專(zhuān)利名稱(chēng)：提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于小分子物質(zhì)的提取方法，特別是關(guān)于提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法。
環(huán)核苷酸在細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中起重要作用，是一項(xiàng)不可缺少的分子學(xué)指標(biāo)。目前，對(duì)提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸，常采用的是凍融裂解法、超聲波破膜法和低滲破膜法。
凍融裂解法是通過(guò)將細(xì)胞反復(fù)凍融，使細(xì)胞膜破裂而釋放出環(huán)核苷酸，采用此法時(shí)必須在細(xì)胞懸液中加磷酸二酯酶抑制劑(EDTA)，以防止環(huán)磷酸腺苷(CAMP)和環(huán)磷酸烏苷(CGMP)被磷酸二酯酶(PDE)水解。由于酶抑制劑的存在，使細(xì)胞內(nèi)其他酶類(lèi)未被滅活，易受凍融溫度和EDTA的交互影響，從而影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的含量，特別是對(duì)CGMP的影響，使其含量偏高。
超聲波破膜法是通過(guò)超聲波發(fā)生器機(jī)械性破細(xì)胞膜，釋放出環(huán)核苷酸。該法需用三氯醋酸或高氯酸終止酶反應(yīng)，但細(xì)胞的膜蛋白經(jīng)酸固定后會(huì)影響破膜率，并且在破膜后須用水飽和乙醚提取三氯醋酸或用堿中和高氯酸。整個(gè)提取過(guò)程操作步驟多而復(fù)雜，易造成實(shí)驗(yàn)誤差大，并且受到儀器設(shè)備限制，不易推廣應(yīng)用。
低滲破膜法采用細(xì)胞懸液中加水低滲、破膜，然后加熱和加酸去蛋白，由于終止酶反應(yīng)前細(xì)胞受到低滲刺激，影響環(huán)核苷酸的含量，加之須除去膜蛋白和提取酸，否則環(huán)核苷酸含量偏高。
用上述各方法提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸，均須經(jīng)過(guò)破膜，并且要加一定的試劑。膜蛋白和試劑的存在，以及溫度的變化，影響了環(huán)核苷酸的含量。由于提取過(guò)程操作步驟多而復(fù)雜，易造成實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)誤差大，而且所需儀器設(shè)備要求高，不易推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是建立一種操作簡(jiǎn)單，易推廣，不受溫度和試劑影響的提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的穩(wěn)定方法。
本發(fā)明采用加熱提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法，是將自然沉降的血漿，用等滲離子液做基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞分離處理，處理后的細(xì)胞懸液置于80°～100℃水浴加熱5～40分鐘，立即冰浴冷卻，經(jīng)離心后的上清液即含環(huán)核苷酸。
本發(fā)明是在加熱終止酶反應(yīng)的同時(shí)，提取細(xì)胞內(nèi)的環(huán)核苷酸，提取時(shí)不需要加EDTA和其它試劑，可以消除酶抑制劑等試劑和溫度變化對(duì)細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸含量的影響;并且采用等滲離子液為基質(zhì)以提高細(xì)胞存活率，特別是不經(jīng)過(guò)破膜，其可溶性蛋白小于100微克/107細(xì)胞，因此不需要除蛋白。整個(gè)操作簡(jiǎn)便，結(jié)果穩(wěn)定，可以減少實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)誤差，提高結(jié)果準(zhǔn)確性，易于推廣。并且還適用于提取血小板內(nèi)的環(huán)核苷酸，以及作體外抗炎、免疫、藥理等實(shí)驗(yàn)研究。
本發(fā)明的實(shí)施例是這樣的抗凝血置室溫下自然沉降30～40秒，吸出富有白細(xì)胞的血漿，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求分別分離白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、血小板等。若處理白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞，則分別取富有白細(xì)胞的血漿沉淀物和淋巴細(xì)胞分離后的沉淀物，用少量生理鹽水懸浮，加四倍體積的蒸餾水低滲30秒～2分鐘(視標(biāo)本對(duì)象而定)，立即加3.6%氯化鈉恢復(fù)等滲，再離心，取沉淀物加0.1%葡萄糖等滲離子液洗2次，取其細(xì)胞懸液分裝試管內(nèi)，置80°～100℃水浴，加熱5～40分鐘，取出試管，放入冰浴冷卻，然后經(jīng)3000rpm離心10分鐘，上清液即含環(huán)核苷酸?？芍苯佣课∩锨逡?，加上一定量的氚標(biāo)抗原和一定稀釋量的抗體，作放射免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，測(cè)定環(huán)核苷酸的含量。也可以將上清液定量吸入小燒杯中，置65℃水浴蒸干，放入冰箱保存，待測(cè)環(huán)核苷酸，保存期可達(dá)2～3個(gè)月。
進(jìn)行細(xì)胞分離處理所用的0.1%葡萄糖離子液的組成是138mMNaCl2.7mMKCl8.1mM Na2HPO41.5mM KH2PO41mM MgCl20.6mM CaCl20.1%葡萄糖液，PH7.4。
用該離子液做基質(zhì)，可以提高細(xì)胞存活率。
權(quán)利要求
1.一種提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法，是將自然沉降的血漿經(jīng)細(xì)胞分離處理后的細(xì)胞懸液，其特征在于該自然沉降的血漿用等滲離子液做基質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞分離處理，將處理后的細(xì)胞懸液置80°～100℃水浴加熱5～40分鐘后，經(jīng)冰浴冷卻，離心后的上清液即含環(huán)核苷酸。
2.按權(quán)利要求1所述的提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法，其特征在于等滲離子液組成為138mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，1mM MgCl2，06mM CaCl2，0.1%葡萄液，PH7.4。
全文摘要
一種提取細(xì)胞內(nèi)環(huán)核苷酸的方法，不需要破膜，也不受溫度和試劑的影響，而是通過(guò)加熱，在終止酶反應(yīng)的同時(shí)提取細(xì)胞內(nèi)的環(huán)核苷酸，操作簡(jiǎn)便快速，提取結(jié)果準(zhǔn)確，易于推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1032032SQ8710620
公開(kāi)日1989年3月29日 申請(qǐng)日期1987年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1987年9月5日
發(fā)明者樓蘭花 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)學(xué)院