構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于NPCO/CO304-AU/RUSi@RU(bpy)32+構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法及應(yīng)用。具體涉及一種RuS1Ru (bpy) 32+作為發(fā)光材料，納米復(fù)合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+作為捕獲抗體基底的電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備與應(yīng)用，屬于電致化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]真菌毒素是廣泛存在于自然界的農(nóng)產(chǎn)品污染物，真菌毒素具有強(qiáng)烈的腎臟毒性，肝臟毒性和神經(jīng)毒性，并且有致畸、致癌和致突變作用。真菌毒素的存在對(duì)人類和動(dòng)物健康以及畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成了巨大的威脅。激素是由人和動(dòng)物某些細(xì)胞合成和分泌、能調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)的特殊物質(zhì)，和神經(jīng)系統(tǒng)一起調(diào)節(jié)人體的代謝和生理功能。正常情況下各種激素是保持平衡的，如因某種原因使這種平衡打破了這就造成內(nèi)分泌失調(diào)，會(huì)引起相應(yīng)的臨床表現(xiàn)。因此，可利用測(cè)定真菌毒素和激素的含量來(lái)判斷農(nóng)產(chǎn)品污染狀況及疾病診斷。
[0003]目前真菌毒素和激素的檢測(cè)方法主要是色譜分析和免疫分析法，例如薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法。雖然色譜分析靈敏度很高，但是色譜分析需要繁瑣的樣品預(yù)處理、預(yù)富集、儀器操作步驟復(fù)雜等缺點(diǎn)。為了克服以上色譜分析方法的缺點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度和選擇性高的電致化學(xué)發(fā)光免疫分析方法。
[0004]本發(fā)明利用RuS1Ru (bpy) 32+為電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)源，RuS1Ru (bpy) 32+通過共價(jià)鍵固載在NPCo/Co304-Au表面制得抗體捕獲基底，利用NPCo/Co304-Au優(yōu)良的生物兼容性和大的比表面積將抗體固載在納米復(fù)合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+表面。在本發(fā)明中制備的電致化學(xué)發(fā)光傳感器具有操作簡(jiǎn)單，成本低，靈敏度高，特異性高等優(yōu)點(diǎn)，克服了傳統(tǒng)色譜分析的很多不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的真菌毒素和激素檢測(cè)方法存在的問題，提供一種簡(jiǎn)單快速可靠的基于NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+構(gòu)建的電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法和應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)真菌毒素和激素的靈敏、特異、快速、高效檢測(cè)。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
1.一種基于NPCO/CO304-AU/RUSi@RU(bpy)32+構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6 μ L、0.5-2 mg ml/1 的待測(cè)物抗體孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~3%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用PH6.4-8.4的PBS溶液沖洗電極表面，4°C晾干，制得一種基于NPCo/Co304-Au/RuSiiRu (bpy) 32+構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器。
[0007]2.待測(cè)物抗體孵化物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)327Ab溶液的制備
(1)NPCo/Co304-Au 的制備
將CoAl合金置入過量的0.5?1.5 mo I/L的氫氧化鈉溶液中，在室溫下腐蝕32?74h，離心洗滌至中性，在室溫下干燥12?48 h，制得納米多孔Co/Co304納米材料，即NPCo/Co3O4;
將80?120 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005?0.015%的氯金酸溶液煮沸，加入2?3 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5?1.5%的檸檬酸三鈉水溶液，加熱回流10?20 min，溶液顏色變成酒紅色，將溶液冷卻至室溫，得到金納米粒子，4°C下避光保存；
將I?3 mg的NPCo/Co304分散到I mL超純水中，加入0.5?L 5 mL金納米粒子，得到的混合溶液在室溫下振蕩12?32 h，離心分離，除去過量的金納米粒子，制得NPCo/Co3O4-Au,將NPCo/Co304-Au重新分散到I mL超純水中，制得NPCo/Co304_Au溶液；
(2)RuSiiRu(bpy)32+的制備
將 330 ?350 yL、35 ?45 mmol/L Ru (bpy) 32+和 1.77 mL 聚乙二醇辛基苯基醚、7.5mL環(huán)己烷以及1.8 mL正己醇共混，混合液磁力攪拌25?35min，形成油包水微乳液，加入100 y L四乙基原硅酸鈉和60 μ L氨水，攪拌24 h，加入丙酮破壞微乳劑，離心并用乙醇和超純水洗滌，得到橙色的RuSi NPs ;加入體積分?jǐn)?shù)為10%的氨丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，攪拌2 h，得到氨基化的RuSi NPs,離心并重新分散到500 μ L、pH 6.4?8.4的PBS溶液中，加入9?11 μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的Ru (bpy) 32+和10 μ L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的羥基琥珀酰亞胺，磁力攪拌24 h，離心，用pH 6.4?8.4的PBS溶液洗滌所得的RuS1Ru (bpy) 32+，除去過量的Ru (bpy) 32+和羥基琥珀酰亞胺，并重新分散到500 μ L、pH 6.4?8.4PBS溶液中，制得 RuS1Ru (bpy) 32+溶液；
(3)納米復(fù)合物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+溶液的制備
將80?120 UL的RuS1Ru (bpy) 32+溶液加入到(I)制得的NPCo/Co 304_Au溶液中，室溫下振蕩12?32 h，離心，將得到的產(chǎn)物分散到pH6.4?8.4的PBS溶液中，制得納米復(fù)合物 NPCo/Co304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+溶液；
(4)待測(cè)物抗體孵化物NPCO/CO304-Au/RuSi@Ru(bpy)327Ab溶液的制備
在納米復(fù)合物 NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+溶液中，加入 10 ?100 μ L、1 mg/mL 的待測(cè)物抗體Ab溶液，在4°C下振蕩孵化24 h，離心除去過量的待測(cè)物抗體Ab，將產(chǎn)物分散到I mL、pH 7.4的PBS溶液中，制得待測(cè)物抗體孵化物NPCo/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液，儲(chǔ)存在4 °0下備用。
[0008]3.真菌毒素類和激素類待測(cè)物的檢測(cè)，檢測(cè)步驟如下:
(1)滴加6μ L待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液于所制備的電致化學(xué)發(fā)光傳感器表面，用pH 6.4-8.4的PBS溶液沖洗表面，放置在4°C的冰箱中孵化3~12 h，晾干；
(2)使用電化學(xué)工作站的三電極體系進(jìn)行測(cè)試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，所制備的電致化學(xué)發(fā)光傳感器為工作電極，將電化學(xué)工作站和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀連接在一起將光電倍增管的高壓設(shè)置為500 V，單介脈沖循環(huán)伏安法的脈沖電壓，脈沖時(shí)間，起始電壓和脈沖周期分別為-1.5 V、0.45 s、-0.95 V和7 s; (3)在10mL、pH 5.7-7.7的含25~45 mmol/L過硫酸鉀的PBS溶液中，通過電致化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，檢測(cè)對(duì)不同濃度的待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)強(qiáng)度，繪制工作曲線；
(4)將待測(cè)物樣品溶液代替待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)。
[0009]所述待測(cè)物為真菌毒素類或激素類；真菌毒素類選自下列之一:黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、雜色曲霉素、展青霉素；激素類選自下列之一:地塞米松、炔諾酮、19-去甲睪酮、玉米赤霉醇、群勃龍、醋酸甲羥孕酮、雌二醇。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(I)電致化學(xué)發(fā)光傳感器制備方法，以RuS1Ru (bpy) 32+為發(fā)光材料，利用RuS1Ru (bpy) 32+良好的光學(xué)性能，構(gòu)建的傳感器具有更高的靈敏度；
(2 ) RuSiiRu (bpy) 32+通過共價(jià)鍵與NPCo/Co 304_Au結(jié)合作為抗體捕獲基底，利用NPCo/Co304-Au優(yōu)良的生物兼容性和大的比表面積將抗體有效地固載在納米復(fù)合物NPCo/Co3O4-Au/ RuS1Ru (bpy) 32+表面；
(3)本發(fā)明制備的電致化學(xué)發(fā)光傳感器用于真菌毒素和激素的檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，響應(yīng)時(shí)間短，信號(hào)響應(yīng)范圍寬，可以實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單、快速、高靈敏和特異性檢測(cè)。
[0011]實(shí)施例1一種基于NPCo/Co 304-Au/RuSi@Ru(bpy)32+構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化鋁拋光粉拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6 μ L、0.5 mg ml/1 的待測(cè)物抗體孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用pH 6.4的PBS溶液沖洗電極表面，4°C晾干，制得一種基于NPCO/Co304-Au/RuSi@Ru (bpy) 32+的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器。
[0012]實(shí)施例2—種基于NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+構(gòu)建的真菌毒素類和激素類電致化學(xué)發(fā)光傳感器的制備方法
(1)將直徑4mm的玻碳電極依次用1.0 μπι、0.3 μπι、0.05 μπι氧化鋁拋光粉做拋光處理，乙醇超聲清洗，再用超純水沖洗干凈；
(2)滴涂6 μ L、I mg mL—1 的待測(cè)物抗體孵化物 NPCo/Co 304_Au/RuSi@Ru (bpy) 32+/Ab 溶液于電極表面，4°C保存至干燥；
(3)滴加4yL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的牛血清白蛋白溶液，以封閉電極表面的非特異性活性位點(diǎn)，用pH 7.4的PBS