本發(fā)明涉及低聚肽質(zhì)量控制方法，尤其是涉及一種玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、玉米低聚肽主要指玉米蛋白經(jīng)酶催化、發(fā)酵或強(qiáng)酸降解后所得的一種低分子量混合物，因在醒酒護(hù)肝、降血壓等方面具有多種生理活性而備受科研學(xué)者與消費(fèi)者的關(guān)注。目前，針對(duì)玉米低聚肽原料及產(chǎn)品的質(zhì)量分析與控制主要通過監(jiān)測(cè)酶解物水解度、分子量分布、氨基酸組成等方式來(lái)進(jìn)行。但由于水解度、氨基酸、分子量等方法均僅能間接或宏觀描述玉米低聚肽的宏觀變化或差異情況，無(wú)法直接反映酶解物在多肽分子層面的組成或變化情況，故不同工藝所得玉米低聚肽甚至不同植物原料低聚肽間，指標(biāo)同質(zhì)化現(xiàn)象較為嚴(yán)重，難以有效監(jiān)測(cè)原料供應(yīng)或生產(chǎn)品質(zhì)的穩(wěn)定性與可靠性，且原料假冒偽劣技術(shù)門檻低，惡性競(jìng)爭(zhēng)盛行，對(duì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成嚴(yán)重阻礙。

2、近年來(lái)，國(guó)內(nèi)科研學(xué)者通過對(duì)玉米蛋白酶解物的分離和純化研究，發(fā)現(xiàn)玉米蛋白酶解物中一般含有較高的丙氨酸-酪氨酸肽(簡(jiǎn)稱ay)，故部分廠家開始采用液相色譜法對(duì)ay進(jìn)行檢測(cè)以加強(qiáng)對(duì)玉米低聚肽的質(zhì)量控制。但由于玉米蛋白酶解物多肽組成極為復(fù)雜，常含有成百數(shù)千甚至上萬(wàn)條多肽，使用液相色譜分離容量及分離度常存在明顯不足，容易存在多種共洗脫物，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差，質(zhì)量檢測(cè)與特異性明顯不足，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，不利于產(chǎn)業(yè)的良性和快速發(fā)展。

3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的第一目的在于提供一種基于丙氨酸-酪氨酸肽檢測(cè)分析的玉米低聚肽質(zhì)量控制方法，該方法主要采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)對(duì)丙氨酸-酪氨酸肽進(jìn)行含量測(cè)定，以此實(shí)現(xiàn)對(duì)不同來(lái)源、不同批次玉米低聚肽原料的品質(zhì)鑒別與監(jiān)測(cè)。

2、本發(fā)明的第二目的在于提供一種玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法在玉米低聚肽質(zhì)量甄別中的應(yīng)用。

3、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

4、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，一種玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法，所述方法包括：

5、(a)配置丙氨酸-酪氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

6、和，玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液；

7、(b)利用液相色譜對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、待測(cè)樣品溶液進(jìn)行組分分離，得到流出組分；

8、(c)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品經(jīng)液相色譜分離后的流出組分進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，依據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)對(duì)丙氨酸-酪氨酸肽進(jìn)行定性和定量分析。

9、本發(fā)明提供的玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法，該方法以玉米低聚肽中具有較高組成占比的丙氨酸-酪氨酸肽為特征肽建立，采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)，對(duì)玉米低聚肽原料進(jìn)行質(zhì)量控制與品質(zhì)鑒別，較肽分子量分布、水解度等傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方式，質(zhì)量控制與品質(zhì)鑒別特異性大大增強(qiáng)，且分析效率大大提高。

10、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述丙氨酸-酪氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的丙氨酸-酪氨酸肽純度≥95％，且不含鹽性成分。

11、優(yōu)選地，上述丙氨酸-酪氨酸肽為人工化學(xué)合成得到。

12、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述丙氨酸-酪氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度為0.5～10μg/ml。

13、優(yōu)選地，所述丙氨酸-酪氨酸肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備方法包括：分別精密稱取一定量的丙氨酸-酪氨酸肽(簡(jiǎn)稱ay)標(biāo)準(zhǔn)品，使用超純水配置成濃度范圍在0.5～10μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

14、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液的制備方法包括：

15、將玉米低聚肽樣品分散于超純水中勻漿，然后離心去除不溶性沉淀；隨后加入等體積有機(jī)溶劑靜置沉淀，再次離心去除沉淀，取上清液過膜，得到玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液。

16、優(yōu)選地，所述玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液的制備方法包括：精密稱取經(jīng)研磨或不研磨后的待測(cè)樣品分散于超純水中，使用高剪切分散機(jī)快速勻漿，配置成適宜濃度的待測(cè)樣液，35-55℃下恒溫?cái)嚢杌蛘鹗?0-30min，離心去除不溶性沉淀，取一定量上清液加入等體積有機(jī)溶劑，靜置5-10min沉淀大分子蛋白等物質(zhì)，再次離心去除沉淀，取上清液過膜，得到玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液。

17、在上述優(yōu)選實(shí)施方式中，所述玉米低聚肽待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度為10～4000μg/ml。

18、在上述優(yōu)選實(shí)施方式中，所述有機(jī)溶劑為甲醇或乙腈；

19、在上述優(yōu)選實(shí)施方式中，所述過膜為過0.22μm有機(jī)濾膜。

20、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(b)中液相色譜為耐壓≥600bar的液相色譜；

21、所述液相色譜的檢測(cè)條件為：

22、所述色譜分析流速為0.1～0.4ml/min，柱溫為30℃；色譜柱內(nèi)徑為1.0或2.1mm，長(zhǎng)度為50～100mm，填料顆粒直徑為1.8μm；

23、流動(dòng)相由流動(dòng)相a和流動(dòng)相b組成，流動(dòng)相a為含0.05～0.3％甲酸的水溶液，流動(dòng)相b為乙腈溶液；

24、洗脫梯度為：0～1.00min?5.0％?b，1.00～1.50min?5.0～10.0％?b，1.50～7.50min?10.0～40.0％?b，7.50～8.50min?40.0～90.0％?b，8.50～10.00min?90％?b，10.00～10.50min?90.0～5.0％?b，10.50～12.00min，5.0％?b。

25、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(c)中質(zhì)譜為三重四級(jí)桿質(zhì)譜、四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜或四級(jí)桿-離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器中的至少一種；

26、所述質(zhì)譜配備esi電噴霧離子源，離子源工作模式為正離子模式；質(zhì)譜檢測(cè)模式為mrm多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式，一級(jí)前體離子設(shè)置為253.1m/z，二級(jí)碎裂離子檢測(cè)設(shè)置為182.2和207.1m/z，掃描頻率為50-1000da/s；所述ay前體離子的二級(jí)碎裂能量為15ev。

27、作為一種優(yōu)選的實(shí)施方式，本技術(shù)通過采用上述質(zhì)譜監(jiān)測(cè)分析方法對(duì)玉米低聚肽不同來(lái)源及不同批次原料進(jìn)行質(zhì)量控制與監(jiān)測(cè)，分析時(shí)間僅12分鐘，高效快速，且目標(biāo)監(jiān)測(cè)離子對(duì)特征性強(qiáng)，抗干擾性好、準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好，操作簡(jiǎn)便，優(yōu)勢(shì)突出。

28、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(c)中對(duì)丙氨酸-酪氨酸肽進(jìn)行定性分析的方法為：

29、標(biāo)準(zhǔn)品理論塔板數(shù)≥于8000，待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)到兩種二級(jí)監(jiān)測(cè)離子且色譜峰信噪比均大于3。

30、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述步驟(c)中對(duì)丙氨酸-酪氨酸肽進(jìn)行定量分析的方法為：

31、使用外標(biāo)法以峰面積對(duì)丙氨酸-酪氨酸肽的特征離子對(duì)253.1/182.2作定量計(jì)算分析。

32、需要說(shuō)明的是，發(fā)明人在抽取丙氨酸-酪氨酸肽(ay)的母離子進(jìn)行碎裂后的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)該譜圖不僅可較好地匹配ay多肽，亦可同時(shí)較好地匹配fs，二者之間的差異主要體現(xiàn)在質(zhì)荷比離子(ay?m/z?182.08；fs：m/z?120.08)，其余質(zhì)荷比離子如m/z?207.1、235.1等離子為兩種多肽的共性特征碎片離子。

33、這說(shuō)明了，ay出峰時(shí)間處不僅存在共洗脫物，同時(shí)還存在同分異構(gòu)體(fs)，故在進(jìn)行多肽ay定量檢測(cè)時(shí)，選擇離子對(duì)(253.1/182.2)方可作為ay的特征離子對(duì)，其余離子對(duì)(253.1/207.1)、(253.1/235.1)僅可作為輔助定性離子對(duì)。

34、本發(fā)明以離子對(duì)(253.1/182.2)作為ay的特征性離子對(duì)，與原有液相色譜法相比，大大增強(qiáng)了方法對(duì)共洗脫物多肽的抗干擾性以及對(duì)ay多肽檢測(cè)的特異性，同時(shí)，更是避免了共洗脫同分異構(gòu)體(fs)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。因此，為避免在玉米低聚肽質(zhì)量控制檢測(cè)中，同分異構(gòu)體帶來(lái)的干擾，本技術(shù)選擇離子對(duì)(253.1/182.2)作為丙氨酸-酪氨酸肽的定量特征離子對(duì)。

35、根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，一種上述玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法在玉米低聚肽質(zhì)量甄別中的應(yīng)用；

36、本發(fā)明提供的玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法可廣泛應(yīng)用于玉米低聚肽的質(zhì)量甄別中。

37、在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式中，所述玉米低聚肽質(zhì)量甄別包括：甄別不同制備方法或廠家來(lái)源的玉米低聚肽樣品；

38、或，對(duì)相同制備方法不同批次的玉米低聚肽樣品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測(cè)。

39、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

40、本發(fā)明提供的玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法，該方法以玉米低聚肽中具有較高組成占比的丙氨酸-酪氨酸肽為特征肽建立，采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)，對(duì)玉米低聚肽原料進(jìn)行質(zhì)量控制與品質(zhì)鑒別，較肽分子量分布、水解度等傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方式，質(zhì)量控制與品質(zhì)鑒別特異性大大增強(qiáng)，且分析效率大大提高。

41、此外，還需要強(qiáng)調(diào)的是，發(fā)明人在抽取丙氨酸-酪氨酸肽(ay)的母離子進(jìn)行碎裂后的二級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)該譜圖不僅可較好地匹配ay多肽，亦可同時(shí)較好地匹配fs。這說(shuō)明了，ay出峰時(shí)間處不僅存在共洗脫物，同時(shí)還存在同分異構(gòu)體(fs)。因此，為避免在玉米低聚肽質(zhì)量控制檢測(cè)中，同分異構(gòu)體帶來(lái)的干擾，本技術(shù)選擇離子對(duì)(253.1/182.2)作為丙氨酸-酪氨酸肽的定量特征離子對(duì)。

42、本發(fā)明提供的玉米低聚肽的質(zhì)量控制方法可廣泛應(yīng)用于玉米低聚肽的質(zhì)量甄別中。