáng)反應(yīng)性。
[0092]-HEK-Blue? Null2細(xì)胞系(HEK-Null):與樣品的細(xì)胞毒性效應(yīng)相關(guān)的非特異性反應(yīng)。
[0093]這些細(xì)胞是根據(jù)供應(yīng)商的建議(英瓦沃珍)來培養(yǎng)。在75%融合時(shí)，將這些細(xì)胞以0.28xl06個(gè)細(xì)胞/mL的密度再懸浮。在刺激前，將180 μ L細(xì)胞懸浮液分配于培養(yǎng)孔中(96孔板)，或以50000個(gè)細(xì)胞/孔分配。然后通過以37.5% (重量/體積)(S卩，這些樣品的最終稀釋度為3.75% )添加20 μ L葡萄糖聚合物樣品將這些細(xì)胞刺激24h。在刺激24h后，通過量化所產(chǎn)生的酶活性來測量細(xì)胞反應(yīng)。
[0094]1-劑量-反應(yīng)曲線的建立
[0095]通過將不同量的金黃色葡萄球菌PGN標(biāo)準(zhǔn)品(圖2)稀釋于以37.5% (重量/體積)制備的未污染的艾考糊精溶液中(圖2)來構(gòu)建劑量-反應(yīng)曲線。
[0096]結(jié)果是經(jīng)典的S型細(xì)胞反應(yīng)曲線。
[0097]-部分(A)對應(yīng)于以低PGN濃度獲得的反應(yīng)，低于給出TLR2的有效活化的那些。因此，這個(gè)非線性區(qū)域?qū)?yīng)于該方法的檢測限。
[0098]-部分(B)由于觀察到線性反應(yīng)而最令人關(guān)注。這個(gè)有效反應(yīng)區(qū)域使得可能測定細(xì)胞反應(yīng)與PGN水平之間的直接關(guān)系。因此，這是測定區(qū)域。
[0099]-部分(C)對應(yīng)于在過高濃度的PGN存在下細(xì)胞反應(yīng)的飽和。事實(shí)上，存在TLR2受體的飽和。
[0100]HEK-TLR2細(xì)胞對金黃色葡萄球菌PGN的反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線在介于0.07ng/mL與10ng/mL之間(即介于2ng/g與267ng/g之間的艾考糊精)的濃度下具有一個(gè)線性區(qū)域。
[0101]2-使用內(nèi)標(biāo)的用于PGN的生物學(xué)測定的校正曲線的建立
[0102]通過將不同細(xì)菌物種的PGN稀釋于以37.5% (重量/體積)制備的未被污染的麥芽糖糊精的溶液中(參照P-11.11)來構(gòu)建劑量-反應(yīng)曲線。所測定的PGN是從金黃色葡萄球菌(西格瑪(Sigma)，目錄號77140)、藤黃微球菌(西格瑪，目錄號53243)、枯草桿菌(英瓦沃珍，編號tlrl-pgnb2)和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(個(gè)人制劑)提取。
[0103]所獲得的曲線是在測定中觀察到的反應(yīng)的經(jīng)典曲線，所述測定是用細(xì)胞物質(zhì)來執(zhí)行(生物測定)(圖3)。低于0.2的吸光度值是PGN濃度過低而無法誘導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的證據(jù)，而高于2的值顯示與TLR2受體飽和相關(guān)的平臺效應(yīng)。因此，僅介于這兩個(gè)吸光度極限值之間的區(qū)域容許將SEAP的產(chǎn)生與樣品中存在的PGN的量相關(guān)聯(lián)。
[0104]所觀察到的這些反應(yīng)顯示與每種類型的PGN相關(guān)的細(xì)胞反應(yīng)性的