本發(fā)明涉及表面等離子共振譜儀抗污染芯片制備領(lǐng)域，特別是涉及一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法。

背景技術(shù)：

表面等離子共振(Surface Plasmon Resonance，簡(jiǎn)稱SPR)儀是20世紀(jì)80年代出現(xiàn)的一種生物傳感器技術(shù)，當(dāng)入射光從高折射率介質(zhì)入射到低折射率介質(zhì)時(shí)，會(huì)發(fā)生全反射，此時(shí)若在介質(zhì)交界面處鍍一層金屬薄膜(金或銀)，入射光產(chǎn)生的漸逝波會(huì)引起金屬表面自由電子發(fā)生集體振蕩，進(jìn)而形成等離子體，當(dāng)漸逝波與表面等離子體振蕩的頻率和波數(shù)相等時(shí)，即產(chǎn)生共振現(xiàn)象(SPR)，導(dǎo)致能量從漸逝波轉(zhuǎn)移到表面等離子波中，使反射光的強(qiáng)度大大減弱，呈現(xiàn)衰減全反射現(xiàn)象，當(dāng)反射光的強(qiáng)度為零時(shí)的入射角稱為共振角。共振角與金屬薄膜界面介質(zhì)折射率有關(guān)，而折射率又隨結(jié)合在金屬薄膜表面的分子質(zhì)量而變化，故可通過分析共振角來獲得分子間相互作用的信息，由于其具有檢測(cè)快速且無需標(biāo)記等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物研發(fā)、臨床診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域，并且顯示出廣闊的應(yīng)用前景。

SPR芯片是表面等離子共振儀最為核心的組件，提供產(chǎn)生SPR信號(hào)的必須物理?xiàng)l件，主要包括耦合器件、金屬膜和表面基質(zhì)。然而，應(yīng)用表面等離子共振儀進(jìn)行分析測(cè)試時(shí)，傳感芯片的表面污染是一個(gè)普遍存在的問題，來自樣品中的生物分子或微生物的非特異性吸附將降低定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，開發(fā)有效抵抗非特異性吸附的表面是提高表面等離子共振傳感器靈敏度和精確度的首要問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片及其制備方法，該方法制得的芯片具有超強(qiáng)的抗蛋白能力。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案加以實(shí)現(xiàn)的：

一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法，包括以下步驟：

a)裸金芯片制備：采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)，先在基底上涂覆一層2-3nm厚的鉻層，再涂一層45-50nm厚的金膜，得到裸金芯片；

b)裸金芯片預(yù)處理：將步驟a)得到的裸金芯片浸入食人魚洗液中，常溫下浸泡1-2h，然后取出，用去離子水清洗后，再用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?/p>

c)兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體的合成：用20mL去離子水溶解24.98mmol半胱氨酸，向其中加入27.47mmol 2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于15-40℃下攪拌反應(yīng)1-3h，反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，將得到的單體水溶液通過凍干得到白色粉末；

d)裸金芯片表面聚乙烯亞胺修飾：用三羥甲基氨基甲烷緩沖液配制1‐3mg/mL多巴胺溶液，將步驟b)得到的芯片浸入其中，于30～60℃下孵育1‐3h，然后取出，用去離子水清洗后，用氮?dú)獯蹈?，得到聚多巴胺修飾的芯片?/p>

將上述聚多巴胺修飾的芯片浸入0.1-0.5g/mL超支化的聚乙烯亞胺水溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6-18h，然后用去離子水清洗，再用氮?dú)獯蹈桑糜谡婵崭稍锵渲袀溆茫?/p>

e)聚乙烯亞胺芯片表面溴代異丁酰溴引發(fā)劑修飾：將77μL三乙胺和64μL溴代異丁酰溴先后逐滴加入冰浴且攪拌條件下的10ml四氫呋喃中，將步驟d)所得的芯片浸入其中，于冰浴且攪拌條件下反應(yīng)1‐3h，然后取出，用乙醇和去離子水依次清洗后，用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?/p>

f)裸金芯片表面聚甲基丙烯基半胱氨酸合成：將步驟e)所得的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮?dú)獾氖﹤惪似恐?，?mmol步驟c)制得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體溶解于4ml去離子水中，氮?dú)饷摎?0‐20min，然后向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，氮?dú)饷摎?0‐20min，超聲5‐10min；然后將溶液移入施倫克瓶中并浸沒芯片，于氮?dú)鈼l件下反應(yīng)2‐4h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水清洗，然后用氮?dú)獯蹈蓚溆茫?/p>

所述基底為玻璃片或光纖。優(yōu)選的是，所述玻璃片為BK7玻璃片。

所述的步驟a)中所述食人魚洗液為98wt％的濃硫酸與30wt％的雙氧水按體積比7:3制成的混合溶液。

所述的步驟b)、d)中，用去離子水清洗的次數(shù)均為3次，步驟e)、f)中依次用乙醇和去離子水各清洗3次。

優(yōu)選的是，所述的步驟c)中，于25℃攪拌反應(yīng)2h。

優(yōu)選的是，所述的步驟d)中，三羥甲基氨基甲烷緩沖液的pH＝8.5。

優(yōu)選的是，所述的步驟d)中，將聚多巴胺修飾的芯片浸入超支化的聚乙烯亞胺水溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)時(shí)間為12h。

本發(fā)明的方法制得的芯片包括BK7玻璃片基底，上面鍍有2‐3nm的鉻層和45‐50nm的金膜層。甲基丙烯基半胱氨酸單體通過“巰烯”點(diǎn)擊反應(yīng)獲得，引發(fā)劑通過金膜表面的聚乙烯亞胺而修飾到表面，進(jìn)而通過表面引發(fā)的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法引發(fā)單體在金膜表面聚合，從而獲得一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片。

本發(fā)明的有益效果如下：

1.本發(fā)明的方法制備的SPR芯片對(duì)單一蛋白溶液(牛血清蛋白、溶菌酶、纖維蛋白原)及天然復(fù)雜樣品體系(100％血清、豆?jié){、牛奶)均具有超強(qiáng)的抗污染性能。

2.本發(fā)明制備的SPR芯片對(duì)生物大分子如抗體具有高固載量和良好的相容性，可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白體系(100％血清)中目標(biāo)分子的高靈敏、無標(biāo)記快速檢測(cè)，該芯片具有生物功能化作用，可通過固載羊免疫球蛋白抗體進(jìn)而檢測(cè)其抗原。

3.本發(fā)明制備的SPR芯片具有很高的穩(wěn)定性，干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存1個(gè)月或pH為7.4的磷酸鹽緩沖液中儲(chǔ)存7天后，抗污染性能無變化。

4.本發(fā)明的制備方法雖然是在金膜表面修飾超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸，但該方法同樣適用于很多其他材料的膜表面，對(duì)膜表面的材質(zhì)有一定的普適性，不受限于基底材料的性質(zhì)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法制備的基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的SPR芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2a、2b分別為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例制備的SPR芯片對(duì)1mg/mL的溶菌酶、牛血清蛋白、纖維蛋白原的單一蛋白體系以及100％人血清、牛奶、豆?jié){的復(fù)雜體系中蛋白的非特異性吸附量。

其中：

1-玻璃片基底，2-鉻層，3-金膜層，4-聚乙烯亞胺層，5-超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸層。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法，包括以下步驟：

a)采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)，在BK7玻璃基底上涂覆一層2nm厚的鉻層和一層48nm厚的金膜，得到裸金芯片。

b)將裸金芯片浸入98wt％的濃硫酸與30wt％的雙氧水(體積比7:3)混合溶液中，常溫下浸泡2h，然后取出，用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

c)甲基丙烯基半胱氨酸單體的合成：用20mL去離子水溶解24.98mmol半胱氨酸，向其中加入27.47mmol 2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于20℃下攪拌反應(yīng)2h。反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，得到的單體水溶液通過凍干得到白色粉末。

d)裸金芯片表面聚乙烯亞胺修飾：用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH＝8.5)配制2mg/mL多巴胺溶液，將步驟b)得到的裸金芯片浸入多巴胺溶液中，于40℃下孵育2h，然后取出，用去離子水清洗3次后，用氮?dú)獯蹈伞?/p>

將聚多巴胺修飾的芯片浸入0.2g/mL超支化的聚乙烯亞胺水溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12h，然后用去離子水清洗3次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

e)聚乙烯亞胺芯片表面溴代異丁酰溴引發(fā)劑修飾：將77μL三乙胺和64μL溴代異丁酰溴先后逐滴加入冰浴且攪拌條件下的10ml四氫呋喃中，將步驟d)所得的芯片浸入其中，于冰浴且攪拌條件下反應(yīng)2h，然后取出，用乙醇和去離子水依次清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

f)裸金芯片表面聚甲基丙烯基半胱氨酸合成：將步驟e)所得的芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮?dú)獾氖﹤惪似恐?，?mmol步驟c)制得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸單體溶解于4ml去離子水中，氮?dú)饷摎?0min。向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，氮?dú)饷摎?0min，超聲10min。然后將溶液移入施倫克瓶中并浸沒芯片，于氮?dú)鈼l件下反應(yīng)3h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

將上述獲得的兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的SPR芯片用柏油貼合到SPR系統(tǒng)的棱鏡上。以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為10μL/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μL 1mg/mL的溶菌酶(Lysozyme)、牛血清白蛋白(BSA)或纖維蛋白原(fibrinogen)，或100μL的100％血清(Blood serum)、豆?jié){(Soybean milk)上清液或牛奶(Cow milk)上清液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由SPR系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線，20min后讀取SPR共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量，其結(jié)果如圖2a、2b所示，分別為0.18ng/cm²、0.42ng/cm²、0.69ng/cm²、4.82ng/cm²、1.57ng/cm²、2.09ng/cm²。

上述方法制得的SPR芯片在干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存1個(gè)月或在pH值為7左右的磷酸鹽緩沖液中儲(chǔ)存7天后，抗污染性能無變化。

實(shí)施例2

一種基于超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸修飾的表面等離子共振儀芯片的制備方法，包括以下步驟：

a)采用電子束蒸發(fā)鍍膜技術(shù)在BK7玻璃基底上涂覆一層3nm厚鉻層和一層47nm厚金膜，獲得了裸金芯片。

b)將裸金芯片浸入98％濃硫酸與30％雙氧水(體積比7:3)混合溶液中，常溫下浸泡2h。然后取出用去離子水清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

c)用20ml去離子水溶解24.98mmol半胱氨酸，向其中加入27.47mmol 2-丙烯酸-2-羥基-1,3-丙二酯以及29.4μmol二甲苯基磷，于30℃下攪拌反應(yīng)1h。反應(yīng)后的溶液用乙酸乙酯萃取一次，二氯甲烷萃取兩次，得到的單體水溶液通過凍干得白色粉末。

d)用三羥甲基氨基甲烷緩沖液(pH＝8.5)配制3mg/mL多巴胺溶液，將清洗干凈的裸金芯片浸入多巴胺溶液中，于60℃下孵育1h。然后取出用去離子水清洗3次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

將聚多巴胺修飾的芯片浸入0.3g/mL超支化的聚乙烯亞胺水溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)18h，然后用去離子水清洗3次，氮?dú)獯蹈伞?/p>

e)77μL三乙胺和64μL溴代異丁酰溴先后逐滴加入冰浴且攪拌條件下的10ml四氫呋喃中，將芯片浸入其中，于冰浴且攪拌條件下反應(yīng)3h，然后取出用乙醇和去離子水依次清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

f)將芯片放入預(yù)先三次循環(huán)脫氣充氮?dú)獾氖﹤惪似恐校?mmol單體溶解于4ml去離子水中，氮?dú)饷摎?0min。向其中加入0.5mmol聯(lián)吡啶、0.167mmol溴化亞銅和0.083mmol溴化銅，氮?dú)饷摎?0min，超聲5min。然后將溶液移入施倫克瓶中并浸沒芯片，于氮?dú)鈼l件下反應(yīng)2h后取出芯片，依次用乙醇和去離子水各清洗3次，用氮?dú)獯蹈蓚溆谩?/p>

將上述獲得的超支化兩性離子甲基丙烯基半胱氨酸修飾的SPR芯片用柏油貼合到SPR系統(tǒng)的棱鏡上。以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為10μL/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μL 1mg/mL的牛血清白蛋白或溶菌酶或纖維蛋白原或100％血清、豆?jié){上清液、牛奶上清液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由SPR系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線，20min后讀取SPR共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量。前述各物質(zhì)的非特異性吸附量分別為：0.56ng/cm²、0.32ng/cm²、0.80ng/cm²、5.92ng/cm²、2.36ng/cm²、3.58ng/cm²。

上述方法制得的SPR芯片在干燥狀態(tài)下儲(chǔ)存1個(gè)月或在pH值為7左右的磷酸鹽緩沖液中儲(chǔ)存7天后，抗污染性能無變化。

實(shí)施例3

將實(shí)施例1獲得的超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸SPR芯片用柏油貼合到SPR系統(tǒng)的棱鏡上。以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為10μL/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC，濃度為0.4M)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS，濃度為0.1M)的混合溶液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)EDC/NHS溶液到達(dá)芯片表面。15min后注入100μL羊免疫球蛋白(anti-IgG，1mg/mL)，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)anti-IgG溶液到達(dá)芯片表面，經(jīng)過乙醇胺封閉后，30min后獲得固載anti-IgG的SPR傳感芯片。

將上述獲得的超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸SPR芯片用柏油貼合到SPR系統(tǒng)的棱鏡上。以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為10μL/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中注入100μL溶菌酶(1mg/mL)或豆?jié){(10mg/mL)或牛奶(30mg/mL)或100％血清，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)蛋白溶液到達(dá)芯片表面，由SPR系統(tǒng)測(cè)定共振角實(shí)時(shí)變化曲線，20min后讀取SPR共振角變化值，并計(jì)算非特異性吸附量。前述各物質(zhì)的非特異性吸附量分別為：0.29ng/cm²、2.03ng/cm²、3.16ng/cm²、5.61ng/cm²。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1獲得的超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸SPR芯片用柏油貼合到SPR系統(tǒng)的棱鏡上。以pH為7.4的磷酸緩沖液為流動(dòng)相，流速為10μL/min。待基線平穩(wěn)后，往定量環(huán)中內(nèi)注入100μL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC，濃度為0.4M)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS，濃度為0.1M)的混合溶液，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)EDC/NHS溶液到達(dá)芯片表面。15min后注入100μL羊免疫球蛋白抗體(anti-IgG，1mg/mL)，經(jīng)流動(dòng)相推動(dòng)anti-IgG溶液到達(dá)芯片表面，經(jīng)過乙醇胺封閉30min后即獲得固載anti-IgG的SPR傳感芯片。進(jìn)而可注入不同濃度的羊免疫球蛋白(如15nM、75nM、150nM、300nM、450nM和700nM)、羊免疫球蛋白+溶菌酶(15nM,1mg/mL)、羊免疫球蛋白+豆?jié){(15nM,10mg/mL)，以獲得IgG檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明上述各實(shí)施例中，均在金膜表面修飾超支化兩性離子聚甲基丙烯基半胱氨酸，但本發(fā)明的方法同樣適用于很多其他材料的膜表面，例如聚四氟乙烯膜表面，玻璃表面，光纖表面等，對(duì)膜表面的材質(zhì)有一定的普適性。