本發(fā)明涉及一種彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條，此方法制備的試紙條可用于包括但不限于犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、狂犬病病毒、貓白血病病毒、馬立克氏病病毒，新城疫病毒等動物病毒的快速檢測，屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

與其他微生物相比，病毒在結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成、繁殖方式及對藥物敏感性方面均有顯著區(qū)別。動物病毒病具有傳染性強(qiáng)、流行廣泛、危害嚴(yán)重和發(fā)病率高的特點(diǎn)，因此如何快速診斷成了控制和治療這些動物病毒病的關(guān)鍵因素。當(dāng)前，各獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測動物病毒病主要利用血清學(xué)試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)，這些方法往往耗時(shí)較長，起不到快速檢測的作用。

近年來，免疫層析方法日漸成熟，其具有耗時(shí)短、操作簡便、成本低廉適用于現(xiàn)場大量樣本快速測試等特點(diǎn)，已在動物病毒的檢測領(lǐng)域取得了長足的發(fā)展。其中，膠體金因易制備、生物相容性好、顏色多變等優(yōu)勢成為了免疫層析分析法中最常用的標(biāo)記原料。在動物病毒監(jiān)檢測中，膠體金因其鮮明的顏色可輕易實(shí)現(xiàn)定性檢測，并且通過光電感應(yīng)器檢測膠體金顆粒對光的吸收和散射，可實(shí)現(xiàn)定量檢測。但是，體金的生產(chǎn)成本相對較高，使用物理吸附使其對抗體和包被原等原料的要求比較高；當(dāng)金顆粒過大時(shí)，標(biāo)記物又不穩(wěn)定導(dǎo)致批間差異大；且膠體金信號較弱，靈敏度低等限制了其應(yīng)用。因此需要一種價(jià)格低廉的，易制備，穩(wěn)定的，靈敏度高的標(biāo)記顆粒替代膠體金用于動物病毒檢測的免疫層析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，本發(fā)明的目的在于提供了一種彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條實(shí)現(xiàn)動物病毒的快速檢測，并解決膠體金成本高，信號弱，測試線顯色不明顯，定量檢測批間差異大等問題。彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法制備的試紙條，可同時(shí)實(shí)現(xiàn)高靈敏度的動物病毒的定性和定量檢測。

本發(fā)明提供的彩色熒光顆粒標(biāo)的抗體，以鍵合銪³⁺的彩色熒光乳膠微球?yàn)槔闹苽浞椒?，包括以下步驟：

(1)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(2)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(3)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(4)取相應(yīng)動的物病毒的單克隆抗體，加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(5)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(6)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(7)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，其特征在于，試劑盒的結(jié)構(gòu)如圖1所示：在塑料底板(1)一端粘貼樣品墊(2)，樣品墊的一端緊密壓接噴涂有彩色熒光微球標(biāo)記的動物病毒抗體的結(jié)合墊(3)，結(jié)合墊(3)一端緊密壓接硝酸纖維素nc膜(4)，nc膜上包被有檢測線t1(5)和質(zhì)控線c(6)，nc膜的另一端連接吸水墊(7)形成試紙，試紙裝入塑料卡殼內(nèi)形成試紙卡。包括以下組裝步驟：

(1)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(2)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)將對照線和檢測線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過夜，使之充分粘合。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測線包被的抗體為動物病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此動物病毒檢測試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的動物血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測試結(jié)果為陰性，樣品中不含相應(yīng)的動物病毒；若對照線和測試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測試結(jié)果為陽性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測儀器檢測，可定量給出樣品中動物病毒的含量。

本發(fā)明提供了上述制備方法制備的試紙條在動物病毒檢測中的應(yīng)用。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提出彩色熒光顆粒標(biāo)記抗體的方法及使用其制備的試紙條，有以下優(yōu)勢：

(1)本發(fā)明所述的抗體標(biāo)記的方法是利用彩色熒光微球表面的功能基團(tuán)，采用化學(xué)共價(jià)鍵合的方式與抗體結(jié)合，使得抗體標(biāo)記的彩色熒光微球比起膠體金更為穩(wěn)定。

(2)本發(fā)明所述試紙用于動物病毒檢測時(shí)，在3～6min內(nèi)即可得到定性檢測結(jié)果，隨后在15min時(shí)使用配套的熒光定量檢測儀器，即可定量得到準(zhǔn)確的結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了定性定量同時(shí)檢測。

(3)本發(fā)明所述試紙用于動物病毒檢測時(shí)，最低檢測限可達(dá)到4ng/ml,靈敏度高于膠體金免疫層析法。

附圖說明

本發(fā)明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明中的示意實(shí)施例用于說明本發(fā)明，并不對本發(fā)明構(gòu)成限定。

圖1為本發(fā)明內(nèi)容中彩色熒光微球標(biāo)記的檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例一中的彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條的測試結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例一

一種彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條，包括以下步驟：

(1)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(2)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(3)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(4)分別取犬瘟熱病毒的單克隆抗體，分別加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(5)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(6)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(7)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，包括以下組裝步驟：

(1)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(2)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(3)將對照線和檢測線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(4)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過夜，使之充分粘合,可得到犬瘟熱和貓白血病病毒檢測試紙卡。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測線包被的抗體為犬瘟熱病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此動物病毒檢測試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的犬血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測試結(jié)果為陰性，樣品中犬瘟熱病毒；若對照線和測試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測試結(jié)果為陽性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測儀器檢測，可定量給出樣品中動物病毒的含量。

實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證結(jié)果

1.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記的犬瘟熱病毒抗體制備的試紙條進(jìn)行犬瘟熱病毒測試。如圖2所示，陰性和陽性都進(jìn)行量兩組平行測試，兩組測試均成功。加樣后5min時(shí)，陰性樣品檢測結(jié)果只有對照線出現(xiàn)彩色線條，而陽性樣品檢測結(jié)果出現(xiàn)兩條彩色線條，15min時(shí)使用配套熒光定量檢測儀器檢測，兩組陽性定量結(jié)果分別為18.6ng/ml,19.1ng/ml。

實(shí)施例二

一種彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條，包括以下步驟：

(8)將定量的彩色熒光乳膠微球溶液加到緩沖溶液中稀釋，超聲1.5min，得到彩色熒光微球分散液。

(9)向步驟(1)中的彩色熒光乳膠微球分散液中迅速滴入活化劑，快速置于渦旋振蕩器上低速震蕩1min后，固定在渦旋振蕩器上，室溫下震蕩活化30min。

(10)活化結(jié)束后，將步驟(2)中的彩色熒光乳膠微球分散液在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，用步驟(1)中的緩沖溶液清洗，再次以相同條件離心后，棄去上清液，用步驟(4)中緩沖溶液復(fù)溶重懸。

(11)分別取貓白血病病毒的單克隆抗體，分別加入緩沖溶液稀釋至0.085mg/ml。

(12)將步驟(3)中復(fù)溶的納米顆粒分散液加入到步驟(4)中的抗體稀釋液中，立刻在渦旋震蕩器上震蕩1.5min，隨后超聲1.5min，然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(13)反應(yīng)結(jié)束后，將步驟(5)中溶液超聲1min，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，加入封閉液，同樣然后固定在渦旋振蕩器上在室溫下震蕩反應(yīng)1h。

(14)將步驟(6)中溶液離心后再次加入封閉液清洗，在26℃，14000rpm下，離心12min后移去上清液，可得到彩色熒光微球標(biāo)記的抗體。

步驟(1)的緩沖溶液是2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖溶液，其ph為7.2。

步驟(2)中活化劑是edc&nhs活化劑。

步驟(3)中復(fù)溶的緩沖溶液以及步驟(4)的緩沖溶液均是硼酸酸緩沖溶液，其ph值為7.8。

本發(fā)明還提供了一種基于上述方法制備的彩色熒光微球標(biāo)記的抗體的試紙條，包括以下組裝步驟：

(5)抗體標(biāo)記的彩色熒光微球中加入重懸液，反復(fù)吹打，隨后超聲5min直至沉淀完全溶解。

(6)將步驟(1)中的抗體標(biāo)記的彩色熒光微球溶液用劃膜噴金機(jī)噴涂于結(jié)合墊，隨后在烘箱中37℃下烘干1h。

(7)將對照線和檢測線要包被的抗體，分別用適宜的稀釋液稀釋后，用劃膜噴金機(jī)將其分別噴涂于硝酸纖維素膜上，37℃下在烘箱中烘干1h。

(8)組裝粘貼結(jié)合墊、樣品墊，密封過夜，使之充分粘合,可得到犬瘟熱和貓白血病病毒檢測試紙卡。

步驟(2)中彩色熒光微球標(biāo)記的抗體溶液的溶度為1.5mg/ml，涂覆量為5μl/cm。

步驟(3)中硝酸纖維素膜的對照線包被的抗體為抗鼠lgg多克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm；檢測線包被的抗體為貓白血病病毒單克隆抗體，涂覆量為0.9μl/cm。

本發(fā)明提供了此貓白血病病毒檢測試紙條的使用方法：

(1)使用移液器，取定量體積的貓血清、血漿、全血樣品加入到樣品稀釋液中，充分混合后，取定量體積的測試液加入到試紙條的加樣槽中，等待3～6min中，若只有質(zhì)控線出現(xiàn)彩色條帶，表明測試結(jié)果為陰性，樣品中貓白血病病毒；若對照線和測試線均顯現(xiàn)出彩色條帶，測試結(jié)果為陽性，繼續(xù)等待至15min，使用配套熒光定量檢測儀器檢測，可定量給出樣品中

動物病毒的含量。

實(shí)驗(yàn)與驗(yàn)證結(jié)果

1.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條還以貓白血病病毒為例測定50份臨床樣本，區(qū)間判定結(jié)果和樣本值的符合率為94.2％。本發(fā)明、所述的彩色熒光微球標(biāo)記的貓白血病病毒抗體制備的試紙條可以靈敏地定量檢測樣品中的貓白血病病毒。

2.使用本案例彩色熒光微球標(biāo)記動物病毒抗體制備的試紙條的穩(wěn)定性驗(yàn)證：組裝后的試紙條，分別在兩周、四周、八周后取出，取同樣的測試樣品檢測，檢測結(jié)果cv％較低，表明此試紙條具有良好的穩(wěn)定性。