肽聚糖的生物學(xué)測(cè)定的制作方法
【專利說明】肽聚糖的生物學(xué)測(cè)定發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種樣品、具體地葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖的測(cè)定。
[0002]發(fā)明背景
[0003]無菌性炎癥性發(fā)病是在使用用于治療性目的(例如:腹膜透析，腸外營養(yǎng)，通過靜脈途徑注射)的制品治療期間觀察到的主要并發(fā)癥。盡管這些炎癥性發(fā)病中的一些與化學(xué)性質(zhì)問題相關(guān)(化學(xué)污染物的意外存在或某些化合物的不適當(dāng)劑量)，但大多數(shù)病例是由于在制造工藝期間釋放的微生物來源的污染物的存在所致?，F(xiàn)已明確確認(rèn)，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是主要污染物，在其以痕量水平存在于制品中時(shí)，其呈現(xiàn)觸發(fā)所述炎癥性發(fā)病的高風(fēng)險(xiǎn)。
[0004]許多質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室以常規(guī)方式使用LAL(鱟(Limulus)阿米巴樣細(xì)胞溶解物)測(cè)定來檢測(cè)并測(cè)定LPS污染。這種測(cè)定是基于通過從鱟(Limulus))鱟(horseshoe crab))血淋巴提取的感測(cè)復(fù)合物對(duì)內(nèi)毒素的識(shí)別。
[0005]目前提出同樣基于無脊椎動(dòng)物血淋巴的提取物的反應(yīng)性的其他測(cè)定用于檢測(cè)用于治療性應(yīng)用的產(chǎn)品中的PGN(SLP-Wako，易默奈公司(Immunetics))。然而，這些測(cè)定具有并非極具特異性的缺點(diǎn)，因?yàn)槠湟才c其他微生物來源的分子(例如β-葡聚糖)反應(yīng)。此夕卜，這些方法需要購買用于這個(gè)用途的特殊設(shè)備，一般會(huì)增加成本并因此限制這些測(cè)定技術(shù)的獲得。
[0006]此外，LPS和PGN具有根據(jù)其細(xì)菌來源可變的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)性出現(xiàn)巨大差異。這就是為什么另外需要以標(biāo)準(zhǔn)分子的當(dāng)量單位表達(dá)這些測(cè)定的結(jié)果的原因(例如，該LAL測(cè)定中大腸桿菌(E.coli)的LPS)。
[0007]此外，這些分子最常以大分子復(fù)合物形式存在，這會(huì)影響其溶解性以及其炎癥潛能。例如，PGN的大小高度可變并且經(jīng)常與細(xì)胞壁中的其他分子(例如脂磷壁酸和脂肽)聚集。
[0008]因此，已研發(fā)出只考慮與這些分子相關(guān)的炎癥負(fù)荷的“生物學(xué)”方法。炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞具有用于識(shí)別感染源特異性產(chǎn)生的分子結(jié)構(gòu)的特定感測(cè)器。這些稱為PAMP (病原體相關(guān)分子模式分子)的分子基本上由TLR(Toll樣受體)和NLR(Nod樣受體)識(shí)別，所述受體的特異性與不同種類的炎癥分子的分子結(jié)構(gòu)相關(guān)。與LPS(其為由TLR4型受體識(shí)別的配體)相反，PGN是由TLR2型受體識(shí)別的配體。
[0009]近年來，已研發(fā)出活體外細(xì)胞測(cè)定來替代炎癥反應(yīng)的動(dòng)物模型。這些測(cè)定大多是基于在被污染產(chǎn)品的存在下培育單核細(xì)胞以及基于炎癥性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1 β、IL-6、IL-8, RANTES)的產(chǎn)生的反向滴定。然而，使用從血液分離的原代細(xì)胞的測(cè)定經(jīng)受供體的顯著個(gè)體間差異性，此可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)偏差。
[0010]與此相比，單核細(xì)胞細(xì)胞系給出恒定反應(yīng)，這解釋了為什么其一般偏好原代細(xì)胞。然而，這些細(xì)胞系也并非完全令人滿意。例如，細(xì)胞因子的選擇經(jīng)常被批評(píng)，因?yàn)榇蠖鄶?shù)細(xì)胞因子是瞬時(shí)表達(dá)并且其在培養(yǎng)基中的濃度并非始終反映炎癥分子的真實(shí)負(fù)荷。由于所有這些單核細(xì)胞都表達(dá)大部分的TLR/NLR，所以基于其使用的測(cè)定對(duì)一種類型的污染物無選擇性，但將給出一個(gè)總體炎癥反應(yīng)。
[0011]此外，由于這些細(xì)胞對(duì)不同炎癥分子的敏感性差異而產(chǎn)生嚴(yán)重問題。因此，TLR2配體PGN的反應(yīng)性遠(yuǎn)小于LPS，從而使得通過這些方法難以對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。事實(shí)上，LPS在ng/mL級(jí)的濃度下誘導(dǎo)顯著反應(yīng)，而獲得類似反應(yīng)需要的PGN濃度要高100倍(w/w比率)。
[0012]數(shù)年中，已提出在用于對(duì)炎癥性化合物的反應(yīng)性進(jìn)行檢測(cè)和量化的生物學(xué)測(cè)定中用經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞系替代上述模型。通過編碼一類炎癥性激動(dòng)劑的特異性受體的基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染這些非炎癥性細(xì)胞系(例如:HEK-293)。其還含有用于編碼酶(例如，熒光素酶或堿性磷酸酶)的報(bào)道基因的表達(dá)載體，該酶的合成依賴于炎癥性受體的活化。因此，通過表達(dá)適當(dāng)受體的細(xì)胞識(shí)別污染物將觸發(fā)該酶的合成，其產(chǎn)生之后將會(huì)使其底物轉(zhuǎn)變?yōu)橛猩虬l(fā)光產(chǎn)物。由于這種產(chǎn)物易于量化，這種方法容許快速測(cè)定與一種類型的污染物相關(guān)的炎癥反應(yīng)。
[0013]這些細(xì)胞模型具有多種優(yōu)點(diǎn):用酶測(cè)定替代細(xì)胞因子的ELISA測(cè)定，由于這些細(xì)胞系的穩(wěn)定特征而使這些測(cè)定具有顯著再現(xiàn)性，隨所表達(dá)受體而變地靶向某些種類的炎癥分子，以極低閾值檢測(cè)污染物。
[0014]因此，這些細(xì)胞模型可替代活體外細(xì)胞因子反應(yīng)測(cè)定，因?yàn)槠涫沟每赡芴禺愋园邢蜃鳛榻o定TLR或NLR的激動(dòng)劑的炎癥因子，并量化與這種激動(dòng)劑相關(guān)的炎癥反應(yīng)。例如，特異性表達(dá)TLR2和TLR4的細(xì)胞已用于檢測(cè)食品中的污染物(英國萊斯特大學(xué)心血管科學(xué)系(Department of Card1vascular Sciences of Leicester University-UK)的柯萊特艾瑞德(Clett Erridge)的著作英國營養(yǎng)雜志(British Journal of Nutrit1n)，第 105卷/第01期/2011年I月，第15-23頁)。
[0015]此外，諸如英瓦沃珍(InvivoGen)等公司現(xiàn)在銷售HEK-293細(xì)胞系(HEK-Blue?)的眾多種經(jīng)不同TLR或NRL受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。這些細(xì)胞含有編碼堿性磷酸酶的分泌形式(SEAP:分泌的胚胎堿性磷酸酶)的基因作為報(bào)道基因，其容許對(duì)炎癥性激動(dòng)劑的反應(yīng)進(jìn)行快速并且簡單的比色測(cè)定。
[0016]這些HEK-Blue?細(xì)胞已成功地用于檢測(cè)葡萄糖聚合物濃縮溶液中的污染物的存在和其協(xié)同效應(yīng)(W02012/143647)。由于本申請(qǐng)案中陳述的目標(biāo)只是檢測(cè)呈展示炎癥性活性的形式的污染物，所以本專利申請(qǐng)案中描述的方法不適合于測(cè)量樣品中所含PGN的總量。事實(shí)上，可溶PGN(MM?120kDa)是那些通過TLR2受體誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)者。因此，本申請(qǐng)案中所述方法不檢測(cè)對(duì)于具有炎癥性或與其他分子聚集不具有適宜大小的PGN。
[0017]因此，業(yè)內(nèi)仍需要研發(fā)測(cè)定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的總PGN的替代性方法。
[0018]發(fā)明概述
[0019]因此，本發(fā)明涉及一種測(cè)定樣品、特別是葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖的生物學(xué)方法。
[0020]具體地，本發(fā)明涉及一種測(cè)定葡萄糖聚合物樣品中的肽聚糖(PGN)的方法，其包含:
[0021]a)通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該葡萄糖聚合物樣品；
[0022]b)使處理后的樣品或其稀釋物與重組細(xì)胞接觸，該重組細(xì)胞表達(dá)外源TLR2受體(Toll樣受體2)和直接依賴與該TLR2受體相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)路徑的報(bào)道基因，所述報(bào)道基因編碼有色或熒光蛋白質(zhì)或編碼其活性可用或不用底物來測(cè)量的蛋白質(zhì)；
[0023]c)測(cè)量該報(bào)道基因信號(hào)；和
[0024]d)使用PGN的量與該報(bào)道基因信號(hào)的強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)性的校正曲線來確定該樣品中的PGN的量。
[0025]優(yōu)選地，通過聲處理、加熱和/或堿性化處理該樣品使得可能破碎并分解該樣品中所含PGN，具體地以使得其能活化該TLR2受體。具體地，該樣品的處理使得可能生成主要具有約120kDa大小的PGN。
[0026]優(yōu)選地，該報(bào)道基因是分泌堿性磷酸酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，該細(xì)胞是HEK-Blue? hTLR2細(xì)胞系的細(xì)胞。
[0027]優(yōu)選地，PGN的量與該報(bào)道基因信號(hào)強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)性的校正曲線是用源自選自以下的細(xì)菌的PGN來制備:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、藤黃微球菌(Micrococcus Iuteus)、枯草桿菌(Bacillus subtil is)和酸熱脂環(huán)酸芽抱桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，優(yōu)選地源自金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。具體地，該方法可包含使用源自選自以下的細(xì)菌的PGN制備該校正曲線的預(yù)備步驟:金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、枯草桿菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌，優(yōu)選地源自金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌和酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌。
[0028]優(yōu)選地，如果需要，稀釋該樣品，以生成對(duì)應(yīng)于該校正曲線的線性部分的報(bào)道基因信號(hào)。
[0029]優(yōu)選地，該樣品是艾考糊精(icodextrin)溶液樣品。
[0030]優(yōu)選地，用內(nèi)標(biāo)對(duì)PGN的量與該報(bào)道基因信號(hào)強(qiáng)度之間的對(duì)應(yīng)性的校