本發(fā)明屬于毒品檢測領(lǐng)域，涉及一種基于SPR技術(shù)的嗎啡檢測方法。

背景技術(shù)：

嗎啡由鴉片提純而成,白色結(jié)晶,在鴉片中含量10％左右,為無色或白色結(jié)晶粉末狀,具有鎮(zhèn)痛、催眠、止咳、止瀉、抑制呼吸及腸蠕動作用,主要用于緩解急性銳痛及心源性哮喘。吸食后會產(chǎn)生欣快感,比鴉片容易成癮。長期使用會引起精神失常、譫妄和幻想,過量使用會導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡。歷史上它曾被用做精神藥品戒斷鴉片,但由于其副作用過大,最終被定為毒品。

盡管已有化學(xué)法、色譜法、光譜法、免疫法、毛細(xì)管電泳法和離子遷移譜法等方法應(yīng)用到毒品檢測中，但化學(xué)法靈敏度低，色譜法、毛細(xì)管電泳法和離子遷移譜法前處理過程時(shí)間較長，需要專門技術(shù)人員和大規(guī)模昂貴儀器，光譜法靈敏度低以及對待測樣品純度要求較高，免疫法操作時(shí)間過長。目前應(yīng)用于吸毒檢測中最廣泛的為膠體金試紙，但其以吸毒人員尿液為檢測對象，且其靈敏度只有300-1000ng/ml。而本技術(shù)以其高靈敏度，可實(shí)現(xiàn)對吸毒人員的唾液中毒品進(jìn)行檢測，從而避免了對客體隱私的侵犯，并大大提高了工作效率。

表面等離子體共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)技術(shù)是基于物理光學(xué)現(xiàn)象的一種分析技術(shù)。當(dāng)偏振光以共振角入射照在金屬和電介質(zhì)的界面上時(shí)，發(fā)生全反射，入射光的一部分能量與表面等離子體波發(fā)生耦合，引起表面等離子體共振，產(chǎn)生光強(qiáng)急劇減少的反射光。利用光學(xué)SPR技術(shù)測定時(shí)，一般是將一種功能反應(yīng)物(如配體)固定在傳感芯片表面金屬膜上，當(dāng)加入待測樣品(受體)并使其與傳感芯片上的功能反應(yīng)物相互作用時(shí)，引起體系的折射率變化，從而引起SPR光學(xué)信號的改變。由于SPR技術(shù)的高識別性、高靈敏性、快速、原位(無需標(biāo)記)、便捷、實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，SPR傳感技術(shù)現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、藥物篩選、食品分析、環(huán)境監(jiān)測、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。

目前，國內(nèi)外未見將嗎啡檢測與SPR技術(shù)結(jié)合在一起的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對目前膠體金試紙較低的檢測靈敏度，提供一種基于SPR的實(shí)時(shí)、快速、高靈敏度的嗎啡檢測技術(shù)，所述方法檢測靈敏度高，大大降低吸毒人員檢測的漏檢率，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本發(fā)明基于SPR技術(shù)的嗎啡檢測的方法，是將SPR芯片經(jīng)EDC/NHS活化后的羧基基團(tuán)偶聯(lián)BSA上的氨基后作為傳感芯片，當(dāng)待測樣品通過傳感芯片表面時(shí)，利用表面等離子體共振檢測儀檢測待檢測唾液與分子識別敏感芯片界面處全反射光的光強(qiáng)變化來直接測定唾液中的嗎啡含量,具體包括如下步驟：

步驟(1)：將SPR芯片放置到SPR儀器中作為傳感芯片，儀器溫度設(shè)定為20～30℃；

所述的SPR芯片是先在玻璃基底上表面鍍一層2～3nm厚的鉻層，再在鉻層上表面鍍一層40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巰基烷醇后用環(huán)氧氯丙烷處理生成環(huán)氧基，環(huán)氧基共價(jià)結(jié)合葡聚糖后用溴乙酸處理使葡聚糖羧基化，從而得到羧基化的葡聚糖表面；該SPR芯片經(jīng)EDC/NHS活化后的羧基基團(tuán)可以偶聯(lián)BSA上的氨基；

步驟(2)：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μL EDC/NHS混合液，活化該芯片表面的羧基基團(tuán)；

所述的EDC/NHS混合液為EDC與NHS的等體積混合溶液；其中EDC為N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亞胺，濃度為0.2～0.4M；NHS為N-羥基琥珀酰亞胺，濃度為0.1～0.2M；

步驟(3)：在步驟(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mL BSA-Morphine溶液，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到2000～3000；

所述的BSA-Morphine為人工合成的嗎啡完全抗原，即在BSA(牛血清白蛋白)表面偶聯(lián)了Morphine(嗎啡)分子，可購買獲得；pH值為4.5～5.5；

步驟(4)：在步驟(3)BSA-Morphine偶聯(lián)后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

所述的乙醇胺鹽酸鹽溶液的濃度為1～2M；

步驟(5)：在步驟(4)處理后SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度濃度的嗎啡抗體，確定合適的抗體濃度；

所述的嗎啡抗體為對BSA-Morphine具有特異性識別的鼠源單克隆抗體。

步驟(6)：將一系列不同濃度的30～50μL的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品分別與步驟(5)確定的濃度抗體混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中嗎啡抗原與步驟(5)確定的濃度抗體等體積；

步驟(7)：將30～50μL的待檢測樣品與步驟(5)確定的濃度抗體等體積混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得唾液中嗎啡含量。

其中，SPR為表面等離子共振的簡稱。

進(jìn)一步地，步驟(5)中每個(gè)嗎啡抗體反應(yīng)完成后以10～30μL/min的流速通入甘氨酸溶液，使抗原抗體解離，完成芯片再生后再加入下一個(gè)濃度的抗體；所述的甘氨酸溶液ph＝1.5。

進(jìn)一步地，在進(jìn)入步驟(6)前，可進(jìn)行多次注射步驟(5)確定的最合適濃度抗體,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。

進(jìn)一步地，步驟(7)中的待測樣品可以是唾液，血液，尿液。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明所述方法操作簡便，實(shí)時(shí)、快速，只需將抗原抗體混合通入芯片，便可實(shí)時(shí)觀測結(jié)果。

(2)本發(fā)明所述的芯片制備方案成熟，已經(jīng)商業(yè)化，購買方便，并可重復(fù)使用上百次，是一種非常經(jīng)濟(jì)的檢測方法。

(3)本發(fā)明方法所達(dá)到的靈敏度較高，時(shí)間較短，是其他任何技術(shù)都沒法比擬的。

(4)由于膠體金試紙的靈敏度只有300-1000ng/mL,當(dāng)待檢樣品含量低于其靈敏度時(shí)，膠體金試紙將無法檢測，而本發(fā)明正好解決了這問題。

附圖說明

圖1為不同濃度抗體與SPR響應(yīng)信號間的關(guān)系：抗體濃度依次為3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。

圖2為SPR芯片的再生示意圖，注射甘氨酸后SPR信號驟降，并逐漸恢復(fù)至初始基線狀態(tài)。

圖3為分別注射5次恒定濃度抗體的SPR響應(yīng)圖。

圖4中a為嗎啡檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖來詳述本發(fā)明，但不限于此。

以下實(shí)施例中提到的主要試劑信息見表1；主要儀器與設(shè)備信息見表2。

表1

表2

以下實(shí)施例所采用的SPR芯片為GE公司生產(chǎn)的CM5芯片，該芯片的表面為羧甲基化葡聚糖，易偶聯(lián)BSA上的氨基；所使用的SPR儀器為GE公司生產(chǎn)的Biacore3000；膠體金試紙購自艾博生物醫(yī)藥(杭州)有限公司。

實(shí)施例1：

(1)打開SPR儀器，解鎖SPR芯片插槽，將SPR芯片放置到插槽中，鎖上芯片插槽；SPR儀器溫度設(shè)定為25℃；

(2)以20μL/min的流速往在SPR芯片表面通入注射250μL的EDC和NHS等體積比混合液，活化該芯片表面的羧基基團(tuán)；其中EDC濃度為0.4M,NHS濃度為0.1M；

(3)在活化表面羧基后的SPR芯片上以20μL/min的流速通入1mg/mL的pH5.0的BSA-Morphine溶液，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到3000；

(4)在偶聯(lián)BSA-Morphine的SPR芯片上以20μL/min的流速通入100μL的1M的乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

(5)以20μL/min的流速通入40μL的3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL梯度濃度的嗎啡抗體，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的抗體濃度下的RU值過小，標(biāo)曲梯度較窄，降低靈敏度；100μg/mL的抗體濃度下的RU值較高，但是會耗費(fèi)掉過多的抗體，不利于成本控制，綜合比較下，50μg/mL的抗體濃度最為合適，確定后續(xù)測試中的抗體濃度為50μg/mL，；

(6)每個(gè)樣品反應(yīng)完成后以20μL/min的流速通入10μL甘氨酸溶液，使抗原抗體解離，完成芯片再生后再加入下一個(gè)濃度的抗體，如圖2所示，起始基線為1748RU，再生后基線回到1751RU，CV(變異系數(shù))僅為0.12％，表明芯片再生效果較好；

(7)以20μL/min的流速通入50μg/mL的抗體40μL共5次，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，結(jié)果如圖3所示；5次重復(fù)的RU分別為715.4RU、725.0RU、729.0RU、726.0RU、735.8RU，CV僅為1.02％，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好；

(8)將一系列不同濃度的40μL的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品(500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.91ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL、0ng/mL)與50μg/mL抗體等體積依混合后以20μL/min的流速依次通入40μL到SPR芯片獲取SPR響應(yīng)信號，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4(a)和圖4(b)所示，在3.91～125ng/ml范圍內(nèi)，嗎啡的濃度與SPR響應(yīng)信號成線性關(guān)系，最低檢測濃度在3.91-7.81ng/ml范圍，當(dāng)嗎啡濃度超過125ng/ml或低于3.91ng/ml時(shí)，嗎啡的濃度與SPR信號不再成線性關(guān)系。

(9)待檢測人(甲)的基本情況：性別男，年齡27，其尿液經(jīng)膠體金試紙檢測結(jié)果為嗎啡陽性。

將甲的唾液12000pm離心10min后，取40μL的樣品與等體積的抗體混合后，以20μL/min的流速依次通入30μL到SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得唾液中嗎啡含量為超出標(biāo)曲，大于125ng/mL。

驗(yàn)證下本實(shí)施例檢測結(jié)果的真實(shí)性：以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和固相萃取技術(shù)(SPE)相結(jié)合測得甲唾液中嗎啡含量為641.86ng/mL，與本發(fā)明測得的結(jié)果一致。

實(shí)施例2

(1)打開SPR儀器，解鎖SPR芯片插槽，將SPR芯片放置到插槽中，鎖上芯片插槽；SPR儀器溫度設(shè)定為25℃；

(2)以約10μL/min的流速往SPR芯片表面通入100μL0.2M EDC和100μL0.1M NHS的混合液，活化該芯片表面的羧基基團(tuán)；

(3)在步驟(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10μL/min的流速通入0.5mg/mL BSA-Morphine溶液(pH值為4.5)，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到約2000；

(4)在步驟(3)BSA-Morphine偶聯(lián)后的SPR芯片上以10μL/min的流速通入75μL 2M乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

(5)以10μL/min的流速通入30μL的3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL梯度濃度的嗎啡抗體，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的抗體濃度下的RU值過小，標(biāo)曲梯度較窄，降低靈敏度；100μg/mL的抗體濃度下的RU值較高，但是會耗費(fèi)掉過多的抗體，不利于成本控制，綜合比較下，50μg/mL的抗體濃度最為合適，確定后續(xù)測試中的抗體濃度為50μg/mL；

(6)每個(gè)樣品反應(yīng)完成后以10μL/min的流速通入10μL甘氨酸溶液，使抗原抗體解離，完成芯片再生后再加入下一個(gè)濃度的抗體，如圖2所示，起始基線為1748RU，再生后基線回到1751RU，CV(變異系數(shù))僅為0.12％，表明芯片再生效果較好；

(7)以10μL/min的流速通入50μg/mL的抗體30μL共5次，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，結(jié)果如圖3所示；5次重復(fù)的RU分別為715.4RU、725.0RU、729.0RU、726.0RU、735.8RU，CV僅為1.02％，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好；

(8)將一系列不同濃度的30μL的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品(500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.91ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL、0ng/mL)與50μg/mL抗體等體積依混合后以10μL/min的流速依次通入30μL到SPR芯片獲取SPR響應(yīng)信號，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4(a)和圖4(b)所示，在3.91～125ng/ml范圍內(nèi)，嗎啡的濃度與SPR響應(yīng)信號成線性關(guān)系，最低檢測濃度在3.91-7.81ng/ml范圍，當(dāng)嗎啡濃度超過125ng/ml或低于3.91ng/ml時(shí)，嗎啡的濃度與SPR信號不再成線性關(guān)系。

(9)待檢測人(乙)的基本情況：性別男，年齡30，其尿液經(jīng)膠體金試紙檢測結(jié)果為嗎啡陽性。

將乙的唾液12000pm離心10min后，取30μL的樣品與步驟(5)確定的濃度抗體等體積混合后，以10μL/min的流速通入30μL到SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得唾液中嗎啡含量超出標(biāo)曲，大于125ng/ml。

驗(yàn)證下本實(shí)施例檢測結(jié)果的真實(shí)性：以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和固相萃取技術(shù)(SPE)相結(jié)合測得乙唾液中嗎啡含量為418.19ng/mL，與本發(fā)明測得的結(jié)果一致。

實(shí)施例3

(1)打開SPR儀器，解鎖SPR芯片插槽，將SPR芯片放置到插槽中，鎖上芯片插槽；SPR儀器溫度設(shè)定為30℃；

(2)以約30μL/min的流速往SPR芯片表面通入150μL0.2M EDC和150μL0.2M NHS的混合液，活化該芯片表面的羧基基團(tuán)；

(3)在步驟(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以30μL/min的流速通入2mg/mL BSA-Morphine溶液(pH值為5.5)，使其偶聯(lián)到活化過的羧基上，要求目標(biāo)響應(yīng)值(RU)達(dá)到約3000；

(4)在步驟(3)BSA-Morphine偶聯(lián)后的SPR芯片上以30μL/min的流速通入100μL 2M乙醇胺鹽酸鹽溶液，用以封閉未反應(yīng)的活化過的羧基位點(diǎn)；

(5)以30μL/min的流速通入50μL的3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL梯度濃度的嗎啡抗體，結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明3.13μg/mL、6.25μg/mL、12.5μg/mL和25μg/mL的抗體濃度下的RU值過小，標(biāo)曲梯度較窄，降低靈敏度；100μg/mL的抗體濃度下的RU值較高，但是會耗費(fèi)掉過多的抗體，不利于成本控制，綜合比較下，50μg/mL的抗體濃度最為合適，確定后續(xù)測試中的抗體濃度為50μg/mL；

(6)每個(gè)樣品反應(yīng)完成后以30μL/min的流速通入10μL甘氨酸溶液，使抗原抗體解離，完成芯片再生后再加入下一個(gè)濃度的抗體，如圖2所示，起始基線為1748RU，再生后基線回到1751RU，CV(變異系數(shù))僅為0.12％，表明芯片再生效果較好；

(7)以30μL/min的流速通入50μg/mL的抗體50μL共5次，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，結(jié)果如圖3所示；5次重復(fù)的RU分別為715.4RU、725.0RU、729.0RU、726.0RU、735.8RU，CV僅為1.02％，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性較好；

(8)將一系列不同濃度的30μL的嗎啡標(biāo)準(zhǔn)品(500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.63ng/mL、7.81ng/mL、3.91ng/mL、1.95ng/mL、0.98ng/mL、0.49ng/mL、0ng/mL)與50μg/mL抗體等體積依混合后以10μL/min的流速依次通入50μL到SPR芯片獲取SPR響應(yīng)信號，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4(a)和圖4(b)所示，在3.91～125ng/ml范圍內(nèi)，嗎啡的濃度與SPR響應(yīng)信號成線性關(guān)系，最低檢測濃度在3.91-7.81ng/ml范圍，當(dāng)嗎啡濃度超過125ng/ml或低于3.91ng/ml時(shí)，嗎啡的濃度與SPR信號不再成線性關(guān)系。

(9)待檢測人(丙)的基本情況：性別男，年齡20，其尿液經(jīng)膠體金試紙檢測結(jié)果為嗎啡陰性。

將乙的唾液12000pm離心10min后，取50μL的樣品與步驟(5)確定的濃度抗體等體積混合后，以30μL/min的流速通入50μL到SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得唾液中嗎啡含量98.31ng/mL。

驗(yàn)證下本實(shí)施例檢測結(jié)果的真實(shí)性：以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和固相萃取技術(shù)(SPE)相結(jié)合測得丙唾液中嗎啡含量為96.26ng/mL，與本發(fā)明測得的結(jié)果一致。

實(shí)施例4：

待檢測人(丁)的基本情況：性別男，年齡37，其尿液經(jīng)膠體金試紙檢測結(jié)果為嗎啡陽性。

取40μL丁的尿液的樣品與等體積的抗體混合后，以20μL/min的流速依次通入30μL到SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得尿液中嗎啡含量超出標(biāo)曲，大于125ng/mL。

驗(yàn)證下本實(shí)施例檢測結(jié)果的真實(shí)性：以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和固相萃取技術(shù)(SPE)相結(jié)合測得丁尿液中嗎啡含量為542.18ng/mL，與本發(fā)明測得的結(jié)果一致。

實(shí)施例5

待檢測人(戊)的基本情況：性別男，年齡35，其尿液經(jīng)膠體金試紙檢測結(jié)果為嗎啡陽性。

取30μL戊的血液的樣品與等體積的抗體混合后，以10μL/min的流速通入30μL到SPR芯片，記錄響應(yīng)信號，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得血液中嗎啡含量超出標(biāo)曲，大于125ng/mL。

驗(yàn)證下本實(shí)施例檢測結(jié)果的真實(shí)性：以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)和固相萃取技術(shù)(SPE)相結(jié)合測得戊血液中嗎啡含量為467.29ng/mL，與本發(fā)明測得的結(jié)果一致。

上述實(shí)施例并非是對于本發(fā)明的限制，本發(fā)明并非僅限于上述實(shí)施例，只要符合本發(fā)明要求，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。