專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用篩選物質(zhì)的方法和藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)測(cè)定激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體δ(peroxisome proliferator activated receptorδ，PPARδ)的作用來(lái)篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，以及含有具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的化合物的藥劑，該藥劑具有PPARδ激活作用。另外，本發(fā)明涉及一種能專(zhuān)一性地增強(qiáng)線粒體功能中的解偶聯(lián)蛋白(UCP)導(dǎo)致的解偶聯(lián)呼吸或在線粒體內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(以下一般稱(chēng)之為質(zhì)子泄漏)的藥劑，線粒體是使用脂肪酸和丙酮酸作為底物的能量代謝(呼吸)細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器。另外，本發(fā)明涉及抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、以及減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑。
背景技術(shù)：
體內(nèi)的能量代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括食物攝取調(diào)節(jié)系統(tǒng)和能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)。能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與兩種類(lèi)型的能量消耗，即用于基礎(chǔ)代謝以便維持生命的能量消耗，和其他能量消耗。在后一種情況下的主要能量消耗是非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱(nonshivering thermogenesis，nST)，它是產(chǎn)熱的，并且，它的功能意義是在出生之后即刻、在接觸寒冷期間以及在冬眠結(jié)束時(shí)保持體溫等，以及通過(guò)消耗由于吃得過(guò)多而產(chǎn)生的多余能量，從而抑制肥胖和糖脂代謝疾病等。特別是在恒溫的哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)中，尤其是小型動(dòng)物中，nST對(duì)于保持體溫來(lái)說(shuō)是重要的。在誘導(dǎo)nST的機(jī)制中，線粒體中的質(zhì)子泄漏，即細(xì)胞呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和ATP合成的參與是重要的。
在褐色脂肪組織(BAT)中，在線粒體膜中存在一種被稱(chēng)為解偶聯(lián)蛋白(UCP1)的特殊蛋白，其分子量為32kD，并且包括大約300個(gè)氨基酸。該蛋白具有使ATP合成與褐色脂肪細(xì)胞(BA)的呼吸鏈的電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)解偶聯(lián)的作用。UCP1包括一種結(jié)構(gòu)域的三次重復(fù)的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域包括大約100個(gè)氨基酸，并且每一個(gè)結(jié)構(gòu)域具有兩個(gè)跨膜部位，一共6個(gè)部位。所述跨膜區(qū)構(gòu)成了線粒體膜上的通道。
UCP1是轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的載體。由UCP1和其他成分構(gòu)成的質(zhì)子通道具有按照電化學(xué)梯度使質(zhì)子自由穿透，以釋放熱量的功能。這就是nST。就是說(shuō)，nST通過(guò)經(jīng)質(zhì)子通道的質(zhì)子滲透導(dǎo)致所述解偶聯(lián)，并且，所述解偶聯(lián)減弱了ATP合成，激活了線粒體內(nèi)的呼吸，從而保持ATP與ADP的比例恒定。結(jié)果，大量脂肪和糖被氧化以產(chǎn)生熱量。
UCP1的生理學(xué)作用是在出生之后即刻、在接觸寒冷期間等情況下保持體溫，并且，用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的研究，業(yè)已證實(shí)了它參與肥胖的抑制。在各種肥胖模型中，UCP1表達(dá)減弱這一事實(shí)，表明了UCP1與肥胖發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)的相關(guān)性。例如，業(yè)已證實(shí)，在BAT減少的轉(zhuǎn)基因小鼠中，在沒(méi)有過(guò)量進(jìn)食的情況下出現(xiàn)了肥胖(Lowell等，Nature，366，740-742(1993))。另外，在小鼠中觀察到了身體脂肪的減少，和對(duì)由于高脂肪食物所導(dǎo)致的飲食誘導(dǎo)的肥胖的抗性，其中通過(guò)將UCP1基因插入脂肪專(zhuān)一性基因aP2的啟動(dòng)子，強(qiáng)制所述小鼠表達(dá)大量的UCP1(Kopecky等，J.Clin Invest，96，2914-2923(1995))。另外，在UCP1表達(dá)被抑制到1/3的小鼠體內(nèi)，觀察到了在暴露于寒冷的環(huán)境時(shí)體溫保持功能的減弱、由于身體脂肪的增加而導(dǎo)致的肥胖和胰島素抗性(Lowell B.B.等，Nature，366，740-742(1993))。另外，UCP1剔除小鼠是不耐寒的(Enerback S.等，Nature，387，90-94(1997))。如上文所述，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)業(yè)已了解到UCP1作為產(chǎn)熱分子在體溫調(diào)節(jié)和能量消耗方面具有重要作用，并且與肥胖密切相關(guān)。
UCP1表達(dá)的數(shù)量，主要是由核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，而UCP1基因表達(dá)隨cAMP濃度的提高而加強(qiáng)(齋藤等，最新醫(yī)學(xué)，52，1095-1096(1997))。
大約20-40％的細(xì)胞內(nèi)能量消耗被認(rèn)為是通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的質(zhì)子泄漏而產(chǎn)生的。另外，在具有很少BAT的成年人和其他動(dòng)物中，大部分nST被認(rèn)為是在骨骼肌和白色脂肪組織(WAT)中產(chǎn)生的?；谏鲜鍪聦?shí)，一直認(rèn)為UCP存在于除了BAT以外的組織中。有兩個(gè)研究小組在1997年連續(xù)報(bào)導(dǎo)了來(lái)自除了BAT以外的組織的UCP2的cDNA克隆(Fleury等，Nature Genet，15，269-272(1997)；Gimeno等，Diabetes46，900-906(1997))。
人UCP2表現(xiàn)出與人UCP1的59％的同源性，并且像UCP1那樣形成了具有6個(gè)跨膜區(qū)的通道，并且它具有嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。UCP2與UCP1的不同之處在于，它是在系統(tǒng)組織中廣泛表達(dá)的，在肺和胰腺中是以特別高的濃度表達(dá)的，并且在心臟、肝臟、大腦、腎臟、睪丸、WAT、BAT和骨骼肌中也檢測(cè)到了表達(dá)。
至于UCP2功能，在食用高脂肪飲食的小鼠體內(nèi)，觀察到在附睪周?chē)闹窘M織中UCP2基因表達(dá)的上調(diào)。不過(guò)，據(jù)報(bào)導(dǎo)，UCP2剔除小鼠在寒冷條件下，在體溫保持功能方面是正常的(Arsenijevic D.等，Nature Genet，26，387-388(2000))。另外，在上述UCP1剔除小鼠中觀察到了褐色脂肪組織中UCP2的表達(dá)得到充分上調(diào)，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是代償作用，并且所述小鼠不耐寒(Enerback，F(xiàn).等，Nature，387，90-94(1997))。另外，業(yè)已證實(shí)UCP2能通過(guò)改變胰腺β細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)ATP濃度，抑制胰島素分泌(Zhang C.-Y.等，Cell，105，745-755(2001))。對(duì)于糖尿病治療來(lái)說(shuō)，這是一種不利的特征。如上文所述，對(duì)于UCP2來(lái)說(shuō)，到目前為止，與能量消耗/肥胖的關(guān)系尚未搞清楚，盡管業(yè)已證實(shí)了其質(zhì)子通道的解偶聯(lián)功能。
體內(nèi)的多余能量，最初主要是作為內(nèi)臟脂肪積累的(特別是作為腸系膜脂肪)。與其他部位的脂肪(特別是皮下脂肪)相比，內(nèi)臟脂肪容易受到脂肪動(dòng)員(adipokinetic)作用，快速地分解和消耗。內(nèi)臟脂肪(肥胖)被認(rèn)為是導(dǎo)致與生活方式相關(guān)的疾病(成年人疾病)的多重危險(xiǎn)因素。其原因是從WAT中的白色脂肪細(xì)胞(WA)中分泌的脂肪酸通過(guò)門(mén)靜脈直接流入肝臟，促進(jìn)了胰島素耐受性和脂肪合成，其結(jié)果是，誘導(dǎo)了糖耐受性異常、高血壓和高血脂，并且，這些疾病最終并發(fā)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化。因此，預(yù)計(jì)抑制內(nèi)臟脂肪的積累和減少內(nèi)臟脂肪的積累，能有效預(yù)防與生活方式相關(guān)的疾病(如成年人的糖尿病)的發(fā)生，并且治療所述疾病。
過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體(PPAR)在它的結(jié)構(gòu)等方面被認(rèn)為是核受體(核激素受體)超家族的一員。到目前為止，業(yè)已鑒定了三種類(lèi)型的PPAR亞型，這三種亞型是PPARα，PPARδ(又稱(chēng)為NUC-1、PPARβ或FAAR)和PPARγ，并且業(yè)已克隆了它們的基因(cDNA)(Lemberger等，Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.，12，335-363(1996))。
據(jù)報(bào)導(dǎo)，貝特(fibrate)藥劑對(duì)三種類(lèi)型PPAR中的PPARα具有配體作用，在臨床上表現(xiàn)出對(duì)血清甘油三酯含量的很強(qiáng)的降低作用(Forman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94，4312-4317(1997))。
PPARγ主要是在脂肪組織中表達(dá)的，并且據(jù)報(bào)導(dǎo)，PPARγ是與調(diào)控脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的因子(Tontonoz等，Genes andDevelopment，8，1224-1234(1994)；和Tontonoz等，Cell，79，1147-1156(1994))。各種類(lèi)型的噻唑烷二酮衍生物，在非胰島素依賴(lài)型糖尿病(NIDDM)的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出降血糖作用，并且預(yù)期可以作為NIDDM的新型治療劑，它具有胰島素抗性解除作用。最近的研究證實(shí)了噻唑烷二酮衍生物還具有作為PPARγ的配體的作用，并且能專(zhuān)一性地激活PPARγ(Lehman等，J.Biol.Chem.，270，12953-12956(1995))。
不過(guò)，尚未搞清楚PPARδ的生理學(xué)功能(Willson等，J.Med.Chem.，43(4)，527-550(2000))。WO97/28149披露了一種具有血液HDL提高作用的PPARδ配體，而WO99/04815披露了施用PPARδ受體激活物質(zhì)能夠降低膽甾醇含量。不過(guò)，沒(méi)有說(shuō)明或暗示PPARδ和產(chǎn)熱促進(jìn)作用與PPARδ和解偶聯(lián)蛋白之間的相關(guān)性。
另外，已知諸如花生四烯酸、卡巴前列環(huán)素(carbaprostacyclin，cPGI)、L-165041(4-(3-(2-丙基-3-羥基-4-乙酰-苯氧基)丙氧基)-苯氧基乙酸)的不飽和脂肪酸，能增強(qiáng)UCP2的表達(dá)(The Journal ofBiological Chemistry，Vol.276，No.14，Issue of April 6，pp.10853-10860，2001)。不過(guò)，沒(méi)有有關(guān)UCP1和PPARδ之間的相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，以及含有所述物質(zhì)作為有效成分的藥劑。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提供一種抗糖尿病藥劑，抗肥胖藥劑和用于減少內(nèi)臟脂肪積累或抑制內(nèi)臟脂肪積累的藥劑。
本發(fā)明的發(fā)明人關(guān)注的是由nST對(duì)體內(nèi)能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)的刺激而產(chǎn)生的產(chǎn)熱促進(jìn)作用。他們?cè)噲D促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸，促進(jìn)BAT線粒體中的質(zhì)子泄漏(相對(duì)nST組織而言是比較小的)，促進(jìn)WAT線粒體中的質(zhì)子泄漏，并且促進(jìn)UCP1(解偶聯(lián)蛋白的同系物)的功能，由此提高它們的效率。
本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)卡巴前列環(huán)素(cPGI6，9α-亞甲基-11α，15S-二羥基-prosta-5E，13E-二烯-1-酸)和伊洛前列素(Iloprost，5-{(E)-(1S，5S，6R，7R)-7-羥基-6-[(E)-(3S，4RS)-3-羥基-4-甲基-5-辛-6-烯]-雙環(huán)[3.3.0]-3-亞辛基}戊酸)(它們是非專(zhuān)一性PPAR配體)，在骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中具有UCP1表達(dá)促進(jìn)作用。
這一新的發(fā)現(xiàn)與以下發(fā)現(xiàn)組合在一起貝特化合物和Wy14643(它們是PPARα的配體)，以及噻唑烷二酮化合物(它們是PPARγ的配體)，幾乎不表現(xiàn)UCP1表達(dá)促進(jìn)作用。根據(jù)這一組合發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人推測(cè)PPARδ主要參與UCP1表達(dá)促進(jìn)作用，并且他們還對(duì)具有PPARδ激活作用的化合物做了進(jìn)一步的研究。
結(jié)果，通過(guò)使用人類(lèi)或嚙齒類(lèi)動(dòng)物的骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)具有PPARδ激活作用的物質(zhì)表現(xiàn)出UCP1表達(dá)促進(jìn)作用。
另外，基于UCP基因的表達(dá)是由PPARδ調(diào)控這一事實(shí)，本發(fā)明的發(fā)明人證實(shí)了可以通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用，篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)，它能增強(qiáng)UCP1基因的表達(dá)并且促進(jìn)nST功能。
因此，本發(fā)明包括以下主題(1)篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
(2)篩選具有促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
(3)篩選具有促進(jìn)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子泄漏作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
(4)篩選能增加UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
(5)篩選能促進(jìn)脂肪酸β氧化作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
(6)如上述(1)-(5)中任一項(xiàng)的篩選物質(zhì)的方法，該方法利用了報(bào)導(dǎo)基因。
(7)如第(6)項(xiàng)中的篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，該方法包括下面①-③的步驟①讓具有PPARδ激活作用的物質(zhì)與能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞接觸和/或?qū)胨黾?xì)胞，②測(cè)定UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量，和③篩選能提高所述UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量的化合物。
(8)如第(7)項(xiàng)中的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞。
(9)如第(7)項(xiàng)中的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
(10)具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(11)促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(12)促進(jìn)線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(13)提高UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(14)促進(jìn)脂肪酸β氧化的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(15)如上述(10)-(14)中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質(zhì)是非專(zhuān)一性PPAR配體或PPARδ配體。
(16)如上述(10)-(14)中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質(zhì)是卡巴前列環(huán)素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸。
(17)如(11)-(13)中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于骨骼肌、白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
(18)如(11)-(13)中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
(19)抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
(20)抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有如(10)-(18)中任一項(xiàng)的藥劑作為有效成分。
附圖簡(jiǎn)述

圖1表示通過(guò)PPARδ配體之外的各種類(lèi)型的測(cè)試化合物在人類(lèi)脂肪細(xì)胞中誘導(dǎo)的UCP1 mRNA表達(dá)量。
圖2表示通過(guò)PPARδ配體或各種類(lèi)型的測(cè)試化合物在人類(lèi)脂肪細(xì)胞中誘導(dǎo)的UCP2 mRNA表達(dá)量。
圖3表示通過(guò)PPARδ配體或各種類(lèi)型的測(cè)試化合物在人類(lèi)脂肪細(xì)胞中導(dǎo)致的游離脂肪酸β氧化作用的促進(jìn)程度。
實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明的具有能專(zhuān)一性地增強(qiáng)nST組織的線粒體中質(zhì)子泄漏等作用的藥劑，包括具有PPARδ激活作用的化合物或其衍生物作為有效成分。本發(fā)明的所述藥劑可以是上述有效成分本身或者是含有所述成分的合適的配合物、組合物或混合物。另外，具有PPARδ激活作用的化合物，表示能通過(guò)像“PPAR配體”那樣與PPAR結(jié)合，調(diào)控PPAR的靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能的化合物。所述化合物不局限于天然存在的化合物，而且還包括人工合成的化合物。
為了說(shuō)明上述有效成分的作用，通過(guò)向?qū)嵤├兴镜母鞣N類(lèi)型的骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中添加各種類(lèi)型的PPAR配體，測(cè)定UCP1的mRNA的數(shù)量。結(jié)果，證實(shí)了與測(cè)定的PPARα和PPARγ配體相比，PPARδ配體表現(xiàn)出UCP1的mRNA的明顯更大數(shù)量的表達(dá)。PPARδ配體的例子包括p-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸(YM-16638)，該配體作為具有例如降血液膽甾醇活性作用的化合物披露于WO9904815中。
可以使用報(bào)導(dǎo)基因，通過(guò)一種簡(jiǎn)單方法，以很高的靈敏度確定一種物質(zhì)的PPAR結(jié)合程度和/或激活程度。例如，以下方法是已知的使用融合蛋白表達(dá)載體的方法，該載體是通過(guò)將酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合而獲得的，以及使用一種動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中，業(yè)已轉(zhuǎn)導(dǎo)了含有與GAL4響應(yīng)序列(GAL4結(jié)合元件)連接的報(bào)導(dǎo)基因的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒(WO96/33724；Lehmann等，J.Biol.Chem.，270，12953-12956(1995)；和Willson等，J.Med.Chem.，39，665-668(1996))。使用報(bào)導(dǎo)基因的方法是按以下方式實(shí)施的首先，當(dāng)測(cè)試化合物是諸如能結(jié)合或激活PPAR的物質(zhì)時(shí)，該測(cè)試化合物與GAL4的PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。于是，與PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合的GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的GAL4響應(yīng)因子結(jié)合，以便啟動(dòng)所述報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)。通過(guò)測(cè)定由所述報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)的蛋白的活性等，就是說(shuō)通過(guò)檢測(cè)所述報(bào)導(dǎo)物活性，可以確定所述測(cè)試化合物是PPAR結(jié)合化合物或PPAR激活化合物，或者不是。
因此，在篩選能結(jié)合PPAR的未知配體時(shí)，或在確定一種測(cè)試化合物是否是PPAR結(jié)合配體的檢驗(yàn)中，檢測(cè)和分離天然或人工合成的配體是可行的。另外，報(bào)導(dǎo)物活性的檢測(cè)可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)，通過(guò)根據(jù)報(bào)導(dǎo)基因的類(lèi)型，從染色、熒光、細(xì)胞活性中選擇的指標(biāo)適當(dāng)?shù)赝瓿伞?br> 另外，在本發(fā)明的篩選方法中，在上述系統(tǒng)中選擇性地增加以下步驟，以便檢測(cè)報(bào)導(dǎo)物活性(a)讓一種測(cè)試樣品與UCP1基因表達(dá)細(xì)胞接觸或?qū)朐摷?xì)胞，(b)測(cè)定UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量，和(c)篩選能增加UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量的化合物。
被用于篩選的“UCP1基因表達(dá)細(xì)胞”沒(méi)有特別限制，優(yōu)選的是諸如白色脂肪細(xì)胞或褐色脂肪細(xì)胞的脂肪細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是從動(dòng)物組織中分離的原代培養(yǎng)細(xì)胞，或通過(guò)細(xì)胞的癌化或不死化制備的建立細(xì)胞系。作為脂肪細(xì)胞，例如，各種類(lèi)型的脂肪細(xì)胞，如披露于以下實(shí)施例中的人類(lèi)白色脂肪細(xì)胞、大鼠褐色脂肪細(xì)胞、3T3-L1(小鼠脂肪細(xì)胞)可以?xún)?yōu)選使用，而作為骨骼肌細(xì)胞，例如，各種類(lèi)型的骨骼肌細(xì)胞，如SkMC(人骨骼肌細(xì)胞)和C2C12(小鼠骨骼肌細(xì)胞)可以?xún)?yōu)選使用。另外，UCP家族(解偶聯(lián)蛋白同系物)基因的例子包括UCP1基因、UCP2基因、UCP3基因、UCP4基因。
在本發(fā)明篩選方法的一個(gè)步驟中，讓測(cè)試樣品與能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞接觸和/或?qū)朐摷?xì)胞，并且測(cè)定UCP1基因的表達(dá)量。為了測(cè)定所述基因的表達(dá)量，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種類(lèi)型的方法。所述基因表達(dá)的測(cè)定可以通過(guò)測(cè)定DNA、RNA或蛋白的量實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)Northern印跡方法(Sambrook等，Molecular Cloning，201-206，(1987)，Cold Spring Harbor Laboratory)，RT-PCR方法(Shaffer等，Anal.Biochem.，190，292-296(1990))等。
當(dāng)通過(guò)所述測(cè)定檢測(cè)到UCP1基因表達(dá)的顯著增強(qiáng)時(shí)，所述測(cè)試樣品的化合物就被認(rèn)為具有促進(jìn)nST功能的作用。UCP1的表達(dá)是在nST組織的細(xì)胞中的線粒體中燃燒脂肪或糖所必需的。不過(guò)，本發(fā)明的有效成分，具有顯著提高UCP1在上述組織的細(xì)胞中的表達(dá)量的作用。通過(guò)以上分子水平上的發(fā)現(xiàn)可以了解，本發(fā)明的藥劑能有效抑制內(nèi)臟脂肪積累和減少內(nèi)臟脂肪積累。
實(shí)際上，在實(shí)施例中，為了證實(shí)UCP(其表達(dá)是由PPARδ促進(jìn)的)能夠發(fā)揮抑制或減少內(nèi)臟脂肪積累的作用，就是說(shuō)加速細(xì)胞內(nèi)死亡和糖類(lèi)的燃燒，將各種類(lèi)型的PPAR配體添加到所述原代人脂肪細(xì)胞中，并且測(cè)定脂肪酸β氧化作用(已知這種氧化作用是脂肪酸燃燒促進(jìn)作用的指標(biāo))。正如在實(shí)施例中具體示出的，對(duì)脂肪酸β氧化作用的促進(jìn)，與UCP表達(dá)量成正比。在PPARδ配體中，對(duì)脂肪酸β氧化作用的促進(jìn)最強(qiáng)。
本發(fā)明的藥劑具有提高內(nèi)膜穿透型蛋白UCP1在諸如骨骼肌和脂肪的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱組織細(xì)胞的線粒體中的表達(dá)量的作用，它與nST相關(guān)，特別是與促進(jìn)上述細(xì)胞的線粒體中的解偶聯(lián)呼吸、質(zhì)子泄漏和產(chǎn)熱相關(guān)。本發(fā)明的藥劑包括具有PPARδ激活作用的化合物或它的衍生物作為有效成分，并且它具有高度表達(dá)UCP1的作用，其中，所述作用大大提高了UCP1在諸如上述脂肪和骨骼肌的nST組織中的細(xì)胞表達(dá)量?？梢愿鶕?jù)UCP1表達(dá)活性鑒定、分離和純化本發(fā)明的藥劑。通過(guò)作為有效成分化合由此獲得的物質(zhì)，可以制備用于降低內(nèi)臟脂肪積累量或用于抑制內(nèi)臟脂肪積累的、特別是對(duì)抗肥胖具有顯著作用的藥劑。
本發(fā)明的藥劑可用于和治療肥胖，特別是治療哺乳動(dòng)物(例如人類(lèi)、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、貓、馬、兔子等)或禽類(lèi)的肥胖，因?yàn)樗艽龠M(jìn)能量代謝和脂肪代謝，并且降低血脂。另外，它還可用于預(yù)防或治療與肥胖并發(fā)的疾病(例如，成年人疾病，如糖尿病、高血壓、高血脂、動(dòng)脈硬化或缺血性心臟病)等。
作為所述降低藥劑或抑制藥劑的載體，可以根據(jù)使用模式使用合適的填充劑、結(jié)合劑、增量劑、崩解劑、表面活性劑、防濕劑、賦形劑、稀釋劑等。藥劑的形狀可以根據(jù)使用目的適當(dāng)?shù)卮_定，并且沒(méi)有特殊限制。所述藥劑的例子包括固體藥劑(如片劑、顆粒、粉末、丸劑和膠囊)，液體藥劑，懸浮劑、乳劑等。通過(guò)這種方式獲得的抗糖尿病藥劑，抗肥胖藥劑，減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，優(yōu)選是通過(guò)口服施用的。所述劑量是根據(jù)要治療的患者的癥狀等適當(dāng)確定的。因此，每天服用的劑量和次數(shù)等沒(méi)有特殊限制。
實(shí)施例下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，不過(guò)，本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例。在以下實(shí)施例中，每一種操作都是按照披露于“Molecular Cloning”中的方法進(jìn)行的(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T，Cold Spring Harbor Laboratory Press)，除非另有說(shuō)明。
藥劑對(duì)誘導(dǎo)UCP1和UCP2 mRNA在人類(lèi)白色脂肪細(xì)胞中表達(dá)的影響(1)人類(lèi)白色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和RNA的制備人類(lèi)脂肪細(xì)胞，來(lái)自皮下脂肪組織的未分化的冷凍原脂肪細(xì)胞(Cat.No.SP-F，Lot.No.L011399)是從美國(guó)ZenBio公司購(gòu)買(mǎi)的。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明，在24孔平板上培養(yǎng)所述細(xì)胞，并且分化成脂肪細(xì)胞。將所培養(yǎng)的細(xì)胞用作人類(lèi)白色脂肪組織衍生的脂肪細(xì)胞。具體地講，通過(guò)使用24孔平板在二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37℃下在原脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述原脂肪細(xì)胞，直到達(dá)到鋪滿(mǎn)狀態(tài)。然后，將所述培養(yǎng)基更換成分化培養(yǎng)基，并且再繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，以便誘導(dǎo)分化。另外，將所述培養(yǎng)基更換成脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基，并且進(jìn)行14天培養(yǎng)，以便獲得完全分化的白色脂肪細(xì)胞。在以下條件下，對(duì)所述培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的培養(yǎng)。
將各種類(lèi)型的測(cè)試化合物分別添加到培養(yǎng)基中，使它的最終濃度為10μM，并且將所述細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)(n＝3)。所述測(cè)試化合物是PPARα配體必降脂(Bezafibrate)、WY14643、PPARδ配體YM-16638、PPARγ配體曲格列酮(Troglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone)、非專(zhuān)一性PPAR配體cPGI、伊洛前列素、β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑L755507。通過(guò)添加DMSO制備對(duì)照，它是所述測(cè)試化合物的溶劑，使它的最終濃度為0.5％，并且以與測(cè)試化合物相同的方式用它進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于每一種測(cè)試化合物或?qū)φ諄?lái)說(shuō)，回收培養(yǎng)的細(xì)胞，將它們懸浮在150微升的細(xì)胞裂解緩沖液(RLT溶液，由QIAGEN公司生產(chǎn))中，然后裂解細(xì)胞，以便獲得細(xì)胞提取物。通過(guò)使用RNA制備試劑盒(商品名RNeasy總RNA試劑盒，由QIAGEN公司生產(chǎn))按照該試劑盒所附帶的說(shuō)明書(shū)，從所述細(xì)胞提取物中制備總RNA。
(2)UCP1 mRNA表達(dá)量的測(cè)定通過(guò)使用上面所獲得的總RNA(大約0.1微克)作模板，按下文所述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，以便測(cè)定UCP1 mRNA表達(dá)量。
作為人UCP1基因的PCR引物，使用了兩種類(lèi)型的寡核苷酸5’-AACCCACAGAGGTCGTGAAAG-3’(正向引物)和5’-CGTGTAGCGAGGTTTGATTCC-3’(反向引物)。作為PCR探針，使用了5’-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3’，所述探針是用一種熒光染料FAM標(biāo)記過(guò)的。另外，G3PDH mRNA的測(cè)定是按照PEApplied Biosystems推薦的方法進(jìn)行的，該測(cè)定是與2-Reporter Assay同時(shí)進(jìn)行的。所述引物是由Amersham-Pharmacia Biotech公司化學(xué)合成的，而所述探針是由PE Applied Biosystems公司化學(xué)合成的(包括用所述熒光染料標(biāo)記)。
通過(guò)使用待測(cè)定的制備的總RNA，上面所提到的引物和探針，以及通過(guò)商業(yè)渠道獲得的實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR試劑盒(TaqMan EZ RT-PCR CoreReagent Kit(商品名)，由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))制備表1所示的反應(yīng)溶液，表中所示出的用量相應(yīng)于一個(gè)反應(yīng)試管。


將25微升如上制備的反應(yīng)溶液放入PCR Perkin Elmer MicroampOptical Tuber(商品名，由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，并且用一個(gè)蓋子密封所述試管。將該試管放在ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系統(tǒng)(商品名，由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))，并且在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)。
在50℃下用50分鐘時(shí)間由UNG分解DNA污染物，在60℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄處理10分鐘，并且在95℃下加熱2分鐘使UNG失活。在隨后的PCR反應(yīng)中，在95℃下進(jìn)行15秒鐘的變性處理，并且在58℃下進(jìn)行90秒鐘的退火處理(循環(huán)次數(shù)40循環(huán))。在該反應(yīng)開(kāi)始之后，通過(guò)實(shí)時(shí)處理自動(dòng)確定熒光強(qiáng)度，以便測(cè)定UCP1 mRNA表達(dá)量。UCP1mRNA表達(dá)量是通過(guò)一種相對(duì)值表示的，該相對(duì)值是通過(guò)將被用作空白對(duì)照的參考樣品中的量設(shè)定為100，并且通過(guò)G3PDH mRNA表達(dá)量對(duì)所述值進(jìn)行校正而計(jì)算的。
結(jié)果如圖1所示。PPARδ配體(具有激活PPARδ的作用的化合物)YM-16638能夠?qū)CP1 mRNA表達(dá)量提高到對(duì)照表達(dá)量的大約12倍。這表明，PPARδ配體能有效促進(jìn)所述表達(dá)。由于該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PPARδ配體能專(zhuān)一性地增強(qiáng)UCP1基因，很顯然，PPARδ配體對(duì)WAT的功能的促進(jìn)作用，是由于PPARδ配體對(duì)WAT的直接作用。UCP1表達(dá)的顯著加強(qiáng)不僅出現(xiàn)在嚙齒類(lèi)動(dòng)物，而且還出現(xiàn)在人類(lèi)的白色脂肪細(xì)胞中這一事實(shí)表明，PPARδ配體對(duì)于人類(lèi)糖尿病和肥胖來(lái)說(shuō)是極其有效的。
(3)UCP2 mRNA表達(dá)量的測(cè)定通過(guò)使用在上面的第(1)項(xiàng)獲得的總RNA(大約0.1微克)作模板，通過(guò)與上述第(2)項(xiàng)相同的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，測(cè)定UCP2 mRNA表達(dá)量。作為人類(lèi)UCP2基因的PCR引物，使用了兩種類(lèi)型的寡核苷酸5’-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3’(正向引物)和5’-GCCCTTGGTGTAGAACTGTTTGA-3’(反向引物)。作為PCR探針，使用了5’-TGTCCGCATCGGCCTGTATGATTC-3’。所述探針用一種熒光染料FAM標(biāo)記。
結(jié)果如圖2所示。PPARδ配體(具有激活PPARδ的作用的化合物)YM-16638能夠?qū)CP2 mRNA表達(dá)量提高到對(duì)照表達(dá)量的大約2倍。
藥劑對(duì)人類(lèi)白色脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸β氧化的影響按與實(shí)施例1相同的方法制備人類(lèi)完全分化的白色脂肪細(xì)胞，然后除去上清液，添加500微升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是通過(guò)向脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中添加適量的油酸和棕櫚酸，使它們的濃度分別為0.67mM和0.33mM而制備的。將各種類(lèi)型的測(cè)試化合物添加到所述培養(yǎng)基中，使它們的最終濃度為10μM，然后向每一個(gè)孔中添加[9，10(n)-3H]棕櫚酸(由Amersham Phamacia公司生產(chǎn))，最終濃度為1μCi/毫升)，并且，在37℃下培養(yǎng)所述細(xì)胞48小時(shí)。所述測(cè)試化合物是PPARδ配體的YM-16638，PPARα配體的WY14643，β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑的L755507和PPARγ配體的Rosiglitazone。通過(guò)添加DMSO制備對(duì)照，DMSO是所述測(cè)試化合物的溶劑，使它的最終濃度為0.5％，并且以與測(cè)試化合物相同的方式培養(yǎng)。為了防止在培養(yǎng)期間由于細(xì)胞對(duì)[9，10(n)-3H]棕櫚酸的β氧化所產(chǎn)生的3H2O的蒸發(fā)，用由住友Bakelite公司生產(chǎn)的微型培養(yǎng)濾膜(MS-30055)對(duì)培養(yǎng)平板進(jìn)行密封。
在培養(yǎng)48小時(shí)之后，將培養(yǎng)基的200微升上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5毫升的Eppendorf管中，添加50微升50％的三氯乙酸，并且將該試管放在冰上保持30分鐘，以便產(chǎn)生沉淀，并且以15000rpm的速度離心該混合物10分鐘。然后，將沒(méi)有蓋子的1.5毫升Eppendorf管放入事先在它里面放入了500微升蒸餾水的20毫升的玻璃瓶中，將上面所獲得的上清液的總量放入該Eppendorf管，并且用聚丙烯封裝蓋緊密密封所述玻璃瓶。在50℃下對(duì)所述玻璃瓶進(jìn)行加熱18小時(shí)，以便所述玻璃瓶?jī)?nèi)部被3H2O飽和，在4℃下對(duì)所述玻璃瓶進(jìn)行冷卻之后，再進(jìn)行離心(1000rpm，1分鐘)。丟棄瓶中Eppendorf管中殘留的上清和Eppendorf管。向留在所述玻璃瓶中的含有3H2O的蒸餾水中添加5毫升液體閃爍混合物(Ultima Gold，由Packard公司生產(chǎn))，并且在充分混合之后測(cè)定放射性。
結(jié)果如圖3所示。10μM的PPARδ配體YM16638將所述細(xì)胞的β氧化作用提高了30％。另一方面，10μM的PPARγ配體Rosiglitazone具有15％的增強(qiáng)作用，而10μM的PPARα配體WY14643和10μM的β3腎上腺素能受體激動(dòng)劑L755507的β氧化，沒(méi)有表現(xiàn)出增強(qiáng)作用。以上結(jié)果表現(xiàn)出與在實(shí)施例1中觀察到的各種類(lèi)型的PPAR配體對(duì)UCP1 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用的良好的相關(guān)性。就是說(shuō)，PPARδ配體通過(guò)促進(jìn)UCP1基因表達(dá)提高了UCP1蛋白的數(shù)量，以便增強(qiáng)用游離脂肪酸作底物的β氧化。所述β氧化作用是UCP1的功能之一。這表明PPARδ配體能促進(jìn)能量代謝，并且抑制或減少內(nèi)臟脂肪積累。以上結(jié)果表明PPARδ配體能有效抗人類(lèi)糖尿病和肥胖。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明獲得了一種具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用等的物質(zhì)，并且獲得了諸如抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑的含有所述物質(zhì)的藥劑。
序列表<110>帝人公司山岡一良高木健一郎片岡健一郎山本真則近西俊洋<120>通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用篩選物質(zhì)的方法和藥劑<130>T-456<150>JP P2001-216502<151>2001-7-17<160>6<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人UCP1基因PCR的正向引物<400>1aacccacaga ggtcgtgaaa g 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人UCP1基因PCR的反向引物<400>2cgtgtagcga ggtttgattc c 21<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人UCP1基因PCR的探針<400>3cagacttcaa gcatagagcc atctcca 27<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人UCP2基因PCR的正向引物<400>4cgccaaatga gctttgcct 19<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人UCP2基因PCR的反向引物<400>5gcccttggtg tagaactgtt tga 23<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人UCP2基因PCR的探針<400>6tgtccgcatc ggcctgtatg attc 2權(quán)利要求
1.篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
2.篩選具有促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
3.篩選具有促進(jìn)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子泄漏作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
4.篩選能增加UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
5.篩選能促進(jìn)脂肪酸β氧化作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPARδ激活作用。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的篩選物質(zhì)的方法，該方法利用了報(bào)導(dǎo)基因。
7.權(quán)利要求6的篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，該方法包括下面(1)-(3)的步驟(1)讓具有PPARδ激活作用的物質(zhì)與能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞接觸和/或?qū)胨黾?xì)胞；(2)測(cè)定UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量；(3)篩選能提高所述UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量的化合物。
8.權(quán)利要求7的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞。
9.權(quán)利要求7的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞是脂肪細(xì)胞。
10.具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
11.促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
12.促進(jìn)線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
13.提高UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
14.能促進(jìn)脂肪酸β氧化的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
15.權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質(zhì)是非專(zhuān)一性PPAR配體或PPARδ配體。
16.權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPARδ激活作用的物質(zhì)是卡巴前列環(huán)素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基苯氧基)-丙氧基)苯乙酸。
17.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于骨骼肌、白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
18.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
19.抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
20.抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有權(quán)利要求10-18中任一項(xiàng)的藥劑作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選包含具有PPARδ激活作用的化合物的產(chǎn)熱促進(jìn)物質(zhì)；含有所述化合物的藥物；以及具有抗糖尿病、抗肥胖或減少內(nèi)臟積累脂肪作用的藥物。本發(fā)明提供一種藥劑，其包含具有激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體PPARδ的作用的化合物，并且具有促進(jìn)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱(nST)，特別是促進(jìn)在脂肪組織等的細(xì)胞中的線粒體解偶聯(lián)呼吸或線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏，和提高UCP1表達(dá)量的作用；本發(fā)明也提供含有上述化合物的抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑和減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑。另外，本發(fā)明還提供了通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用篩選化合物的方法。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1533504SQ02814450
公開(kāi)日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2002年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月17日
發(fā)明者山岡一良, 高木健一郎, 片岡健一郎, 山本真則, 近西俊洋, 一郎, 則, 洋 申請(qǐng)人:帝人株式會(huì)社