專利名稱：β細(xì)胞標(biāo)記抗體的制作方法
β細(xì)胞標(biāo)記抗體本發(fā)明涉及針對(duì)β細(xì)胞標(biāo)記蛋白的抗體，尤其涉及針對(duì)蛋白ΤΜΕΜ27的抗體。功能性β細(xì)胞群的損失是1型和2型糖尿病兩者發(fā)病機(jī)理的基礎(chǔ)。因此體內(nèi)β 細(xì)胞群的非侵入性成像將為定量糖尿病的進(jìn)展和對(duì)治療干預(yù)的響應(yīng)提供有價(jià)值的診斷和研究工具。此外，體內(nèi)非侵入性和靶向β細(xì)胞siRNA遞送對(duì)于研究和治療兩者將是非常有價(jià)值的。跨膜蛋白Tmem27(C0lleCtrin)表達(dá)在胰β細(xì)胞中，其中它調(diào)節(jié)胰β細(xì)胞群和胰島素分泌。Tmem27在質(zhì)膜處通過蛋白水解切割和釋放失活。因此，需要用于定量β細(xì)胞群的診斷和/或研究工具并且需要用于靶向藥物遞送到β細(xì)胞的工具。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供針對(duì)Tmem27多肽表位的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中所述抗體針對(duì)人Tmem27多肽。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體，優(yōu)選是人源化抗體。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，已經(jīng)通過用表達(dá)Tmem27多肽(優(yōu)選人Tmem27多肽)的全細(xì)胞免疫合適的動(dòng)物產(chǎn)生所述抗體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的CDR3和可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995) 獲得的抗體的\結(jié)構(gòu)域的⑶R3。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3和可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的Vl結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體是包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域的嵌合抗體。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述抗體由雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9產(chǎn)生，該細(xì)胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)并且收到保藏號(hào) DSM ACC29950在第二個(gè)目的中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗體在制備用于治療涉及TMEM27切割和其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)的疾病的藥物中的用途。所述疾病優(yōu)選的是糖尿病。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，使用本發(fā)明的抗體作為用于胞內(nèi)遞送活性化合物的工具。所述活性化合物優(yōu)選與所述抗體共價(jià)偶聯(lián)。“活性化合物”可以是任何合適的分子，包括DNA、RNA、siRNA、蛋白、肽或藥物活性劑，諸如，例如，毒素、抗生素、抗病原藥劑、抗原、抗體、抗體片段、免疫調(diào)節(jié)劑、酶或治療藥劑。本發(fā)明的抗體適于胞內(nèi)遞送活性化合物，因?yàn)樗隹贵w通過特異靶向胰β細(xì)胞從而允許靶向胞內(nèi)遞送所述活性化合物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以用于動(dòng)物(優(yōu)選人類)胰臟中的β細(xì)胞胰島和β細(xì)胞群的體內(nèi)成像。用于體內(nèi)成像的合適方法是例如免疫-PET(正電子發(fā)射斷層掃描)。免疫-PET基于對(duì)標(biāo)記有發(fā)射正電子的核素的單克隆抗體的一致性檢測(cè)。以下正電子發(fā)射體可以用于免疫-PET 鎵-68 (68Ga ；t1/2,1. 13小時(shí))、氟-18 (18F ；t1/2,1. 83小時(shí))、銅-64 (64Cu ；t1/2,12. 7 小時(shí))、釔-86 (86Y ；t1/2,14. 7 小時(shí))、溴-76 (76Br ；t1/2,16. 2 小時(shí))、鋯-89 (89Zr ;t1/2, 78. 4 小時(shí))和碘-124 (124I ；t1/2，100. 3 小時(shí))[The Oncologist (腫瘤學(xué)家)，Vol. 12，No. 12，1379-1389，2007 年 12 月)]?？梢酝ㄟ^使用PET照相機(jī)檢測(cè)淹沒光子對(duì)(annihilation photon pairs)來監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)PET綴合物的分布。PET照相機(jī)由放置在患者身體周圍的檢測(cè)器環(huán)組成。如果位于身體相對(duì)側(cè)的檢測(cè)器在非常短的時(shí)間間隔內(nèi)(典型地5-15納秒)記錄了兩個(gè)光子，則假定沿兩個(gè)檢測(cè)器之間連線的某處淹沒事件已經(jīng)發(fā)生。通過計(jì)算所有線的交叉，可以確定輻射源(放射性標(biāo)記的mAb)的位置。術(shù)語“抗體”涵蓋抗體結(jié)構(gòu)的多種形式，包括但不限于完整的抗體和抗體片段。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選是人源化抗體、嵌合抗體或其它遺傳改造的抗體，只要根據(jù)本發(fā)明的特征性質(zhì)仍舊保留。“抗體片段”包含完整長(zhǎng)度抗體的部分，優(yōu)選其可變結(jié)構(gòu)域，或至少其抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w片段的實(shí)例包括雙抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性抗體。scFv 抗體在例如 Houston，J. S.，Methods in Enzymol (酶學(xué)方法).203 (1991) 46-96)中得到描述。此外，抗體片段包含這樣的單鏈多肽，其具有Vh結(jié)構(gòu)域的特征，即能夠與\結(jié)構(gòu)域一起組裝，或具有結(jié)合于ANG-2的\結(jié)構(gòu)域的特征，即能夠與Vh結(jié)構(gòu)域一起組裝形成功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)并由此提供性質(zhì)。術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”用于本文中時(shí)，指單一氨基酸組成的抗體分子制劑。術(shù)語“嵌合抗體”指一種抗體，其包括來自一種來源或物種的可變區(qū)，即結(jié)合區(qū)，以及源自不同來源或物種的恒定區(qū)的至少一部分，其通常通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行制備。優(yōu)選包括鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體。本發(fā)明涵蓋的“嵌合抗體”的其它優(yōu)選形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)被從初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性， 特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合。也將這種嵌合抗體稱作“類別轉(zhuǎn)換抗體”。 嵌合抗體是被表達(dá)的免疫球蛋白基因的產(chǎn)物，該基因包括編碼免疫球蛋白可變區(qū)的DNA區(qū)段和編碼免疫球蛋白恒定區(qū)的DNA區(qū)段。制備嵌合抗體的方法包括在本領(lǐng)域眾所周知的常規(guī)重組DNA和基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。見，例如^01^化011，5丄.，等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)(Proc. Natl. Acad Sci. USA) 81 (1984) 6851-6855 ；美國(guó)專利號(hào) 5，202，238 和 5，204，244。術(shù)語“人源化抗體”指這樣的抗體，其中的構(gòu)架或“互補(bǔ)性決定區(qū)”(CDR)已經(jīng)被修飾為包括與母體免疫球蛋白的CDR相比具有不同特異性的免疫球蛋白的CDR。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將鼠CDR移植到人抗體的構(gòu)架區(qū)以制備“人源化抗體”。見例如， Riechmann, L.等，自然(Nature)332(1988)323-327 ；和 Neuberger，M. S.等，自然 (Nature) 314 (1985) 268-270.特別優(yōu)選的CDR對(duì)應(yīng)于識(shí)別以上指出的關(guān)于嵌合抗體的抗原的那些代表性序列。本發(fā)明涵蓋的“人源化抗體”的其它形式是這樣的那些，其中恒定區(qū)已經(jīng)另外被從初始抗體的恒定區(qū)進(jìn)行修飾或改變以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq 結(jié)合和/或Fc受體(FcR)結(jié)合。用于本文時(shí)，術(shù)語“人抗體”意欲包括具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。人抗體是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel, J. G., 當(dāng)前化學(xué)生物學(xué)觀點(diǎn)(Curr. Opin. Chem. Biol). 5 (2001) 368-374)。人抗體還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如小鼠)中產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在免疫時(shí)能夠在缺乏內(nèi)源免疫球蛋白生成的條件下產(chǎn)生人抗體的全部所有組成成分或選擇部分(selection)。在這種種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移人種系免疫球蛋白基因陣列將導(dǎo)致在抗原攻擊時(shí)產(chǎn)生人抗體(見例如Jakobovits，Α.， 等.，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào))90 (1993) 2551-2555 Jakobovits, A.，等·，Nature (自然)362 (1993) 255-258 ；Brueggemann, M.，等·，Year Immunol.(免疫學(xué)年度)7(199 33-40)。人抗體還可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom，H. R.，和 Winter, G.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)227 (1992) 381-388 ；Marks, J. D.，等.，J. Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志)222 (1991) 581-597)。Cole等和Boerner等的技術(shù)也可以用于制備人單克隆抗體(Cole等，單克隆抗體and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌癥治療)，Alan R. Liss, ρ· 77 (1985)；禾口 Boerner, P.等，J. Immunol.(免疫學(xué)雜志)147 (1991) 86-95)。如已經(jīng)對(duì)根據(jù)本發(fā)明的嵌合和人源化抗體所提及地，術(shù)語“人抗體”用于本文中時(shí)還包括這樣的抗體，其在恒定區(qū)內(nèi)進(jìn)行修飾以產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的特性，特別是關(guān)于Clq結(jié)合和/或FcR 結(jié)合，例如通過“類別轉(zhuǎn)換”即改變或突變Fc部分(例如由IgGl到IgG4和/或IgGl/IgG4 突變。)術(shù)語“表位”包括能夠特異性結(jié)合抗體的任何多肽決定簇。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面定群(groupings)，諸如氨基酸、糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；?，并且在某些實(shí)施方案中，可以具有特定的三維結(jié)構(gòu)特征，和或特定的帶電特性。表位是被抗體結(jié)合的抗原區(qū)域。“可變結(jié)構(gòu)域”(輕鏈(Vl)的可變結(jié)構(gòu)域，重鏈(Vh)的可變結(jié)構(gòu)域)用于本文中時(shí)，表示直接參與抗體與抗原結(jié)合的每對(duì)輕鏈和重鏈結(jié)構(gòu)域。可變輕鏈和重鏈的結(jié)構(gòu)域具有相同的一般結(jié)構(gòu)且每個(gè)結(jié)構(gòu)域包括4個(gè)構(gòu)架(FR)區(qū)，所述構(gòu)架區(qū)的序列普遍保守，其通過3個(gè)“高變區(qū)”(或互補(bǔ)決定區(qū)，⑶R)相連接。構(gòu)架區(qū)采用β-折疊構(gòu)象且⑶R可以形成連接折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過構(gòu)架區(qū)保持其三維結(jié)構(gòu)并與來自另一條鏈的 CDR—起形成抗原結(jié)合位點(diǎn)?？贵w重鏈和輕鏈CDR3區(qū)在根據(jù)本發(fā)明的抗體的結(jié)合特異性/ 親和力方面發(fā)揮特別重要的作用并因此提供本發(fā)明的另一個(gè)目的。用于本文時(shí)，術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”指負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。 抗體的抗原結(jié)合部分包括來自“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”的氨基酸殘基。“構(gòu)架”或“FR”區(qū)是除本文中定義的高變區(qū)殘基之外的那些可變結(jié)構(gòu)域區(qū)域。因此，抗體的輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域從N端到C端包括結(jié)構(gòu)域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。特別地，重鏈的CDR3 是最有助于抗原結(jié)合的區(qū)域并且限定抗體的性質(zhì)。根據(jù)Kabat等，免疫目的的蛋白質(zhì)序列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第 5版，公眾健康月艮務(wù)，國(guó)家健康
(Public Health Service,National Institutes of Health) ,Bethesda,MD(1991) 的標(biāo)準(zhǔn)定義和/或來自“高變環(huán)”的那些殘基確定CDR和FR區(qū)域。術(shù)語“Tmem27多肽”用于本文時(shí)指來自任何動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物)、物種(包括人)的天然Tmem27多肽和Tmem27變體。Tmem27多肽可以分離自多種來源，包括人組織類型或由重組和/或合成方法制備。人Tmem27多肽的氨基酸序列在kq. Id. No. 7中給出。在進(jìn)一步的目的中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗體和與所述抗體共價(jià)連接的活性化合物的綴合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述活性化合物是毒素或SiRNA分子，優(yōu)選是SiRNA分子。
通過使本發(fā)明的抗體與SiRNA分子的末端基團(tuán)共價(jià)連接以A-X-Y的形式制備 siRNA-抗體綴合物的方法，所述方法包括選擇預(yù)定的siRNA分子；以及將siRNA分子共價(jià)連接到本發(fā)明的抗體，其中A是本發(fā)明的抗體，X是連接體介導(dǎo)的共價(jià)鍵，而Y是siRNA分子。制備siRNA-抗體綴合物的方法可以包括激活siRNA的官能團(tuán)，以及將激活的官能團(tuán)共價(jià)連接到所述抗體。待激活的官能團(tuán)可以包括但不限于胺基、硫醇基、磷酸基團(tuán)或其組合。在一些實(shí)施方案中，激活siRNA官能團(tuán)的物質(zhì)包括1-乙基-3，3- 二乙基氨基丙基碳二亞胺、咪唑、N-羥基琥珀酰亞胺、二氯己基-碳二亞胺、N-馬來酰亞胺基丙酸、N-馬來酰亞胺基丙氧基琥珀酰亞胺酯(N-maleimidopropyl-oxylsuccinimide ester)、N-琥珀酰亞胺基吡啶二硫丙酸酯或其組合。制備本發(fā)明的siRNA抗體綴合物的其他方法可以在Handbook of Cell Penetrating P印tides (細(xì)胞穿透肽手冊(cè))，18章，第二版，2006年4月，編輯 ο Langel中找到。在進(jìn)一步的目的中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的抗體或綴合物以及藥用載體的藥物組合物。為更好的給藥，除上述活性成分外所述組合物可以進(jìn)一步包含至少一種藥用載體。這種載體的實(shí)例包括鹽水、無菌水、林格氏液、緩沖的鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糖糊精 (水)溶液、甘油、乙醇及其化合物。如果需要，可以添加典型的添加劑諸如抗氧化劑、緩沖齊U、抑菌劑等。此外，可以通過添加更多的添加劑諸如稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑和潤(rùn)滑劑在制藥上將所述組合物制備成用于以水溶液、懸浮液、乳化液等的形式注射。本發(fā)明的藥物組合物可以通過不同的給藥途徑與身體接觸，包括靜脈內(nèi)給藥、肌肉內(nèi)給藥、動(dòng)脈內(nèi)給藥、髓內(nèi)給藥、鞘內(nèi)給藥、心臟內(nèi)給藥、經(jīng)皮給藥、皮下給藥、腹膜內(nèi)給藥、舌下給藥和局部給藥。對(duì)這樣的臨床給藥，可以使用常規(guī)技術(shù)將本發(fā)明的藥物組合物制成適當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品。可以使用例如如在美國(guó)專利號(hào)4，816，567中所述的重組方法和組合物生產(chǎn)抗體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，提供分離的編碼本文中所述的抗ΤΜΕΜ27的抗體的核酸。這種核酸可以編碼包含抗體的\的氨基酸序列和/或包含抗體的Vh的氨基酸序列(例如，抗體的輕鏈和 /或重鏈)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的一種或多種載體(例如，表達(dá)載體)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供包含這種核酸的宿主細(xì)胞。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中， 宿主細(xì)胞包含(例如，已經(jīng)轉(zhuǎn)化有)(1)包含編碼包含所述抗體的\的氨基酸序列和包含所述抗體的Vh的氨基酸序列的核酸的載體，或( 包含編碼包含所述抗體的\的氨基酸序列的核酸的第一載體和包含編碼包含所述抗體的Vh的氨基酸序列的核酸的第二載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是真核的，例如中國(guó)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或淋巴細(xì)胞(例如， Y0、NS0、Sp20細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供制備抗TMEM27抗體的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)包含編碼如以上提供的抗體的核酸的宿主細(xì)胞，在適于表達(dá)所述抗體的條件下，以及任選地從所述宿主細(xì)胞(或宿主細(xì)胞培養(yǎng)基)回收所述抗體。為重組制備本發(fā)明的抗體，分離編碼例如如上所述的抗體的核酸并將其插入到用于在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步克隆和/或表達(dá)的一種或多種載體。這種核酸可以被容易地分離并使用常規(guī)方法(例如，通過使用能夠特異性地結(jié)合編碼所述抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)測(cè)序。
適于克隆或表達(dá)編碼抗體的載體的宿主細(xì)胞包括本文所述的原核或真核細(xì)胞。例如，可以在細(xì)菌中產(chǎn)生抗體，尤其是當(dāng)不需要糖基化和Fc效應(yīng)物功能時(shí)。對(duì)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5，648，237,5, 789，199和5，840，523。(也參見 Charlton，Methods in Molecular Biology (分子生物學(xué)方法)，卷 248 (B. K. C. Lo 編輯， Humana Press, Totowa, NJ, 2003)，245-254頁，描述了在大腸桿菌中表達(dá)抗體片段)。在表達(dá)后，可以從可溶組分中的細(xì)菌細(xì)胞糊狀物(paste)分離所述抗體并將其進(jìn)一步純化。從產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆抗體基因的方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。例如，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)用免疫球蛋白特異性的引物從雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)增可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vi^PVl)的遺傳信息(Methods Mol Med (分子醫(yī)學(xué)方法)2004 ；94 :447-58)。 然后可以將編碼可變重鏈和輕鏈結(jié)構(gòu)域(Vh和VJ的核酸克隆到適于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體中。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示β細(xì)胞ΤΜΕΜ27蛋白水平與糖尿病進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。用抗胰島素(紅色)、胰高血糖素(藍(lán)色)和ΤΜΕΜ27 (綠色)的抗體給來自7或9周齡瘦(lean)或ZDF大鼠的胰臟石蠟切片染色。在胰島素抵抗但是血糖正常的7周ZDF大鼠的胰臟切片中TMEM27的表達(dá)增加，其與β細(xì)胞群擴(kuò)增相關(guān)聯(lián)，圖2顯示在2型糖尿病患者體內(nèi)ΤΜΕΜ27蛋白水平降低。對(duì)來自正常血糖供者和 2型糖尿病患者的胰臟石蠟切片的免疫組織化學(xué)染色顯示在2型糖尿病胰島中不與胰高血糖素(紅色)共定位的ΤΜΕΜ27 (綠色)顯著減少，圖3顯示允許人Tmem27以多西環(huán)素依賴的方式可誘導(dǎo)表達(dá)的INS-I穩(wěn)定細(xì)胞系的蛋白質(zhì)印跡。hTMEM27蛋白可以劑量依賴地被多西環(huán)素誘導(dǎo)，圖 4a_4k 顯示 TMEM27-8/9-Alexa488_IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 與活的 INS-hTMEM27細(xì)胞孵育的結(jié)果，圖5顯示FDA批準(zhǔn)的人組織微陣列的免疫組織化學(xué)染色。用結(jié)合有Alexa488的抗TMEM27 (克隆8/9)給人組織微陣列的石蠟切片染色，圖6a和6b顯示人和猴胰臟的免疫組織化學(xué)染色。用結(jié)合有Alexa488的 TMEM27(8/9)給人和猴胰臟的石蠟切片染色，圖7顯示在2型糖尿病猴中TMEM27蛋白水平降低。來自正常血糖的或2型糖尿病猴的胰臟的石蠟切片的免疫組織化學(xué)染色顯示在2型糖尿病猴胰島中與胰島素(紅色) 共定位的TMEM27 (綠色)顯著減少，圖8a_8i顯示對(duì)識(shí)別TMEM27的抗體特異的IgG介導(dǎo)的siRNA細(xì)胞攝取，以及圖9a和9b顯示源自表面免疫染色和細(xì)胞內(nèi)積累的siRNA標(biāo)記物Cy5的定量熒光。實(shí)驗(yàn)部分允許人Tmem27以多西環(huán)素依賴的方式可誘導(dǎo)表達(dá)的INS-I穩(wěn)定細(xì)胞系的產(chǎn)生將INS-IE細(xì)胞在包含IlmM葡萄糖(InvitrogenJi^i)并補(bǔ)充有IOmMH印es(pH 7. 3),10 % (ν/ν)熱失活的胎牛血清(Brunsctiwig AG，瑞士)、50 μ Mβ -巰基乙醇、 ImM丙酮酸鈉、SOyg/ml青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將人 TMEM27cDNA(5183554, Invitrogen)亞克隆到 pTRE2 載體(631008，Clontech)中，遵循由 Wang等描述的方法將pTRE2載體用于轉(zhuǎn)染并產(chǎn)生來源于INS-I的穩(wěn)定細(xì)胞系。選擇顯示最高可誘導(dǎo)性和最低背景的克隆INS-hTMEM27*F2。如在圖3中由蛋白質(zhì)印跡所示，hTMEM27 蛋白可以由多西環(huán)素劑量依賴地誘導(dǎo)。圖3 在存在所示濃度的多西環(huán)素的條件下將細(xì)胞培養(yǎng)Mh。在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)后用結(jié)合有辣根過氧化物酶的鼠抗人TMEM27單克隆抗體(克隆3/3)進(jìn)行免疫印跡。細(xì)胞為,瘡產(chǎn)牛鼠杭TMEM27單克降杭體使用INS-h_TMEM27克隆F2INS-1細(xì)胞通過重復(fù)注射活細(xì)胞進(jìn)行對(duì)瑞士白化小鼠的免疫。一旦該動(dòng)物顯示對(duì)hTMEM27特異性的免疫反應(yīng)，就將脾細(xì)胞移走并根據(jù)G. Kohler 禾口 C.Milstein(1975) “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity (分泌具有預(yù)定特異性的抗體的融合細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng))”. Nature (自然)256 =495-497將其融合到Ag8細(xì)胞。將TMEM27-8/9-Alexa488-IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 與活的 INS_hTMEM27 細(xì)胞孵育。INS-h-TMEM27克隆F2WT細(xì)胞在PDL包被的載玻片上生長(zhǎng)并在37°C孵育。將不同濃度的mAb' s添加到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基+500ng/ml多西環(huán)素) 0. 6ml/ 孔并在 33°C孵育 Mhrs。然后用 Dulbeccos PBS (+Ca2+/+Mg2+)漂洗細(xì)胞 IX 并用 2% 甲醛固定。圖 4a-4k 顯示 TMEM27-8/9-Alexa488_IgG 和 TMEM27-8/9-Alexa555_Fab 與活的 INS-hTMEM27細(xì)胞孵育的結(jié)果。TMEM27定位在人和猴胰島的β細(xì)胞將福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的切片用于組裝載玻片。順序地將載玻片浸泡在二甲苯(χ2)、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和IXPBS(各3分鐘)中以脫水。 通過將載玻片浸泡在IX檸檬酸緩沖液中并將其在微波(850瓦)中煮3分鐘來進(jìn)行抗原提取。在用水沖洗載玻片兩次后，在室溫用IOOyL 0.2%溶于IX PBS的Triton透化細(xì)胞10 分鐘。在用IX PBS漂洗3次后，在室溫用2%溶于IX PBS的BSA封閉30'到lh。在Ab孵育前用IX PBS再漂洗三次(1-2小時(shí)在37°C或4°C 0/N)。再漂洗三次并用DAPI染色(5_10 分鐘、室溫、暗處)。最后漂洗三次并組裝蓋玻片。圖5 :FDA批準(zhǔn)的人組織微陣列的免疫組織化學(xué)染色。用結(jié)合有Alexa488的抗 TMEM27(克隆8/9)給人組織微陣列的石蠟切片染色?？筎EMEM27特異性地染色人和猴β細(xì)胞。圖6a、6b和7 人和猴胰臟的免疫組織化學(xué)染色。用結(jié)合有Alexa488的 TMEM27(8/9)給人和猴胰臟的石蠟切片染色使用TMEM27抗體作為載體，定量細(xì)胞siRNA攝取siRNA 制備寡核糖核苷酸合成根據(jù)亞磷酰胺技術(shù)在固相上使用ABI 394合成器(Applied Biosystems)在 10 μ mol量級(jí)合成寡核糖核苷酸。RNA序列信息見于表1。在由可控孔度玻璃(CPG，520人， 具有75 μ mol/g的加載，獲得自I^rime Synthesis，ASton，PA，美國(guó))制成的固體支持物上進(jìn)行合成。常規(guī)RNA亞磷酰胺，2’ -0-甲基亞磷酰胺以及輔助試劑購自Proligo (Hamburg,德國(guó))。特別地，使用以下亞酰胺(5’ -0- 二甲氧基三苯甲基-N6-(苯甲酰)-2’ -Ο-t- 丁基二甲基硅烷基-腺苷-3’ -0-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、5’ -0-二甲氧基三苯甲基-N4-(乙酰)-2，-Ο-t-丁基二甲基硅烷基-胞苷-3，-0-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基)亞磷酰胺、(5，-0-二甲氧基三苯甲基-N2-(異丁酰)-2，-Ο-t-丁基二甲基硅烷基-鳥苷-3，-0-(2-氰基乙基-N，N-二異丙基氨基)亞磷酰胺和5，-0-二甲氧基三苯甲基-2’ -Ο-t- 丁基二甲基硅烷基-尿苷_3’ -0-(2-氰基乙基-N，N- 二異丙基氨基)亞磷酰胺。除N4-(t-丁基苯氧基乙酰)保護(hù)的2’-0_甲基-胞苷外，2’-0_甲基亞磷酰胺攜帶與常規(guī)RNA亞酰胺相同的保護(hù)基團(tuán)。所有亞酰胺都溶解在無水乙腈(IOOmM)中并添加分子篩(3人)。為了在低聚物的5，端產(chǎn)生巰基連接體，使用來源于Glen Research (Sterling, Virginia，美國(guó))的1_0_ 二甲氧基三苯甲基-己基-二硫化物、1 ‘ -[ (2-氰基乙基)-(N， N- 二異丙基)]-亞磷酰胺連接體。在mAb結(jié)合前使用TCEP減少二硫化物連接體(見下)。 對(duì)于Cy5綴合，使用6-(4-單甲氧基三苯甲基氨基)己基-(2-氰基乙基)_(N，N- 二異丙基)-亞磷酰胺(Glen Research)在寡核糖核苷酸的5’端裝配上C_6氨基連接體。將 5-乙基巰基四氮唑(ETT，500mM溶于乙腈)用作激活劑溶液。偶聯(lián)時(shí)間是6分鐘。為了引入硫代磷酸連接，使用IOOmM 3-乙氧基-1，2，4-二噻唑啉-5-酮(EDITH，獲得自Link Technologies, Lanarkshire,蘇格蘭)無水乙腈溶液。使用相應(yīng)的NHS酯(獲得自GE Healthcare, Munich，德國(guó))和攜帶有C6氨基連接體的寡核糖核苷酸將Cy5熒光染料連接到5’端。與支持物結(jié)合的低聚物的切割和去保護(hù)在結(jié)束固相合成后，將干燥的固體支持物轉(zhuǎn)移至15mL管中并用溶于甲醇的甲胺 QM，Aldrich)在45°C處理180min。在離心后，將上清轉(zhuǎn)移至新的15mL管中并且用1200yL N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP，F(xiàn)luka，BuchS，瑞士)漂洗CPG。將漂洗物(washing)與甲胺的甲醇溶液結(jié)合并添加450 μ L三乙胺三氟化氫(TEA · 3HF，Alfa Aesar，Karlsruhe，德國(guó))。 將此混合物在65°C放置150min。在冷卻到室溫后，添加0. 75mL NMP和1. 5mL乙氧基三甲基硅烷(Fluka，Buchs，瑞士)。IOmin后，通過離心收集沉淀的寡核糖核苷酸，丟棄上清并且使固體在ImL緩沖液A中再生(見下)。寡核糖核苷酸的純化通過強(qiáng)陰離子交換(SAX)HPLC使用預(yù)裝的22x 250mm DNA Pac 100柱(Dionex， Idstein，德國(guó))在AKTA Explorer系統(tǒng)(GE Healthcare)上純化未加工的寡核糖核苷酸。 緩沖液A由IOmM NaC104、lmM EDTAUOmM Tris，pH 7. 4、6M尿素和20%乙腈組成。緩沖液 B是具有500mM NaC104的緩沖液Α。采用4. 5mL/min的流速。記錄260和^Onm處的UV跡線。采用在55min內(nèi)從20% B到45% B的梯度。集中合適的級(jí)分并用3MNa0Ac，pH = 5. 2 和70%乙醇沉淀。通過RP HPLC 使用 XiTerra Prep MS C810x 50mm 柱(Waters，Eschborn，德國(guó))在 AKTA Explorer系統(tǒng)(GE Healthcare)上純化未加工的帶標(biāo)記的低聚物。緩沖液A是IOOmM 三乙基乙酸銨(Biosolve，Valkenswaard，荷蘭)而緩沖液B是包含50%乙腈的緩沖液A。 采用5mL/min的流速。記錄260、280和643nm (在Cy5的情況中)處的UV跡線。采用在58 個(gè)柱體積(CV)內(nèi)從5% B到60% B的梯度。集中合適的級(jí)分并用3M NaOAc, pH = 5. 2和 70%乙醇沉淀。最后，通過尺寸排阻層析在包含kphadex G-25 (GE Healthcare)的柱上使純化的低聚物脫鹽。通過在UV光度計(jì)中測(cè)量^Onm處的吸光度(Beckman Coulter, KrefelcMiI 國(guó))確定溶液的濃度。直到退火，將單獨(dú)的鏈作為冷凍溶液儲(chǔ)存于-20°C。使寡核糖核苷酸退火以產(chǎn)生siRNA通過結(jié)合等摩爾的RNA溶液使互補(bǔ)鏈退火。凍干所述混合物并用合適體積的退火緩沖液(IOOmM NaCl、20mM磷酸鈉，pH 6.8)使其再生以達(dá)到所需的濃度。將此溶液放置到在池內(nèi)冷卻到室溫的95°C水浴中。表l:siRNA序列信息
權(quán)利要求
1.針對(duì)Tmem27多肽的表位的抗體。
2.權(quán)利要求1的抗體，其中所述抗體針對(duì)人Tmem27多肽。
3.權(quán)利要求1或2的抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
4.權(quán)利要求1至3的抗體，其中所述抗體已經(jīng)通過表達(dá)Tmem27多肽、優(yōu)選人Tmem27多肽的全細(xì)胞免疫合適的動(dòng)物產(chǎn)生。
5.權(quán)利要求1至4的抗體，其中所述抗體包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的CDR3和可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995) 獲得的抗體的\結(jié)構(gòu)域的⑶R3。
6.權(quán)利要求1至5的抗體，其中所述抗體包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3和可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的Vl結(jié)構(gòu)域的CDRl至CDR3。
7.權(quán)利要求1至6的抗體，其中所述抗體包含可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域和\結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1至7的抗體，其中所述抗體由雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9產(chǎn)生，所述細(xì)胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)并且收到保藏號(hào) DSM ACC29950
9.用作藥物的權(quán)利要求1至8的抗體。
10.權(quán)利要求1至8的抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療涉及調(diào)節(jié)TMEM27 切割及其信號(hào)傳導(dǎo)途徑的疾病，優(yōu)選糖尿病。
11.用于治療糖尿病的權(quán)利要求1至8的抗體。
12.權(quán)利要求1至8的抗體用于β細(xì)胞胰島和β細(xì)胞群在動(dòng)物的胰中體內(nèi)成像的用途。
13.一種綴合物，所述綴合物包含權(quán)利要求1至8的抗體和與所述抗體共價(jià)連接的活性化合物。
14.權(quán)利要求13的綴合物，其中所述活性化合物是毒素或siRNA分子，優(yōu)選siRNA分子。
15.雜交瘤細(xì)胞系ΤΜΕΜ27-8/9，所述細(xì)胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ(德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心)并且收到保藏號(hào)DSM AC(^995。
16.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9(DSM ACC2995)獲得的抗體的Vh結(jié)構(gòu)域的序列。
17.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼可從雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9 (DSM ACC2995)獲得的抗體的\結(jié)構(gòu)域的序列。
18.一種核酸分子，所述核酸分子包含編碼由雜交瘤細(xì)胞系TMEM27-8/9產(chǎn)生的抗體的序列，所述細(xì)胞系于2009年5月27日保藏于DSMZ (德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心) 并且收到保藏號(hào)DSM AC(^995。
19.包含權(quán)利要求16至18的核酸序列的載體。
20.包含權(quán)利要求19的載體的宿主細(xì)胞。
21.如本文之前所述的、尤其是根據(jù)上述實(shí)施例的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對(duì)β細(xì)胞標(biāo)記蛋白的抗體，尤其涉及針對(duì)蛋白TMEM27的抗體。
文檔編號(hào)C07K16/28GK102471383SQ201080034289
公開日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日
發(fā)明者克里斯蒂亞諾·米廖里尼, 桑納何·索夫曼·詹森, 王海燕, 胡格斯·馬蒂勒, 謝斯廷·揚(yáng)-霍夫曼 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司