一種檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)雞肉組織中孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]孕酮亦稱為黃體酮、孕留酮、黃體留酮、黃體激素、助孕激素、助孕素或助孕酮是一種涉及女性月經(jīng)周期、妊娠和對(duì)人類還又其他動(dòng)物的胚胎有影響的類固醇。孕酮是一種女性荷爾蒙，參與人類與其他動(dòng)物的雌性月經(jīng)周期，支援懷孕與胚胎形成。孕酮是屬于一類稱為孕激素的荷爾蒙，也是人類最重要的孕激素。激素類藥物可提高畜食的飼料轉(zhuǎn)化率，進(jìn)而達(dá)到增重的目的，但因孕酮在體內(nèi)殘留會(huì)導(dǎo)致一系列問(wèn)題，如性征變化，早熟等，對(duì)兒童和青少年作用更為明顯。目前，激素類物質(zhì)已被大部分國(guó)家禁止在養(yǎng)殖業(yè)中使用，并不得在食品中檢出。但國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有雞肉中孕酮?dú)埩魴z測(cè)的相關(guān)報(bào)道，因此，有必要建立一種雞肉組織中孕酮?dú)埩舻臋z測(cè)技術(shù)。
[0003]酶聯(lián)免疫吸附法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測(cè)方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)行業(yè)。本發(fā)明旨在建立一種檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服色譜法的不足，本發(fā)明提供一種檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括酶標(biāo)板、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品、孕酮抗體工作液、孕酮酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。
[0006]本發(fā)明檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括以下步驟:酶標(biāo)板的制備、孕酮標(biāo)準(zhǔn)品的制備、孕酮抗體工作液的制備、孕酮酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0007]其進(jìn)一步特征在于:所述的酶標(biāo)板經(jīng)由孕酮抗原包被制備，具體步驟是將孕酮半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將孕酮包被抗原稀釋成1:40000比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
[0008]孕酮標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7 μ g/kg、8.1 μ g/kg。
[0009]所述孕酮抗體工作液是采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
[0010]所述孕酮酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:2000比例,所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過(guò)氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含 0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L 的 PBST，pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0011]檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法，基于抗原抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法包括以下步驟:
(1)預(yù)處理待測(cè)樣品，即將待測(cè)試的樣品處理為液體樣品，或者用有機(jī)溶劑提取待測(cè)樣品，并將其復(fù)溶于樣品稀釋液中；
(2)將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20?25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；
(3)取包被有孕酮抗原的酶標(biāo)板，加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μ L/孔到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入孕酮酶標(biāo)二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入孕酮抗體工作液，50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min ；
(4)小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液260μ L/孔，充分洗滌4飛次，每次間隔10 S，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)；
(5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20 min ；
(6)加入終止液50μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，測(cè)定每孔吸光度值(請(qǐng)?jiān)? min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))；
(7)以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中孕酮的含量。
[0012]其中，所述待測(cè)樣品用以下方法進(jìn)行預(yù)處理:
a.準(zhǔn)確稱取2.0±0.02g勻漿樣品至50 mL離心管中；
b.先加入5mL乙酸乙酯,潤(rùn)旋儀充分振蕩混勻1min；
c.5000 r/min 離心 10 min ；
d.取上清液ImL于5(T60°C氮?dú)饬飨麓蹈桑?br> e.加入ImL正己烷(脂肪含量高的樣品可加入2mL正己烷)，充分渦動(dòng)10 S，再加入I mL樣品稀釋液,低速潤(rùn)動(dòng)10 s ；4000 r/min,離心5 min,完全棄去上層正己燒及中間層雜質(zhì)；
f.取下層50PL用于分析。
[0013]本發(fā)明檢測(cè)孕酮的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測(cè)方法的測(cè)定原理:樣品中的孕酮與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競(jìng)爭(zhēng)抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過(guò)酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來(lái)判斷樣品中孕酮的含量。如果樣品中的孕酮含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0014]孕酮蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的制備: 采用琥珀酸酐法得到帶羧基的孕酮半抗原衍生物，之后取0.05 mmol與載體蛋白BSA按10:1的結(jié)合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亞胺，攪拌置室溫反應(yīng)24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS緩沖液中透析兩天，除去未反應(yīng)的半抗原，將得到的蛋白質(zhì)偶聯(lián)物溶液于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0015]孕酮抗體的制備:
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原SOyg與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進(jìn)行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進(jìn)行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測(cè)定抗血清效價(jià)至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進(jìn)行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進(jìn)行克隆化，選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時(shí)用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對(duì)單克隆抗體進(jìn)行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0016]制備包被有孕酮包被抗原的酶標(biāo)板:
包被抗原是將孕酮半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05 mol/LpH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將孕酮抗原稀釋成1:40000比例，100 μι/孔，37°C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 PL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0017]孕酮標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7μ g/kg、8.1 μ g/kg。
[0018]孕酮抗體工作液的制備:采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:60000比例制備。
[0019]孕酮酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋