專利名稱：一種制備酶標記抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酶標記抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
酶免疫測定技術(shù)自問世以來發(fā)展迅速，在藥物篩選、醫(yī)療診斷、食品安全檢測等眾 多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。它既繼承了放射性免疫測定的高靈敏度等優(yōu)點，又克服了前者需使 用放射性標記這一缺點。酶免疫測定將酶促反應(yīng)的高效率和免疫反應(yīng)的高特異性有機地結(jié) 合起來，可對各種分析物如蛋白、毒素、農(nóng)藥、微生物等進行定量檢測，是目前靈敏度高、適 應(yīng)性強、并在生產(chǎn)和臨床中得到推廣的免疫測定技術(shù)。另外，在免疫測定中使用酶作為標 記，還在于酶能保持長期的穩(wěn)定性、對操作人員無危害、并避免了放射性免疫中存在的廢物 處理問題。而制備特定抗體和酶偶聯(lián)物(酶標記抗體)是能否實現(xiàn)對特定抗原分析物進行定 量檢測的關(guān)鍵。目前用于酶標記抗體制備的方法傳統(tǒng)的主要有戊二醛法和過碘酸鈉法。戊二醛法 也是至今最常見的標記酶到抗體上的偶聯(lián)方法。它又分為一步法和兩步法，一步法操作簡 便、快速，只要將一定量的酶和抗體加入到緩沖液中，同時加入一定量的戊二醛進行反應(yīng)。 但一步法的缺點是(1)偶聯(lián)反應(yīng)不易控制，若被偶聯(lián)的兩種物質(zhì)與偶聯(lián)劑的反應(yīng)速度不同， 則反應(yīng)速度快的那種分子易發(fā)生自生聚合；(2)偶聯(lián)效率不高，參與偶聯(lián)反應(yīng)的兩種分子 所占比率較低。而兩步法克服了一步法的缺點，它采用將與偶聯(lián)劑反應(yīng)較弱的分子先用過 量的偶聯(lián)劑活化，然后去除多余偶聯(lián)劑后再加入反應(yīng)速度相對快的偶聯(lián)分子。兩步法雖然 操作繁瑣，但偶聯(lián)率提高，而且形成的同分子聚合物減少。過碘酸鈉法是偶聯(lián)酶和糖蛋白產(chǎn) 率最高的方法，該法利用過碘酸鈉將糖蛋白(抗體、糖基化的酶等)上的糖鏈基團氧化成醛 基，再通過醛基與待偶聯(lián)的分子發(fā)生連接。與戊二醛法相比，過碘酸鈉法的效率提高至少 3 4倍。用于偶聯(lián)HRP和IgG時，約有70%的酶和99%的抗體反應(yīng)。最佳時，每個IgG分 子可與5 6個HRP分子連接。盡管按該法制備酶標記物時酶活的損失可達50%，但用于 酶免疫測定時可將靈敏度提高5倍左右。過碘酸鈉法雖有很高的產(chǎn)率，但操作中對于過碘 酸鈉的濃度和工作PH等都需十分注意，過碘酸鈉濃度過高可以導致新形成的醛基被直接 進一步氧化為羧基，濃度過低則無法使糖基氧化。針對不同批次的酶之間存在糖基化程度 有差別的特點，使用過碘酸鈉法時需對不同批次的方法有所調(diào)整。另一方面，由于重組抗體 和許多單克隆抗體不含糖基，若準備用該法連接這類抗體時，需事先確定抗體上是否有合 適的修飾位點。戊二醛法和過碘酸鈉法各有優(yōu)點，也成為了商業(yè)法酶標抗體(如Sigma公 司)的主流制備方法，但這兩種方法都涉及使用高濃度的酶和抗體，也需要較為繁瑣的分離 與純化步驟，如凝膠過濾、長時間透析或親和層析柱純化等。近年來，納米技術(shù)發(fā)展迅速，新興的納米材料也層出不窮，這為新一代的酶標抗體 的發(fā)展提供了可能。西班牙Merkoci課題組分別于2007年和2010年報道將HRP 二抗和膠 體金結(jié)合形成膠體金HRP 二抗復(fù)合標記抗體用于酶聯(lián)免疫檢測，結(jié)果表明新的酶標抗體能 使檢測的靈敏度提高10倍左右。該復(fù)合抗體是將傳統(tǒng)方法制備的酶標記抗體以膠體金表面能承受的飽和吸附量吸附到膠體金表面，形成包被有酶標二抗的納米膠體金。當膠體金 上的任一抗體參與抗原捕捉后，與該抗體連接著的膠體金上的其他酶標記抗體都可以參與 信號示蹤(如加底物后顯色)，從而使靈敏度提升。另一方面，膠體金的相對大的表面積足以 同時容納更多的酶標記抗體(如1個18nm膠體金離子可容納約13個HRP),Merkoci課題組 使用的這種高靈敏度的膠體金復(fù)合酶標特點在于使參與信號示蹤的酶標量增多，突破傳統(tǒng) 酶標抗體在參與捕捉抗原后，只有酶標抗體其自身所帶1 2倍數(shù)量酶標分子能參與信號 示蹤這一局限。該膠體金復(fù)合酶標記抗體雖有更高的靈敏性，但是仍以制備好的傳統(tǒng)酶標 抗體為基礎(chǔ)，并沒變傳統(tǒng)意義上抗體與酶的偶聯(lián)過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種制備酶標記抗體的方法，能以未經(jīng)偶聯(lián)的 抗體和酶為基礎(chǔ)，結(jié)合納米材料(膠體金)制備高靈敏度的新一代酶標記膠體金復(fù)合抗體。 為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它將膠體金溶液濃縮，然后將濃縮后的膠體金溶液的PH 調(diào)到略高于用于標記的酶的等電點的PH，將用于標記的酶的水溶液加入膠體金溶液后混 勻，再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子上，經(jīng)離心后即制得酶標記金膠 復(fù)合抗體。Merkoci課題組制備的酶標記金膠復(fù)合抗體不僅需以現(xiàn)成的酶標抗體為基礎(chǔ)，還 需使用較高終濃度的酶標記抗體(8 9μ g/mL)來飽和膠體金表面以使膠體穩(wěn)定，這無疑 增大了酶標記抗體的耗費量。目前，市售的大部分抗體的價格是等質(zhì)量酶價格的數(shù)十到上 百倍，考慮到酶相對低的成本，本發(fā)明的核心思路是在保證抗體捕捉抗原的能力(即抗體的 量)不受影響的情況下，通過膠體金為載體來增大用于信號示蹤的酶標分子的量。首先將 膠體金溶液濃縮(通過離心后加少量水重溶)以增大單位體積溶液內(nèi)膠體金可以用于吸附 蛋白的總的表面積；將膠體金溶液的PH調(diào)到略高于酶的等電點，將酶加入后混勻，便可以 以簡捷的直接吸附在金膠表面包滿一層酶分子，一方面可以為后續(xù)步驟獲得充足的酶標分 子，另一方面可以使金膠溶液穩(wěn)定。再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子 上，經(jīng)離心后即制得酶標記膠體金復(fù)合抗體。在采用上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可采用以下進一步的技術(shù)方案
所述用于標記的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。所采用膠體金粒子的直徑范圍在18 60nm之間；
所述略高于用于標記的酶的等電點的PH為高于用于標記的酶的等電點0. 4-0. 6個單 位的pH。所述雙功能試劑為戊二醛或N，N' - 二琥珀酰亞胺碳酸酯。所述方法包括制備用于標記的酶溶液的步驟，它將用于標記的酶用水配成0. 1 2mg/mL的澄清溶液，所述用于標記的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡 萄糖氧化酶；
所述方法還包括制備膠體金溶液的步驟，所述膠體金溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸的 方法來制備；
所述方法還包括以下步驟
(1)將所制備的膠體金溶液濃縮至原濃度的2倍，將濃縮過的膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié)到適合標記酶的最佳PH范圍，即高出用于標記的酶的等電點約0. 4-0. 6個單位的pH，然后 將該膠體金溶液與所述用于標記的酶溶液進行混合，在室溫或4° C條件下混合lh。隨后 將混合液于15000g 4° C下離心15min，吸走上清液后加入等體積的磷酸鹽緩沖液重新溶 解，所述磷酸鹽緩沖液的PH =7. 4，即得到標記有酶的膠體金溶液；
(2)將步驟(1)所得溶液中加入雙功能試劑，所述雙功能試劑選自如戊二醛或 N, N’ - 二琥珀酰亞胺碳酸酯，使標記在膠體金上的酶經(jīng)雙功能試劑活化后修飾上功能基團； 隨后將反應(yīng)液在15000g和4° C下進行離心，離心后吸走上清液并加入等體積的磷酸鹽緩 沖液重新溶解，所述磷酸鹽緩沖液的PH =7. 4，此離心步驟重復(fù)進行以去除未參與反應(yīng)的多 余雙功能試劑；
(3)往步驟⑵所得的產(chǎn)物中加入抗體，抗體的最終濃度為5 50μ g/mL，混勻后過夜 反應(yīng)，使抗體連接到標記在膠體金上的酶的活化的功能基團上，隨即加入封閉劑封閉掉酶 上可能殘余的雙功能試劑功能基團；然后將產(chǎn)物進行離心后溶于磷酸鹽緩沖液中，即制得 以膠體金為載體的酶標記抗體。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點及突出性效果(1)通過直接吸附這種簡 捷的方式完成了膠體金上的酶標記；(2)之后的雙功能試劑兩步法中，酶和偶聯(lián)劑的分離 以及抗體連接后的分離純化無需引入凝膠過濾、透析或親和層析等繁瑣且高損耗的昂貴步 驟，只需通過簡單的離心即可完成，因為連接上的膠體金粒子可以很輕易的離心下來(如在 15000g的條件下);(3)膠體金吸附酶前進行的濃縮操作可以提高被連接試劑(酶和抗體)的 連接量，同時可以增加酶標記膠體金復(fù)合抗體中金膠粒子的濃度；(4)酶分子要比傳統(tǒng)的 酶標記抗體分子直徑要小，單位面積的膠體金表面可以吸附更多的酶分子來作為信號示蹤 分子；(5)所獲得的酶標記膠體金復(fù)合抗體仍能和Merkoci課題組制備的酶標記膠體金復(fù) 合抗體一樣具有較傳統(tǒng)酶標抗體的信號放大能力，第(3)和(4)點的效果更提升了這種信 號放大能力。(6)酶標記膠體金復(fù)合抗體仍保有膠體金的酒紅色，可以作為操作中是否加入 酶標抗體的指示，可以省去商業(yè)化酶標抗體中加入有色染料來作為指示這一步驟。(7)吸附 有蛋白的膠體金易于保存，在的4° C無菌環(huán)境下可以穩(wěn)定保存一年以上。酶標記金膠復(fù)合 抗體同樣符合這一特征。


圖1是本發(fā)明制備過程的示意圖。
具體實施例方式如圖1所示，一種酶標記膠體金復(fù)合抗體，包括膠體金粒子1、酶分子2、雙功能試 劑分子3、抗體4。以下采用本發(fā)明方法制備系列酶標記膠體金復(fù)合抗體。
實施例1
取2. 5mL 1%的檸檬酸鈉水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，并同時 進行磁力攪拌使之混合均勻。反應(yīng)一段時間后，溶液由黃變藍，最終變成酒紅色，停止加熱 并在磁攪拌的條件下直至冷卻，即制得直徑約為18nm的膠體金。4/4頁取一定體積的膠體金溶液，在15000g和4° C條件下離心15min后吸走上清 液，并用原體積一半的去離子水重新溶解。用0.2M K2CO3將濃縮后的膠體金pH值調(diào)至約 8. 2-8. 5之間，隨后加入一定濃度的辣根過氧化物酶(HRP，等電點PI =7. 2 8.0)，使HRP 最終濃度為50 μ g/mL。在室溫或4° C下旋轉(zhuǎn)混合1 一 2小時，隨后將反應(yīng)液在15000g和 4° C下進行離心，離心后吸走上清液并加入等體積的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)重新溶解。再 往該標記有酶的膠體金溶液中加入戊二醛(戊二醛在溶液中的最終濃度0.洲)，混勻后在旋 轉(zhuǎn)混合器上反應(yīng)2小時。隨后按之前的離心步驟重復(fù)兩次。產(chǎn)物中加入抗體(抗體在溶液中的最終濃度10 μ g/mL)，混勻后在旋轉(zhuǎn)混合器上過 夜反應(yīng)；之后加入與原反應(yīng)液等體積的IM甘氨酸反應(yīng)2小時。然后將產(chǎn)物進行離心后溶于 磷酸鹽緩沖液中，即制得以膠體金為載體的酶標記抗體。隨后將反應(yīng)液在15000g和4° C 下進行離心，離心后吸走上清液并加入等體積的磷酸鹽緩沖液(PH 7. 4)重新溶解，此離心 步驟重復(fù)兩次，即制得酶標記膠體金復(fù)合抗體。
實施例2
取1. 5mL 1%的檸檬酸鈉水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，按實施 例1中步驟可制得直徑約為25nm的膠體金。同實施例1中步驟將膠體金濃縮后用0. IM鹽酸調(diào)pH值至5左右，隨后加入一定 濃度的堿性磷酸酶(AP，等電點PI =4.5)，使AP最終濃度為50 μ g/mL。除了雙功能試劑 采用N，N' - 二琥珀酰亞胺碳酸酯(N，N' - 二琥珀酰亞胺碳酸酯在溶液中的最終濃度0. 2%到 1%)，余下步驟同實施例1。
實施例3
取1. 2mL 1%的檸檬酸鈉水溶液加入到煮沸的IOOmL含0. 01%的氯金酸溶液中，按例1 中步驟可制得直徑約為40nm的膠體金。同實施例1中步驟將膠體金濃縮后用0. IM鹽酸調(diào)pH值至5左右，隨后加入一定 濃度的半乳糖苷酶(β "Gal,等電點PI =4. 6)，使β -Gal最終濃度為100 μ g/mL。余下步 驟同實施例1，除了把加入的抗體的最終濃度改為50 μ g/mL。 實施例4
同實施例1制成18nm的膠體金，將膠體金濃縮后用0. IM鹽酸調(diào)pH值至5左右，隨后 加入一定濃度的葡萄糖氧化酶(GO，PI=4.4),使GO最終濃度為50 μ g/mL，余下的步驟都 同實施例1。
權(quán)利要求
1.一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于它將膠體金溶液濃縮，然后將濃縮后的膠 體金溶液的PH調(diào)到略高于用于標記的酶的等電點的pH，將用于標記的酶的水溶液加入膠 體金溶液后混勻，再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子上，經(jīng)離心后即制 得酶標記金膠復(fù)合抗體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述用于標記的酶包 括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶。
3.如權(quán)利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所采用膠體金粒子的 直徑范圍在18 60nm之間。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述略高于用 于標記的酶的等電點的PH為高于用于標記的酶的等電點0. 4-0. 6個單位的pH。
5.如權(quán)利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述雙功能試劑為戊 二醛或N，N' - 二琥珀酰亞胺碳酸酯。
6.如權(quán)利要求1所述的一種制備酶標記抗體的方法，其特征在于所述方法包括制備用 于標記的酶溶液的步驟，它將用于標記的酶用水配成0. 1 ang/mL的澄清溶液，所述用于 標記的酶包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，半乳糖苷酶或葡萄糖氧化酶；所述方法還包括制備膠體金溶液的步驟，所述膠體金溶液通過檸檬酸鈉還原氯金酸的 方法來制備；所述方法還包括以下步驟(1)將所制備的膠體金溶液濃縮至原濃度的2倍，將濃縮過的膠體金溶液的pH值調(diào)節(jié) 到適合標記酶的最佳PH范圍，即高出用于標記的酶的等電點約0. 4-0. 6個單位的pH，然后 將該膠體金溶液與所述用于標記的酶溶液進行混合，在室溫或4° C條件下混合Ih ；隨后將混合液于15000g 4° C下離心15min，吸走上清液后加入等體積的磷酸鹽緩沖 液重新溶解，所述磷酸鹽緩沖液的PH =7. 4，即得到標記有酶的膠體金溶液；(2)將步驟(1)所得溶液中加入雙功能試劑，所述雙功能試劑選自如戊二醛或 N, N' - 二琥珀酰亞胺碳酸酯，使標記在膠體金上的酶經(jīng)雙功能試劑活化后修飾上功能基團； 隨后將反應(yīng)液在15000g 4° C下進行離心，離心后吸走上清液并加入等體積的磷酸鹽緩沖 液重新溶解，所述磷酸鹽緩沖液的PH =7. 4，此離心步驟重復(fù)進行以去除未參與反應(yīng)的多余 雙功能試劑；(3)往步驟(2)所得的產(chǎn)物中加入抗體，抗體的最終濃度為5 50μ g/mL，混勻后過 夜反應(yīng)，使抗體連接到標記在膠體金上的酶的活化的功能基團上，隨即加入封閉劑封閉掉 酶上可能殘余的雙功能試劑功能基團；然后將產(chǎn)物進行離心后溶于磷酸鹽緩沖液中，即制 得以膠體金為載體的酶標記抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備酶標記抗體的方法，它將膠體金溶液濃縮，然后將濃縮后的膠體金溶液的pH調(diào)到略高于用于標記的酶的等電點的pH，將用于標記的酶的水溶液加入膠體金溶液后混勻，再通過雙功能試劑將抗體連接到膠體金表面的酶分子上，經(jīng)離心后即制得酶標記金膠復(fù)合抗體。本發(fā)明通過直接吸附的簡捷方式完成膠體金上的酶標記；酶和偶聯(lián)劑的分離以及抗體連接后的分離純化無需引入凝膠過濾、透析或親和層析等繁瑣且高損耗的昂貴步驟，只需通過簡單的離心即可完成；膠體金吸附酶前進行的濃縮操作可以提高被連接試劑的連接量，同時可以增加酶標記膠體金復(fù)合抗體中金膠粒子的濃度酶標記金膠復(fù)合抗體同樣符合這一特征。
文檔編號G01N33/532GK102141567SQ20101059430
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月19日
發(fā)明者吳堅, 應(yīng)義斌, 李冬陽 申請人:浙江大學