本發(fā)明涉及有效成分測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的方法。

背景技術(shù)：

保肝劑是以中藥材山茱萸為主經(jīng)提取獲得的制劑，主要活性成分為莫諾苷(morroniside)、馬錢苷(1oganin)、山茱萸新苷(cornuside)、齊墩果酸(oleanolic acid)和熊果酸(ursolic acid)。其中，莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物(Iridoids)，具有降糖降脂、保肝利膽、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗氧化以及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等藥理活性；齊墩果酸和熊果酸屬于有機(jī)酸類化合物，是一對(duì)結(jié)構(gòu)類似的五環(huán)三萜類同分異構(gòu)體，能夠通過降低血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性、阻止胸腺萎縮、增加超氧化物歧化酶表達(dá)、降低丙二醛含量，減輕肝細(xì)胞腫脹、灶性壞死和匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤等病理形態(tài)學(xué)損傷來改善肝功能，進(jìn)而起到對(duì)抗由刀豆蛋白A(ConA)誘導(dǎo)的急性免疫性肝損傷的作用。

基于莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)與再生作用，將這5種活性成分作為保肝劑的活性質(zhì)控成分。但是，齊墩果酸和熊果酸是一對(duì)結(jié)構(gòu)相近的同分異構(gòu)體，且水溶性極差，在乙腈與0.1％磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，兩峰重疊不能分開；同時(shí)，齊墩果酸和熊果酸與莫諾苷、馬錢苷和山茱萸新苷的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)差異較大，進(jìn)一步增加了同時(shí)檢測這5種活性成分含量的難度。現(xiàn)有技術(shù)中沒有同時(shí)檢測這5種活性成分含量的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的方法，該方法分離度好、靈敏度高、重復(fù)性高、回收率較高，為以此5種活性成分為質(zhì)量檢測指標(biāo)的制劑提供了有效的檢測手段。

本發(fā)明提供了一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的方法，包括以下步驟：

(1)在超聲條件下，采用極性有機(jī)溶劑對(duì)待測樣品進(jìn)行提取，得到提取液；

(2)將所述步驟(1)得到的提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測樣品的液相色譜圖，得到待測樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量；其中，所述高效液相色譜的色譜條件為：

流動(dòng)相：流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2～3mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％；

梯度洗脫程序：0～10min，流動(dòng)相A由10％增加至13％；10～11min，流動(dòng)相A由13％增加至15％；11～15min，流動(dòng)相A由15％增加至20％；15～39min，流動(dòng)相A由20％增加至42％；39～42min，流動(dòng)相A由42％增加至55％；42～46min，流動(dòng)相A由55％增加至60％；46～76min，流動(dòng)相A由60％增加至85％；

檢測器：VWD檢測器。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中超聲的功率為200～300W。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中超聲的頻率為35～45kHz。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中超聲的溫度為25～35℃。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中超聲的時(shí)間為25～35min。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中進(jìn)行高效液相色譜分析前，將所述提取液過0.22μm微孔濾膜。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中流動(dòng)相的體積流量為0.8～1.2mL/min。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)采用分段變波長測定，所述分段變波長測定的程序?yàn)椋篬0，15)min，檢測波長為240nm，[15，40)min，檢測波長為218nm，[40，56)min，檢測波長為360nm，[56，76]min，檢測波長為210nm。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)采用的色譜柱為Zorbax SB-C18柱。

優(yōu)選的，所述步驟(2)中進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)的柱溫為25～35℃。

本發(fā)明提供了一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的方法，首先在超聲條件下，采用極性有機(jī)溶劑對(duì)待測樣品進(jìn)行提取，得到提取液；然后將得到的提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測樣品的液相色譜圖，得到待測樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。采用本發(fā)明提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。本發(fā)明提供的方法分離度好，各組分的分離均能達(dá)到基線分離，尤其能夠?qū)⒛Z苷的兩種環(huán)口差向異構(gòu)體成功分離為兩個(gè)獨(dú)立的色譜峰(分離度R＝2.2)，且能夠?qū)崿F(xiàn)齊墩果酸和熊果酸完全分離(分離度R≥3.0)；靈敏度高，根據(jù)信噪比(S/N)為3得到5種活性成分的最低檢測限分別為莫諾苷0.247mg/L、馬錢苷0.294mg/L、山茱萸新苷0.0593mg/L、齊墩果酸2.28mg/L、熊果酸2.76mg/L；重復(fù)性高，對(duì)同一批樣品進(jìn)行6次平行測定，結(jié)果顯示莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.29％、1.43％、1.39％、1.57％和1.64％；回收率較高，加樣回收率試驗(yàn)中，莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為96.97％、95.89％、97.99％、96.65％、97.46％，RSD分別為1.79％、1.57％、1.91％、1.85％、1.77％。本發(fā)明提供的方法為以此5種活性成分為質(zhì)量檢測指標(biāo)的制劑提供了有效的檢測手段。

附圖說明

圖1為莫諾苷的兩種環(huán)口差向異構(gòu)體的色譜圖；

圖2為未除去干擾峰的混合對(duì)照品溶液的色譜圖；

圖3為除去干擾峰的混合對(duì)照品溶液的色譜圖；

圖4為保肝劑樣品的色譜圖；

圖5為未除去干擾峰的流動(dòng)相色譜圖；

圖6為除去干擾峰的流動(dòng)相色譜圖；

圖7為不含γ-環(huán)糊精的流動(dòng)相的色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的方法，包括以下步驟：

(1)在超聲條件下，采用極性有機(jī)溶劑對(duì)待測樣品進(jìn)行提取，得到提取液；

(2)將所述步驟(1)得到的提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測樣品的液相色譜圖，得到待測樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量；其中，所述高效液相色譜的色譜條件為：

流動(dòng)相：流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2～3mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％；

梯度洗脫程序：0～10min，流動(dòng)相A由10％增加至13％；10～11min，流動(dòng)相A由13％增加至15％；11～15min，流動(dòng)相A由15％增加至20％；15～39min，流動(dòng)相A由20％增加至42％；39～42min，流動(dòng)相A由42％增加至55％；42～46min，流動(dòng)相A由55％增加至60％；46～76min，流動(dòng)相A由60％增加至85％；

檢測器：VWD檢測器。

本發(fā)明在超聲條件下，采用極性有機(jī)溶劑對(duì)待測樣品進(jìn)行提取，得到提取液。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體選擇保肝劑(液體制劑)作為樣品，將所述保肝劑進(jìn)行蒸干處理，然后將得到的殘余物作為待測樣品進(jìn)行提取。本發(fā)明對(duì)于所述蒸干處理所采用的蒸干方式?jīng)]有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的蒸干方式即可。本發(fā)明優(yōu)選采用水浴蒸干。

本發(fā)明對(duì)于進(jìn)行提取時(shí)采用的超聲條件沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的超聲條件即可。在本發(fā)明中，所述超聲的功率優(yōu)選為200～300W，更優(yōu)選為230～270W；所述超聲的頻率優(yōu)選為35～45kHz，更優(yōu)選為38～42kHz；所述超聲的溫度優(yōu)選為25～35℃，更優(yōu)選為28～32℃；所述超聲的時(shí)間優(yōu)選為25～35min，更優(yōu)選為28～32min。

本發(fā)明對(duì)于進(jìn)行提取時(shí)采用的極性有機(jī)溶劑的種類沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的能夠用于提取莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的色譜純極性有機(jī)溶劑即可。本發(fā)明優(yōu)選采用乙醇對(duì)待測樣品進(jìn)行提取。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體采用體積百分含量為85％的乙醇水溶液作為提取劑。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體是將待測樣品與體積百分含量為85％的乙醇水溶液混合，稱重，提取結(jié)束后，用體積百分含量為85％的乙醇水溶液填補(bǔ)提取過程中損失的質(zhì)量，得到提取液。

得到提取液后，本發(fā)明將所述提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測樣品的液相色譜圖，得到待測樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量；其中，所述高效液相色譜的色譜條件為：

流動(dòng)相：流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2～3mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％；

梯度洗脫程序：0～10min，流動(dòng)相A由10％增加至13％；10～11min，流動(dòng)相A由13％增加至15％；11～15min，流動(dòng)相A由15％增加至20％；15～39min，流動(dòng)相A由20％增加至42％；39～42min，流動(dòng)相A由42％增加至55％；42～46min，流動(dòng)相A由55％增加至60％；46～76min，流動(dòng)相A由60％增加至85％；

檢測器：VWD檢測器。

進(jìn)行高效液相色譜分析前，本發(fā)明優(yōu)選將所述提取液過0.22μm微孔濾膜。

本發(fā)明優(yōu)選在進(jìn)行高效液相色譜分析前，對(duì)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品進(jìn)行紫外掃描測試，結(jié)果表明，莫諾苷和馬錢苷的最大紫外吸收波長為240nm，山茱萸新苷的最大紫外吸收波長為218nm，齊墩果酸和熊果酸的最大紫外吸收波長為210nm。但是，為了完全能分離同分異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸，在流動(dòng)相B中添加的γ-環(huán)糊精會(huì)于46.215min、49.831min及53.083min出現(xiàn)3個(gè)大的干擾峰；為了除去干擾峰，本發(fā)明優(yōu)選在[40，56)min，檢測波長為360nm，在不影響5種活性成分含量測定的情況下能夠達(dá)到去除干擾峰的目的，而且譜圖外觀漂亮。

進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，本發(fā)明優(yōu)選采用分段變波長測定，所述分段變波長測定的程序優(yōu)選為：[0，15)min，檢測波長為240nm，[15，40)min，檢測波長為218nm，[40，56)min，檢測波長為360nm，[56，76]min，檢測波長為210nm。

在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相的體積流量優(yōu)選為0.8～1.2mL/min，更優(yōu)選為1.0mL/min。

在本發(fā)明中，進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)采用的色譜柱優(yōu)選為Zorbax SB-C18柱。

在本發(fā)明中，進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)的柱溫優(yōu)選為25～35℃，更優(yōu)選為30℃。

在本發(fā)明中，進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)的進(jìn)樣量優(yōu)選為3μL。

將所述提取液進(jìn)行高效液相色譜分析后，本發(fā)明根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測樣品的液相色譜圖，得到待測樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。在本發(fā)明中，所述莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量含量與色譜峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在本發(fā)明中，建立莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法優(yōu)選包括以下步驟：

提供不同濃度的莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液；

將所述不同濃度的混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)行高效液相色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)濃度作線性方程，分別得到莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明首先提供不同濃度的莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸混合對(duì)照品溶液。本發(fā)明對(duì)于所述混合對(duì)照品溶液中溶劑的種類沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于配制所述混合對(duì)照品溶液的溶劑即可。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體采用乙醇為溶劑。

本發(fā)明對(duì)于配制混合對(duì)照品溶液的方法沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的配制溶液的技術(shù)方案即可。在本發(fā)明的實(shí)施例中，具體是分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品1.6、3.6、1.4、1.6、2.0mg，采用乙醇為溶劑，配成1.2mL的混合對(duì)照品溶液；將所得混合對(duì)照品溶液進(jìn)行倍比稀釋，得到不同稀釋濃度的混合對(duì)照品溶液，所述混合對(duì)照品溶液中莫諾苷的質(zhì)量濃度分別為1333.33、666.67、333.33、166.67、83.33、41.67、20.83、10.42mg/L，馬錢苷的質(zhì)量濃度分別為3000.00、1500.00、750.00、375.00、187.5、93.75、46.88、23.44mg/L，山茱萸新苷的質(zhì)量濃度分別為1166.67、583.33、291.67、145.03、72.92、36.46、18.23、9.11mg/L，齊墩果酸的質(zhì)量濃度分別為1333.33、666.67、333.33、166.67、83.33、41.67、20.83、10.42mg/L，熊果酸的質(zhì)量濃度分別為1666.67、833.33、416.67、208.33、104.17、52.08、26.04、13.02mg/L。

得到不同稀釋濃度的混合對(duì)照品溶液后，按照所述混合對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度從大到小依次排列，本發(fā)明優(yōu)選采用后6個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液分別進(jìn)行高效液相色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)濃度作線性方程，得到莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本發(fā)明優(yōu)選將所述混合對(duì)照品溶液過0.22μm微孔濾膜后，再進(jìn)行高效液相色譜分析。在本發(fā)明中，所述高效液相色譜分析的條件優(yōu)選與本申請上述技術(shù)方案中測定待測樣品時(shí)采用的高效液相色譜分析的條件一致。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述高效液相色譜分析的條件具體如下：

流動(dòng)相：流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％；

梯度洗脫程序：0～10min，流動(dòng)相A由10％增加至13％；10～11min，流動(dòng)相A由13％增加至15％；11～15min，流動(dòng)相A由15％增加至20％；15～39min，流動(dòng)相A由20％增加至42％；39～42min，流動(dòng)相A由42％增加至55％；42～46min，流動(dòng)相A由55％增加至60％；46～76min，流動(dòng)相A由60％增加至85％；

分段變波長測定的程序：[0，15)min，檢測波長為240nm，檢測莫諾苷和馬錢苷；[15，40)min，檢測波長為218nm，檢測山茱萸新苷；[40，56)min，檢測波長為360nm，去除流動(dòng)相的干擾峰；[56，76]min，檢測波長為210nm，檢測齊墩果酸和熊果酸；

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃；

進(jìn)樣量：3μL；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵(G1311C)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329B)、VWD檢測器(G1314F)和色譜工作站。

莫諾苷的結(jié)構(gòu)式如下：

文獻(xiàn)(Bock K.,Jensen S.R.,Nielsen B.J..Acta Chem.Scand.B,1976,30(8):743-748)指出，化合物莫諾苷的分子結(jié)構(gòu)在第7位存在半縮醛結(jié)構(gòu)，由于7-OH可有不同的取向，能夠形成兩種構(gòu)型，稱為環(huán)口差向異構(gòu)體。莫諾苷的兩種環(huán)口差向異構(gòu)體在常溫溶液中可相互轉(zhuǎn)化，從而形成動(dòng)態(tài)平衡。莫諾苷的兩種環(huán)口差向異構(gòu)體在本發(fā)明提供的色譜條件下成功分離為兩個(gè)獨(dú)立的色譜峰(分離度R＝2.2)，分別記為莫諾苷1和莫諾苷2，見圖1，圖1中1為莫諾苷1，2為莫諾苷2。本發(fā)明利用Agilent 1260型高效液相色譜儀提供的化合物組功能分析軟件，能夠得到莫諾苷1和莫諾苷2的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍具體見下表：

其中，C分別為莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量濃度，A分別對(duì)應(yīng)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的高效液相色譜圖峰面積積分值。

根據(jù)所述莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以得到提取液中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量含量，進(jìn)而得到樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。其中，所述莫諾苷以環(huán)口差向異構(gòu)體形式存在，記為莫諾苷1和莫諾苷2，所述莫諾苷1和莫諾苷2的總濃度為莫諾苷的真實(shí)濃度。本發(fā)明利用Agilent 1260型高效液相色譜儀提供的化合物組功能分析軟件，能夠得到提取液中莫諾苷的真實(shí)質(zhì)量含量，進(jìn)而得到樣品中莫諾苷的真實(shí)含量。

下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)照品莫諾苷(批號(hào)20150617)、山茱萸新苷(批號(hào)20140529)、馬錢苷(批號(hào)20150112)、齊墩果酸(批號(hào)20150826)和熊果酸(批號(hào)20150727)均購自上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98.0％。

分別精密稱取莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸對(duì)照品1.6、3.6、1.4、1.6、2.0mg，采用乙醇為溶劑，配成1.2mL的混合對(duì)照品溶液；將所得混合對(duì)照品溶液進(jìn)行倍比稀釋，得到不同稀釋濃度的混合對(duì)照品溶液，所述混合對(duì)照品溶液中莫諾苷的質(zhì)量濃度分別為1333.33、666.67、333.33、166.67、83.33、41.67、20.83、10.42mg/L，馬錢苷的質(zhì)量濃度分別為3000.00、1500.00、750.00、375.00、187.5、93.75、46.88、23.44mg/L，山茱萸新苷的質(zhì)量濃度分別為1166.67、583.33、291.67、145.03、72.92、36.46、18.23、9.11mg/L，齊墩果酸的質(zhì)量濃度分別為1333.33、666.67、333.33、166.67、83.33、41.67、20.83、10.42mg/L，熊果酸的質(zhì)量濃度分別為1666.67、833.33、416.67、208.33、104.17、52.08、26.04、13.02mg/L；

按照所述混合對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度從大到小依次排列，將后6個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液過0.22μm微孔濾膜，然后分別進(jìn)行高效液相色譜分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，峰面積對(duì)濃度作線性方程，得到莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，所述高效液相色譜分析的條件具體如下：

流動(dòng)相：流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％；

梯度洗脫程序：0～10min，流動(dòng)相A由10％增加至13％；10～11min，流動(dòng)相A由13％增加至15％；11～15min，流動(dòng)相A由15％增加至20％；15～39min，流動(dòng)相A由20％增加至42％；39～42min，流動(dòng)相A由42％增加至55％；42～46min，流動(dòng)相A由55％增加至60％；46～76min，流動(dòng)相A由60％增加至85％

分段變波長測定的程序：[0，15)min，檢測波長為240nm，檢測莫諾苷和馬錢苷；[15，40)min，檢測波長為218nm，檢測山茱萸新苷；[40，56)min，檢測波長為360nm，去除流動(dòng)相的干擾峰；[56，76]min，檢測波長為210nm，檢測齊墩果酸和熊果酸；

色譜柱：Zorbax SB-C18柱(150mm×4.6mm，5μm)，柱溫30℃；

進(jìn)樣量：3μL；

高效液相色譜儀：Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括四元泵(G1311C)、自動(dòng)進(jìn)樣器(G1329B)、VWD檢測器(G1314F)和色譜工作站。

所述莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1：

表1莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

表1中，C分別為莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的質(zhì)量濃度，A分別對(duì)應(yīng)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的高效液相色譜圖峰面積積分值。

在上述高效液相色譜分析的條件下，根據(jù)信噪比(S/N)為3得到5種活性成分的最低檢測限分別為莫諾苷0.247mg/L、馬錢苷0.294mg/L、山茱萸新苷0.0593mg/L、齊墩果酸2.28mg/L、熊果酸2.76mg/L。

(2)提取液的制備

以保肝劑作為樣品，所述保肝劑是由天津市第一中心醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行研制、以中藥材山茱萸為主制備得到的液體制劑，批號(hào)分別為20150316、20150629、20150716、20150817、20150929和20160316；所述山茱萸藥材(產(chǎn)品批號(hào)131203)購自中國安國市昌達(dá)中藥材飲片有限公司。

取保肝劑1mL置于聚乙烯塑料管中，水浴蒸干，加入體積百分含量為85％的乙醇水溶液1mL，稱重；在250W、40kHz、30℃條件下超聲提取30min，用體積百分含量為85％的乙醇填補(bǔ)損失的質(zhì)量，得到提取液。

(3)高效液相色譜分析

將所得提取液過0.22μm微孔濾膜，按照建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的高效液相色譜條件對(duì)過濾后的提取液進(jìn)行高效液相色譜分析，根據(jù)莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線與提取液的液相色譜圖，可以得到提取液中各化合物的質(zhì)量含量，進(jìn)而得到保肝劑樣品中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量。

圖2～7分別為混合對(duì)照品溶液、保肝劑樣品以及流動(dòng)相的高效液相色譜圖，圖2～7中，1為莫諾苷1、2為莫諾苷2、3為馬錢苷、4為山茱萸新苷、5為齊墩果酸、6為熊果酸；A為46.215min干擾峰；B為49.831min干擾峰；C為53.083min干擾峰。

為了能夠完全分離同分異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸，在流動(dòng)相B中添加的2mmol/L的γ-環(huán)糊精會(huì)于46.215min、49.831min及53.083min出現(xiàn)3個(gè)干擾峰；在[40，56)min，檢測波長為360nm，能夠達(dá)到去除干擾峰的目的。圖2為未除去干擾峰的混合對(duì)照品溶液的色譜圖，其中，在[40，56)min，檢測波長為210nm，如圖2所示，保留時(shí)間為46.215min、49.831min及53.083min處出現(xiàn)3個(gè)干擾峰。圖3為除去干擾峰的混合對(duì)照品溶液的色譜圖，即在[40，56)min，檢測波長為360nm，如圖3所示，保留時(shí)間為46.215min、49.831min及53.083min處的干擾峰消失。說明本發(fā)明提供的技術(shù)方案能夠在不影響5種活性成分含量測定的情況下成功去除干擾峰，而且色譜圖外觀漂亮。

圖4為保肝劑樣品的色譜圖，由圖4可知，莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸各組分的分離均能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度好。

圖5為未除去干擾峰的流動(dòng)相色譜圖，其中，進(jìn)樣流動(dòng)相中流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為1：1(其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％)，在[40，56)min，檢測波長為210nm；圖6為除去干擾峰的流動(dòng)相色譜圖，其中，進(jìn)樣流動(dòng)相中流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為1：1(其中，流動(dòng)相A為乙腈；流動(dòng)相B為γ-環(huán)糊精的磷酸水溶液，所述流動(dòng)相B中γ-環(huán)糊精的摩爾濃度為2mmol/L，磷酸的體積百分含量為0.1％)，在[40，56)min，檢測波長為360nm；圖7為不含γ-環(huán)糊精的流動(dòng)相的色譜圖，其中，進(jìn)樣流動(dòng)相中流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的體積比為1：1(其中，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為體積百分含量為0.1％磷酸水溶液)，在[40，56)min，檢測波長為210nm。圖5～7佐證了干擾峰確為γ-環(huán)糊精所為；除此以外，未見其它干擾峰相擾。

(4)精密度試驗(yàn)

取含莫諾苷41.67mg/L、馬錢苷93.75mg/L、山茱萸新苷36.46mg/L、齊墩果酸41.67mg/L和熊果酸52.08mg/L的混合對(duì)照品溶液，在步驟(3)所述高效液相色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.36％、1.41％、1.26％、1.62％和1.77％，說明本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有較好的精密度。

(5)穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批保肝劑(批號(hào)20160316)作為樣品，按照步驟(2)所述方法處理后，分別在0、4、8、12、24、48h按照步驟(3)所述高效液相色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.22％、1.37％、1.25％、1.51％和1.46％，說明所述樣品在48h內(nèi)穩(wěn)定。

(6)重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批保肝劑(批號(hào)20160316)作為樣品，按照步驟(2)所述方法平行制備6份提取液，按照步驟(3)所述高效液相色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸峰面積的RSD分別為1.29％、1.43％、1.39％、1.57％和1.64％，說明本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有較好的重復(fù)性。

(7)加樣回收率試驗(yàn)

取已測定的保肝劑(批號(hào)20160316)1mL，平行9份，分為3組，每組中分別加入0.1mL混合對(duì)照品溶液(莫諾苷的質(zhì)量濃度分別為166.67、83.33、41.67mg/L、馬錢苷的質(zhì)量濃度分別為375、187.5、93.75mg/L、山茱萸新苷的質(zhì)量濃度分別為145.03、72.92、36.46mg/L、齊墩果酸的質(zhì)量濃度分別為166.67、83.33、41.67mg/L和熊果酸的質(zhì)量濃度分別為208.33、104.17、52.08mg/L)，按照步驟(2)所述方法處理后，再按照步驟(3)所述高效液相色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的平均回收率分別為96.97％、95.89％、97.99％、96.65％、97.46％，RSD分別為1.79％、1.57％、1.91％、1.85％、1.77％。

(8)樣品測定

取6批保肝劑樣品(批號(hào)分別為20150316、20150629、20150716、20150817、20150929、20160316)各1mL，按照步驟(2)所述方法處理后，再按照步驟(3)所述高效液相色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果見表2。由表2可知，6批保肝劑中含莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的平均質(zhì)量濃度分別在659.9～683.0、849.1～869.1、93.0～96.0、163.21～169.9、84.6～87.0mg/L。

表2保肝劑樣品測定結(jié)果

從以上實(shí)施例可以看出，采用本發(fā)明提供的方法能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)測定莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷、齊墩果酸和熊果酸的含量，且分離度好、靈敏度高、重復(fù)性高、回收率較高，為以此5種活性成分為質(zhì)量檢測指標(biāo)的制劑提供了有效的檢測手段。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。