專利名稱：色素標(biāo)記聚合抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用色素標(biāo)記的聚合抗體及其制備方法。
色素標(biāo)記抗體，因能與試液中抗原發(fā)生特異反應(yīng)，同時(shí)具有可視性，所以可被如免疫傳感器檢出，在臨床上可利用免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)來檢測(cè)試液中所含的檢體。目前已廣泛用于各醫(yī)療機(jī)構(gòu)的臨床診斷中。
標(biāo)記抗體的色素大多使用具有高的摩爾吸光系數(shù)、反應(yīng)性高的花青類標(biāo)記色素(Bioconjugate Chemistry Vol.4,No.2,pp105-111,1993)。
這樣的花青類色素其官能團(tuán)與抗體的氨基或羧基反應(yīng)，進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，對(duì)于1分子抗體來說，結(jié)合20-50分子的上述色素。
這樣制成的花青類色素標(biāo)記抗體一般肉眼識(shí)別性好，例如用免疫層析法，可有效地檢出只存在于孕婦尿中的人絨毛膜促性腺素等微量成分。
通常，1分子抗體與抗原反應(yīng)部位只有2個(gè)，因此與抗原的反應(yīng)靈敏度不高。
所以，在將現(xiàn)有色素標(biāo)記抗體用于免疫傳感器等情況下，限于其靈敏度，若試樣液中所含的檢測(cè)對(duì)象(抗原)濃度低時(shí)，其檢出有困難。
鑒于上述問題，本發(fā)明的目的在于提供檢測(cè)對(duì)象濃度低時(shí)也能檢出的高靈敏度的色素標(biāo)記聚合抗體。
本發(fā)明的目的還在于提供制備這種色素標(biāo)記聚合抗體的方法。
本發(fā)明提供色素標(biāo)記聚合抗體，它由經(jīng)多官能團(tuán)試劑聚合的聚合抗體和如下式(1)或式(2)或式(2)所示花青類色素制成，所述聚合抗體被所述色素標(biāo)記。
式中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示1-4的整數(shù)。
聚合抗體是具有多個(gè)抗原反應(yīng)部位的多價(jià)抗體，因此與通常的二價(jià)抗體相比，與抗原的結(jié)合靈敏度高。
而且，每分子聚合抗體結(jié)合的色素?cái)?shù)目比1分子抗體也增多，因此肉眼識(shí)別性提高。
從而，本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體如果用于如免疫層析法，則在檢測(cè)對(duì)象(檢體)濃度低的情況下，也能高靈敏度地檢出檢體。而且，由于靈敏度高，本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體也可適用于生物傳感器。
本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體通過所述花青類色素的琥珀酰亞胺碳與所述聚合抗體的氨基氮共價(jià)結(jié)合形成所述色素的骨架與所述聚合抗體結(jié)合的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體中抗體的聚合度通常以2-50范圍內(nèi)為佳。
本發(fā)明也涉及色素標(biāo)記聚合抗體的制備方法，包括如下步驟在中性或弱堿性磷酸緩沖液中用多官能團(tuán)試劑聚合抗體和在此緩沖液中加入式(1)或式(2)所示花青類色素標(biāo)記所述聚合抗體。
此處所用的磷酸緩沖液的pH以7.0-8.0為佳。
可用于本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體的抗體無特殊限制，與抗體來源及其亞型等無關(guān)。例如，作為免疫球蛋白(Ig)，可列舉小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠IgA、小鼠IgE、大鼠IgG、大鼠IgM、大鼠IgA、大鼠IgE、家兔IgG、家兔IgM、家兔IgA、家兔IgE、山羊IgG、山羊IgM、山羊IgE、山羊IgA、綿羊IgG、綿羊IgM、綿羊IgA、綿羊IgE等。這些抗體可從商業(yè)途徑購得也可直接從動(dòng)物身上采取。
多官能團(tuán)試劑可列舉在同一個(gè)分子上有兩個(gè)或兩個(gè)以上能結(jié)合于抗體的官能團(tuán)如琥珀酰亞胺基、吡啶基二硫基等的試劑。這些試劑的例子可以是式(3)所示丙酸二硫基磺基琥珀酰亞胺酯、式(4)所示辛二酸二(磺基琥珀酰亞胺)酯、式(5)所示酒石酸二琥珀酰亞胺酯、式(6)所示二(琥珀酰亞胺基琥珀酸乙二醇酯、式(7)所示N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸等。
式(1)或式(2)所示花青類色素是青色系列的色素，在長波長范圍內(nèi)有吸收，不易受雜質(zhì)的影響。因此，可用于根據(jù)吸光度檢出特定物質(zhì)的傳感器。
式(1)或式(2)中，X表示的鹵素可列舉氟、氯、溴或碘，M表示的金屬可列舉鋰、鈉和鉀等。


圖1是闡明本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中免疫層析傳感器結(jié)構(gòu)概況的斜視圖。
下面描述式(1)或式(2)所示花青類色素的合成途徑的一個(gè)實(shí)施例。
首先，將肼基苯磺酸(8)與異丙基甲基酮溶于酸性溶劑中，加熱，形成磺酸假吲哚鎓(9)。然后，在磺酸假吲哚鎓(9)的醇溶液中加入金屬氫氧化物的醇溶液，得到磺酸假吲哚鎓的金屬鹽(10)。
接著，在上述金屬鹽(10)的有機(jī)溶劑溶液中加入飽和脂肪酸的鹵化物，加熱，得到羧基烷基磺酸假吲哚鎓的金屬鹽(11)?？紤]到水溶性，上述脂肪酸的碳原子數(shù)以1-4為宜。
然后，將上述金屬鹽(11)與四甲氧基丙烷溶于堿性有機(jī)溶劑，加熱，制成羧酸衍生物(12)，最后，在羧酸衍生物(12)的有機(jī)溶劑溶液中加入羥基琥珀酰亞胺和縮合劑二環(huán)己基碳化二亞胺，攪拌，得到式(1)所示花青類標(biāo)記色素。
在式(2)所示花青類色素的合成上，用戊烯二醛四甲基縮醛代替四甲氧基丙烷。
又，式(1)、式(2)、式(11)和式(12)所示各化合物中所含的鹵素為例如氟、氯、溴、碘。式(1)、式(2)、式(10)-(12)所示各化合物中所含的金屬為例如鋰、鈉、鉀等。
下面將描述用多官能團(tuán)試劑進(jìn)行抗體聚合反應(yīng)的機(jī)制。
首先，如式(13)所示，將多官能團(tuán)試劑(具有2個(gè)以上琥珀酰亞胺基的二硫二(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯))與抗體混合，如式(14)所示，抗體的氨基接近上述試劑的一個(gè)琥珀酰亞胺基的酯結(jié)合部位。
然后，如式(15)所示，上述氨基與上述酯結(jié)合部位反應(yīng)，從上述氨基奪取一個(gè)氫原子。從此氨基脫離的氫原子與上述琥珀酰亞胺基的琥珀酰亞胺結(jié)合。琥珀酰亞胺變成羥基琥珀酰亞胺從琥珀酰亞胺基上脫離，與此同時(shí)，上述琥珀酰亞胺基的剩余部分與上述被奪取一個(gè)氫原子的氨基形成酰胺鍵，上述試劑通過此酰胺鍵與上述抗體結(jié)合。
上述試劑的其它琥珀酰亞胺基也與上述同樣起反應(yīng)，如式(16)所示，上述試劑與其它抗體通過酰胺鍵結(jié)合。此反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行，使抗體發(fā)生聚合。
花青類色素的琥珀酰亞胺基與抗體的氨基結(jié)合反應(yīng)的機(jī)制也與上述相同。
以下舉出具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作更詳細(xì)的說明。
(Ⅰ)小鼠IgG的聚合將10mg(6.667×10-5mmol)小鼠IgG(以下簡稱IgG)溶于1ml磷酸緩沖液(以下簡稱“PBS”)。將其在室溫下邊攪拌邊滴加含二硫二(丙酸磺基琥珀酰亞胺酯)(ヒァス公司制，以下簡稱“DTSSP”)的PBS溶液0.1ml。所滴加的DTSSP的PBS溶液中含DTSSP 4.057mg(0.006667mmol,100當(dāng)量)。
然后，于35℃攪拌30分鐘，將混合物用瓊脂糖凝膠(商品名Sephadex G25M柱)過濾，得到約6ml IgG凝聚物(以下稱作IgGagg.)的PBS溶液。所得溶液的濃度計(jì)算如下取所得的溶液0.5ml于280nm處測(cè)定吸光度，吸光度值為2.43。由于280nm處觀察到的吸光度來自IgG，因此，IgG凝聚物的1分子IgG的濃度〔IgGagg.〕可計(jì)算如下。IgG在280nm處的吸光系數(shù)為2.099×105。
〔IgGagg.〕=2.43/2.099×105=1.158×10-5(M)(2)聚合抗體的色素標(biāo)記將式(1)所示色素溶于0.2ml PBS(總蛋白量的400倍)中，配制成色素溶液(以下稱作SLIC5)28.2mg。但是，使用式(1)中X為碘、M為鉀、碳原子數(shù)n為2的化合物。
然后，將SLIC5緩緩滴入(1)中所得的IgGagg.溶液(使總抗體量為10mg)。其后，于4℃靜置20小時(shí)，對(duì)添加了疊氮鈉作為防腐劑的PBS 20升進(jìn)行透析，以除去未反應(yīng)的色素分子。得到約6ml SLIC5標(biāo)記聚合抗體的PBS溶液。
按如下計(jì)算，求出所得的SLIC5標(biāo)記聚合抗體的每分子IgG的SLIC5的分子數(shù)。
測(cè)定所得溶液的280nm和640nm處吸光度。結(jié)果，吸光度分別為12.0和45.5。聚合抗體在640nm處無吸收，因此，觀察到的吸光來自結(jié)合的SLIC5。然而，SLIC5的濃度〔SLIC5〕可按如下方法求出。SLIC5的640nm處摩爾吸光系數(shù)為1.01×105。
〔SLIC5〕=45.5/1.01×105=4.505×10-4(M)又，觀察到的280nm處的吸光來自聚合抗體的IgG，而結(jié)合的SLIC5在280nm處也有吸收，扣除此影響，按下式求出聚合抗體的IgG分子的濃度〔IgGagg.〕。而來自聚合抗體的280nm吸光度為Ab280,IgG,SLIC5的280mm摩爾吸光系數(shù)為2.11×103，聚合抗體的IgG分子的280nm摩爾吸光系數(shù)為2.099×105。Ab280,IgG=12.0-(4.505×10-4×2.11×104)=2.494〔IgGagg.〕=2.494/2.099×105=1.188×10-5(M)從而，SLIC5標(biāo)記聚合抗體的每分子IgG結(jié)合的SLIC5的分子數(shù)計(jì)算如下。
〔SLIC5〕/〔IgGagg.〕=4.505×10-4/1.188×10-5=37.9(個(gè))(3)色素標(biāo)記聚合抗體的評(píng)價(jià)將(2)中制得的色素標(biāo)記聚合抗體用免疫層析傳感器測(cè)定640nm處吸光度來評(píng)估因色素標(biāo)記聚合抗體的集聚而產(chǎn)生的發(fā)光度(敏感性)。
圖1是顯示免疫層析傳感器概略結(jié)構(gòu)的斜視圖。將第一玻璃濾紙2、硝基纖維素制的抗體固定膜5和第二玻璃濾紙6依次放置在聚氯乙烯之類塑料制的支持板1上。然后，將第一玻璃濾紙2的接觸抗體固定膜5側(cè)的端部浸漬(2)中所得的色素標(biāo)記聚合抗體，這部分形成標(biāo)記抗體部3。將能與色素標(biāo)記聚合抗體的同樣抗原反應(yīng)的抗體吸附固定于抗體固定膜5的預(yù)定部位，形成抗體固定部4。
用具有上述結(jié)構(gòu)的免疫層析傳感器測(cè)定吸光度按例如下面的方法進(jìn)行。
按照層析法的原理，當(dāng)試樣液滴加到圖1的第一玻璃濾紙2的不與抗體固定膜5接觸的另一端時(shí)，試樣液開始從第一玻璃濾紙2向第二玻璃濾紙6移動(dòng)。標(biāo)記抗體部3上，色素標(biāo)記聚合抗體與試樣液中的抗原結(jié)合。然后，含此標(biāo)記抗體與抗原結(jié)合的試樣液向抗體固定部4移動(dòng)，上述抗原在此處與固定抗體結(jié)合，固定在此處。剩余的試樣液經(jīng)抗體固定膜5繼續(xù)移動(dòng)，最后吸附在第二玻璃濾紙6上。
將波長640nm的L1光輻照抗體固定部4，測(cè)定反射光L2，從而測(cè)得吸光度。
作為對(duì)比實(shí)施例，除了不聚合抗體外，按上述同樣的方法制備色素標(biāo)記抗體。與上述同樣地，將其用免疫層析傳感器測(cè)定吸光度。
結(jié)果，使用本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體時(shí)，吸光度約為0.8，使用色素標(biāo)記抗體時(shí)的吸光度約為0.08。
從該結(jié)果可以認(rèn)為，本發(fā)明的實(shí)施例的色素標(biāo)記聚合抗體的靈敏度約為對(duì)比實(shí)施例靈敏度的10倍。
如上所述，本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體具有多個(gè)與抗原反應(yīng)部位，因此靈敏度高。然而，例如將本發(fā)明的色素標(biāo)記聚合抗體用于免疫層析法的傳感器，則可制成比用現(xiàn)有技術(shù)制成標(biāo)記抗體時(shí)靈敏度高的傳感器。
權(quán)利要求
1．色素標(biāo)記聚合抗體，其特征在于由經(jīng)多官能團(tuán)試劑聚合的聚合抗體和如下式(1)或式(2)所示花青類色素制成，所述聚合抗體被所述花青類色素標(biāo)記
式中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示1-4的整數(shù)。
2．如權(quán)利要求1所述的色素標(biāo)記聚合抗體，其特征還在于所述色素的骨架通過所述花青類色素的琥珀酰亞胺基碳與所述聚合抗體的氨基氮形成共價(jià)鍵而與聚合抗體結(jié)合。
3．色素標(biāo)記聚合抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟在中性或弱堿性的磷酸緩沖液中用多官能團(tuán)試劑聚合抗體；及在此緩沖液中加入式(1)或式(2)所示花青類色素，標(biāo)記所述聚合抗體
式中，R1和R2表示氫或烷基，X表示鹵素，M表示氫或堿金屬，n表示1-4的整數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明公開了檢測(cè)對(duì)象低濃度時(shí)也可能檢出的高靈敏度色素標(biāo)記聚合抗體。該聚合抗體由經(jīng)多官能團(tuán)試劑聚合的抗體和如右式(1)或式(2)所示花青類色素制成，所述聚合抗體被所述花青類色素標(biāo)記。式中，R
文檔編號(hào)C07K16/44GK1238218SQ99106738
公開日1999年12月15日 申請(qǐng)日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月14日
發(fā)明者重藤修行, 宮崎仁誠, 平井真人 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社