本發(fā)明涉及高效液相色譜分析法
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種采用hplc分離測(cè)定利奧西呱原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：利奧西呱，簡(jiǎn)稱為rocg，是由德國(guó)拜耳制藥公司研發(fā)的能夠激發(fā)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(sgc)的化合物，sgc通過(guò)作用于cgmp而調(diào)節(jié)多重血管床的血管舒張作用，可用于治療心血管病證或/和性功能障礙。目前，拜耳制藥公司研制的用于治療肺動(dòng)脈高壓(pah)的口服片劑已經(jīng)獲得fda批準(zhǔn)，商品名為adempas。在中國(guó)專利cn1330649c中公開了利奧西呱、其異構(gòu)體和水合物的三種制備方法，其中一種制備方法中涉及到2-[1-(2-氟芐基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-4,5,6-嘧啶三胺(以下簡(jiǎn)稱為rocg-三胺，專利文獻(xiàn)中已經(jīng)公開了此化合物的制備方法)和4,6-二氨基-2-[1-(2-氟芐基)-1h-吡唑并[3，4-b]吡啶-3-基]-5-嘧啶基氨基甲酸甲酯(以下簡(jiǎn)稱為rocg-甲酸甲酯，專利文獻(xiàn)中已經(jīng)公開了此化合物的制備方法)等多個(gè)中間體。另外，利奧西呱原料藥中還可能含有其異構(gòu)體(以下簡(jiǎn)稱為rocg-間氟，可以參照專利文獻(xiàn)中利奧西呱的制備方法獲得)。以上所述的三個(gè)化合物為利奧西呱原料中較為常見的工藝雜質(zhì)。因此，為了控制利奧西呱原料藥的質(zhì)量，需要控制以上所述的三個(gè)工藝雜質(zhì)以及其他雜質(zhì)。在目前現(xiàn)有技術(shù)中，中國(guó)專利cn104374861b公開了一種用于檢測(cè)利奧西呱化合物及其中間體純度的方法。其中所述方法特征是采用uv檢測(cè)器的高效液相色譜儀；色譜柱是agilentrxc8,250mm×4.6mm，5μm；洗脫劑：a相是加入2ml磷酸溶液的濃度約為2g/l的辛烷磺酸鈉水溶液：乙腈＝90:10，b相是乙腈；梯度程序：0min，27％的b相，20min，27％的b相，51min，65％的b相，52min，27％的b相；流速是1.0ml/min；柱溫是40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)是uv260nm。所述方法適合于對(duì)利奧西呱原料的質(zhì)量監(jiān)控。但該方法采用陰離子對(duì)試劑作為緩沖溶液，離子對(duì)試劑的濃度與對(duì)樣品保留時(shí)間有直接影響，而且離子對(duì)試劑對(duì)ph值敏感，直接影響樣品的重現(xiàn)性。另外，離子對(duì)試劑需長(zhǎng)時(shí)間平衡系統(tǒng)，同時(shí)很難洗去，會(huì)大大縮短色譜柱使用壽命。在現(xiàn)有的技術(shù)中，適合于分析檢測(cè)利奧西呱原料藥有關(guān)物質(zhì)的分析方法具有嚴(yán)重缺陷。本發(fā)明提供一種適合于分離檢測(cè)利奧西呱原料藥有關(guān)物質(zhì)的分析方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種專屬性好，靈敏度高，準(zhǔn)確度好，耐用性好、穩(wěn)定性指示能力好的采用hplc分離測(cè)定利奧西呱原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：采用hplc分離測(cè)定利奧西呱原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法，采用以十八烷基硅烷鍵合相或辛烷硅烷鍵合相作為填料的色譜，采用由作為a相的緩沖鹽溶液或其與有機(jī)溶液的混合液和作為b相的有機(jī)溶液組成的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，采用紫外檢測(cè)器作為檢測(cè)器以測(cè)定利奧西呱原料藥中的有關(guān)物質(zhì)；所述流動(dòng)相的洗脫采用梯度洗脫方式，至少包含三個(gè)階段的梯度變化，其中第一階段梯度變化是在0～20min內(nèi)進(jìn)行，a相在流動(dòng)相中的體積含量為80～100％；第二階段梯度變化是在第一階段梯度變化的時(shí)間基礎(chǔ)上于接下來(lái)的10～40min內(nèi)進(jìn)行，a相在流動(dòng)相中的體積含量由80～100％變化至20～40％；第三階段梯度變化是在第二階段梯度變化的時(shí)間基礎(chǔ)上于接下來(lái)的5～30min內(nèi)進(jìn)行，a相在流動(dòng)相中的體積含量為20～40％，其中a相中有機(jī)溶劑的體積含量為0～20％；所述a相和b相中的有機(jī)溶液選自甲醇、乙腈或其混合物；所述紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)在210～280nm，流動(dòng)相流速是0.5～1.5ml/min，色譜柱溫度在20～60℃；所述緩沖鹽溶液中的緩沖鹽選自高氯酸鈉、高氯酸鉀及其他高氯酸鹽中的一種或幾種；所述緩沖鹽溶液中的陰離子試劑濃度是0.005～0.1mol/l，緩沖鹽溶液還加入了分析純磷酸調(diào)節(jié)ph值至2～3。所述緩沖鹽溶液為濃度0.01mol/l的高氯酸鈉水溶液，加入分析純磷酸調(diào)節(jié)ph值至2.5。采用hplc分離測(cè)定利奧西呱原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法，包括如下條件：色譜柱：菲羅門gemini110a，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)器：uv檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；流速：0.9～1.1ml/min；柱溫：20～60℃；梯度洗脫：a相：0.01mol/lph＝2.5的高氯酸鈉水溶液:乙腈＝90:10，體積比；b相：乙腈。所述利奧西呱原料藥的進(jìn)樣濃度為0.1～5.0mg/ml，利奧西呱原料藥的稀釋溶劑選自水和乙腈及二甲基亞砜或n，n-二甲基甲酰胺的混合溶液，進(jìn)樣體積為1～100μl。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明所述方法可以采用未加校正因子的主成分自身對(duì)照法進(jìn)行計(jì)算利奧西呱原料藥的有關(guān)物質(zhì)的含量，從而快速測(cè)得利奧西呱原料中有關(guān)物質(zhì)的含量，特別適合于分離檢測(cè)雜質(zhì)rocg-三胺、rocg-甲酸甲酯和rocg-間氟的含量。附圖說(shuō)明：圖1為實(shí)施例1專屬性實(shí)驗(yàn)的空白溶液的色譜圖；圖2為實(shí)施例1專屬性實(shí)驗(yàn)的供試品溶液的色譜圖；圖3為實(shí)施例1專屬性實(shí)驗(yàn)的系統(tǒng)適用性溶液的色譜圖；圖4為實(shí)施例1專屬性實(shí)驗(yàn)的雜質(zhì)定位溶液的色譜圖。具體實(shí)施方式：為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例1專屬性實(shí)驗(yàn)色譜條件：儀器：安捷倫高效液相色譜儀1260；色譜柱：菲羅門c18gemini110a，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)器：uv檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；梯度洗脫：時(shí)間(min)a相％(體積比)b相％(體積比)0901059010303070603070619010709010a相：0.01mol/l高氯酸鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值2.5):乙腈＝90:10，體積比，其中磷酸溶液的濃度是約85％，w/v；b相：乙腈。實(shí)驗(yàn)步驟：稀釋液(空白溶液)：dmf：(20％乙腈水溶液)＝1:9，體積比。供試品溶液：取利奧西呱約25mg，精密稱定至50ml量瓶，加5mldmf溶解后用20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取0.5ml加25mg利奧西呱同置50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。雜質(zhì)定位溶液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取1ml加稀釋劑稀釋至100ml，搖勻，即得。分別取空白溶液、供試品溶液、系統(tǒng)適用性溶液、和雜質(zhì)定位溶液，采用上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。空白圖譜如圖1，系統(tǒng)適用性溶液圖譜如圖2，中間體加標(biāo)液圖譜如圖3和供試品溶液圖譜如圖4。按面積歸一化法計(jì)算利奧西呱原料藥主要有關(guān)物質(zhì)的含量。檢測(cè)結(jié)果如表1。表1實(shí)施例2耐用性實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例通過(guò)改變部分色譜條件的參數(shù)考察色譜方法的耐用性，以如下色譜條件為基礎(chǔ)：儀器：安捷倫1260高效液相色譜儀；色譜柱：菲羅門c18gemini110a，4.6×250mm，5μm；檢測(cè)器：uv檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)237nm；流速：1.0ml/min；柱溫：40℃；梯度洗脫：時(shí)間(min)a相％(體積比)b相％(體積比)0901059010303070603070619010709010a相：0.01mol/l高氯酸鈉溶液(磷酸調(diào)節(jié)ph值2.5)：乙腈＝90:10，體積比，其中磷酸溶液的濃度是約85％，w/v；b相：乙腈。以單因素變化的方式考察改變流速、色譜柱溫度、流動(dòng)相ph值、更換不同生產(chǎn)批次的菲羅門c18gemini110a，4.6×250mm，5μm色譜柱等色譜條件對(duì)檢測(cè)系統(tǒng)適應(yīng)性溶液和靈敏度溶液的影響。主要考察改變色譜條件對(duì)系統(tǒng)適應(yīng)性溶液中各峰分離度以及供試品溶液雜質(zhì)檢出的影響。稀釋液(空白溶液)：dmf：(20％乙腈水溶液)＝1:9，體積比。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取0.5ml加25mg利奧西呱同置50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液：取利奧西呱約25mg，精密稱定至50ml量瓶，加5mldmf溶解后用20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。在各考察色譜方法下，分別取空白軟件和系統(tǒng)適應(yīng)性溶液各進(jìn)一針，供試品溶液進(jìn)樣兩針，檢測(cè)結(jié)果如表2。表2實(shí)施例3檢測(cè)限定量限實(shí)驗(yàn)色譜條件如實(shí)施例1所述色譜條件。稀釋液(空白溶液)：dmf：(20％乙腈水溶液)＝1:9，體積比。檢測(cè)限定量限溶液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)及利奧西呱各適量，加dmf適量溶解后稀釋制成一系列不同濃度的溶液，依法測(cè)定。當(dāng)主峰峰高為噪音峰高的3倍時(shí)，該物質(zhì)的濃度或量即為該物質(zhì)的檢測(cè)限；當(dāng)主峰峰高為噪音峰高的10倍時(shí)，該物質(zhì)的濃度或量即為該物質(zhì)的定量限。結(jié)果見下表3。表3檢測(cè)限占供試品百分百進(jìn)樣量(μg)信噪比(s/n)rocg-甲酸甲酯0.008％0.414.8rocg-三胺0.008％0.394.5利奧西呱0.008％0.425.3rocg-間氟0.008％0.404.9定量限占供試品百分百進(jìn)樣量(μg)信噪比(s/n)rocg-甲酸甲酯0.02％1.0215.3rocg-三胺0.02％0.9814.8利奧西呱0.02％1.0517.5rocg-間氟0.02％1.0116.2實(shí)施例4精密度實(shí)驗(yàn)色譜條件如實(shí)施例1所述色譜條件。稀釋液(空白溶液)：dmf：(20％乙腈水溶液)＝1:9，體積比。雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取1ml加稀釋液稀釋至100ml，搖勻，即得。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)溶液：取供試品25mg，精密稱定，置于50ml容量瓶?jī)?nèi)，加入5mldmf溶解，精密移取上述雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液5ml至上述容量瓶中，加20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制6份。待基線平衡后，取空白溶液及6份分析重復(fù)性實(shí)驗(yàn)溶液各進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。按不加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算6份分析重復(fù)性試驗(yàn)溶液中各雜質(zhì)的含量、平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(rsd)，檢測(cè)結(jié)果如表4。表4實(shí)施例5回收率試驗(yàn)色譜條件如實(shí)施例1所述色譜條件。稀釋液(空白溶液)：dmf：(20％乙腈水溶液)＝1:9，體積比。系統(tǒng)適應(yīng)性溶液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取0.5ml加25mg利奧西呱同置50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。供試品溶液：取利奧西呱約25mg，精密稱定至50ml量瓶，加5mldmf溶解后用20％乙腈水稀釋至刻度，搖勻，即得。雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液：取rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯、rocg-間氟雜質(zhì)各25mg同置于50ml容量瓶中，加5mldmf溶解后加20％乙腈水稀釋至刻度，取1ml加稀釋液稀釋至100ml，搖勻，即得。雜質(zhì)對(duì)照溶液：取雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液5ml加稀釋液稀釋至50ml，搖勻，即得?；厥章蕦?shí)驗(yàn)溶液：取供試品25mg至50ml容量瓶中，先分別加入5ml的dmf溶解，分別量取4ml、5ml、6ml不同體積的雜質(zhì)對(duì)照儲(chǔ)備液于上述容量瓶中，再用20％乙腈水定容至刻度，搖勻，每個(gè)濃度配制3份，即得雜質(zhì)的3(份)×3(濃度)共9份回收率供試液。待系統(tǒng)適用性合格后，取雜質(zhì)對(duì)照溶液連續(xù)進(jìn)樣2針，再取2份供試品溶液各進(jìn)1針，各濃度水平下回收率實(shí)驗(yàn)溶液各進(jìn)樣1針，記錄色譜圖。計(jì)算并報(bào)告9份樣品的回收率單值，平均回收率(n＝9)和回收率(n＝9)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值(rsd)。按照外標(biāo)法計(jì)算雜質(zhì)的含量，然后按照以下公式分別計(jì)算各濃度水平下回收率實(shí)驗(yàn)溶液中雜質(zhì)回收率，檢測(cè)結(jié)果見表5。式中：w對(duì)照：雜質(zhì)對(duì)照的雜質(zhì)質(zhì)量，mg；w加入：加入回收率實(shí)驗(yàn)溶液中的雜質(zhì)質(zhì)量，mg；w樣品：回收率實(shí)驗(yàn)溶液中樣品的稱樣量，mg；w供試品：回收率實(shí)驗(yàn)溶液中樣品的稱樣量，mg；a樣品：回收率實(shí)驗(yàn)樣品溶液中的雜質(zhì)峰面積；a供試品：回收率實(shí)驗(yàn)供試品溶液中的雜質(zhì)峰面積；a對(duì)照：回收率實(shí)驗(yàn)雜質(zhì)對(duì)照溶液中的雜質(zhì)峰面積；百分比：回收率實(shí)驗(yàn)樣品溶液與雜質(zhì)對(duì)照溶液相比的百分比，80％、100％、120％；表5綜上所述，實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和圖譜1-4表明，本發(fā)明提供的方法在檢測(cè)利奧西呱原料藥有關(guān)物質(zhì)，特別是rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯和rocg-間氟有關(guān)物質(zhì)時(shí)，空白無(wú)干擾，具有很好的專屬性，其中rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯和rocg-間氟與相鄰雜質(zhì)或利奧西呱的分離度均為2.0以上。實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rocg-三胺、rocg-乙酸乙酯和rocg-間氟的檢測(cè)限為0.008％，定量限為0.02％，雜質(zhì)檢出良好。實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在單因素改變部分色譜參數(shù)的情況下，本方法依然適用于檢測(cè)利奧西呱原料藥有關(guān)物質(zhì)，其中考察的系統(tǒng)適應(yīng)性溶液的分離度和供試品溶液的檢測(cè)情況受影響不大，所述方法具有較好的耐用性，在適當(dāng)范圍內(nèi)變更色譜條件完全不影響本發(fā)明方法實(shí)現(xiàn)分析目的。實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用本發(fā)明提供的分析方法測(cè)定含有雜質(zhì)的精密度溶液，進(jìn)樣6針后各雜質(zhì)的測(cè)定含量的rsd％小于5％，所述方法具有較好的重復(fù)性。實(shí)施例5的實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)定原料藥中含有不同濃度水平的雜質(zhì)的回收率，考察本發(fā)明的分析方法在測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的準(zhǔn)確性。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度水平的雜質(zhì)的回收率均在92-108％之間，多個(gè)樣品回收率的rsd％小于10％。因此所述方法在測(cè)定利奧西呱原料藥有關(guān)物質(zhì)中具有很好的準(zhǔn)確性。因此，本發(fā)明所述的分析方法在測(cè)定利奧西原料藥有關(guān)物質(zhì)具有專屬性好，靈敏度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。當(dāng)前第1頁(yè)12