液稀釋成1:2000比例，底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 mol/L的硫酸，濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0020]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板Xl塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液X6 瓶:(lmL/瓶)O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7μ g/kg、8.1 μ g/kg ；
(3)抗體工作液7 mL ；
(4)酶標(biāo)二抗工作液7 mL ；
(5)底物液A7 mL ；
(6)底物液B7 mL ；
(7)終止液7 mL ；
(8)10X濃縮稀釋液 40 mL; (9)10X濃縮洗滌液 40 mL;
本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)雞肉樣本中孕酮?dú)埩袅繒r(shí)，通過以下步驟實(shí)施:樣品預(yù)處理、用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行檢測(cè)、分析結(jié)果。
[0021](I)樣品預(yù)處理
a.準(zhǔn)確稱取2.0±0.02g勻漿樣品至50 mL離心管中；
b.先加入5mL乙酸乙酯,潤旋儀充分振蕩混勻1min；
c.5000 r/min 離心 10 min ；
d.取上清液ImL于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> e.加入ImL正己烷(脂肪含量高的樣品可加入2mL正己烷)，充分渦動(dòng)10 S，再加入I mL樣品稀釋液,低速潤動(dòng)10 s ；4000 r/min,離心5 min,完全棄去上層正己燒及中間層雜質(zhì)；
f.取下層50PL用于分析。
[0022](2)用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中孕酮?dú)埩袅?br> 取包被有孕酮抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μ?/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中；加入酶標(biāo)二抗工作液，50 μ?7孔，然后加入孕酮抗體工作液，50 μ?7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ;小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液300?/孔，充分洗滌4次，浸泡15-30 S，用吸水紙拍干；加入底物液A 50 μ?/孔，底物液B 50ML/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15 min;加入終止液50 VL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù));對(duì)比待測(cè)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值大小，定量分析待測(cè)樣品中孕酮?dú)埩袅俊?br>[0023](3)分析結(jié)果
百分吸光度值的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(O標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，SP百分吸光度值(%) = B/B0X100%
其中B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0-O ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。
[0024]以孕酮的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線方程。將樣本的百分吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孕酮的實(shí)際濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，包括酶標(biāo)板、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、孕酮抗體工作液、孕酮酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
2.檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的制備、孕酮抗體工作液的制備、孕酮酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，其特征在于:所述的酶標(biāo)板制備方法為將孕酮半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到孕酮包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將包被抗原稀釋成1:40000比例，100 1117孔，37°〇孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入稀釋后的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ L/孔，37°〇放置1.5 h，棄去封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，其特征在于:孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別為 O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7 μ g/kg、8.1U g/kg。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，其特征在于:所述的孕酮抗體工作液是采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，其特征在于:所述的孕酮酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:2000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，其為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其為含0.5% 吐溫-20，0.01 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
7.權(quán)利要求2所述的檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，基于抗原抗體的間接競(jìng)爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法的特征在于:預(yù)處理待測(cè)樣品，取包被有孕酮抗原的酶標(biāo)板，按序分別加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、孕酮酶標(biāo)二抗工作液、孕酮抗體工作液各50 μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°c避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，拍干后加入底物液A 50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20 min,加入終止液50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中孕酮的含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述待測(cè)樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理: a.準(zhǔn)確稱取2.0±0.02g勻漿樣品至50 mL離心管中； b.先加入5mL乙酸乙酯,潤旋儀充分振蕩混勻1min；c.5000 r/min 離心 10 min ； d.取上清液ImL于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑? e.加入ImL正己烷(脂肪含量高的樣品可加入2mL正己烷)，充分渦動(dòng)10 S，再加入I mL樣品稀釋液,低速潤動(dòng)10 S ；4000 r/min,離心5 min,完全棄去上層正己燒及中間層雜質(zhì)； f.取下層50 PL用于分析。
【專利摘要】本發(fā)明為檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的檢測(cè)。所述試劑盒包括：包被孕酮抗原的酶標(biāo)板、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、孕酮抗體工作液、孕酮酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒的原理是固相間接競(jìng)爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)，把提取的樣品、酶標(biāo)二抗工作液和抗體工作液加入對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，孵育一段時(shí)間后，洗板加入底物液A、底物液B，在酶的作用下顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色，加入終止液，顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色。顯色的深淺與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中孕酮的含量成反比例關(guān)系。該方法可直接用于檢測(cè)雞肉組織中孕酮的殘留量。
【IPC分類】G01N21-31, G01N33-577
【公開號(hào)】CN104655846
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310584980
【發(fā)明人】洪霞, 杜霞
【申請(qǐng)人】鎮(zhèn)江先創(chuàng)生物科技有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請(qǐng)日】2013年11月20日