本發(fā)明屬于植物營養(yǎng)診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法。

背景技術(shù)：

茶業(yè)是我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，其鮮葉的產(chǎn)量和質(zhì)量對這一產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益起著重要的作用。氮素是茶樹生長發(fā)育的重要元素之一，適時(shí)適量地施用氮肥能提高鮮葉的產(chǎn)量和質(zhì)量。因此，診斷茶樹氮素營養(yǎng)狀況、研究氮高效利用機(jī)理和選育氮高效利用品種已成為近年來的研究熱點(diǎn)。

化學(xué)分析診斷是利用化學(xué)方法測定植株葉片或整個(gè)植株的氮素含量， 再與氮素營養(yǎng)正常的植株進(jìn)行比較，做出氮素豐缺的判斷 。化學(xué)分析診斷方法主要有植物、葉片全氮含量的測定、植株硝酸鹽診斷和土壤化學(xué)診斷。日本前原三利等的研究結(jié)果表明， 氮素對茶樹生育的臨界值分別是：上葉位 （葉齡 12 月）為4.6%，下葉位（葉齡2 月以上）為 4.0 %，全根為2.7 %，水溶性氮含量及與全氮的比值，上葉位分別為 1.4 %和 31 %，根部分別為1.3 %和47 %，其中，臨界值就是茶樹獲得最好的生育和最高產(chǎn)量時(shí)體內(nèi)氮素的最低濃度。 楊亦揚(yáng)等研究了利用葉綠素儀 SPAD502 進(jìn)行茶樹氮素營養(yǎng)快速診斷的適用性，表明茶樹新梢產(chǎn)量與氮素用量、成熟葉氮素含量之間呈線性正相關(guān)，施肥量達(dá)到一定水平后，新梢產(chǎn)量處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，成熟葉的 SPAD 值與全氮含量呈顯著線性正相關(guān)，并于茶樹產(chǎn)量存在著比較明顯的關(guān)系拐點(diǎn)。周小生等運(yùn)用CCM200 預(yù)測茶樹葉片葉綠素與全氮含量的適用性和對氮素豐缺的敏感葉位，研究發(fā)現(xiàn)下葉位葉片對氮肥豐缺的敏感程度高于上葉位，并提出將第 6 葉與 第 1 葉的相對葉位葉色差指數(shù)（DSI）作為診斷茶樹氮素營養(yǎng)狀況的指標(biāo)。但是研究發(fā)現(xiàn)，由于茶樹葉色、葉綠素含量和全氮含量受品種、季節(jié)和土壤質(zhì)地影響顯著，導(dǎo)致確定茶樹氮肥豐缺的臨界點(diǎn)困難，限制了其在茶樹氮素營養(yǎng)診斷中的應(yīng)用。因此，建立更為科學(xué)準(zhǔn)確的茶樹氮素營養(yǎng)診斷技術(shù)，減少茶樹遺傳背景差異對氮素營養(yǎng)診斷的干擾，為茶園施肥提供技術(shù)參考，在現(xiàn)代化的茶園管理中具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法的技術(shù)方案，采集茶樹樹冠表層成熟葉片，利用高效液相色譜方法測定成熟葉片中的茶氨酸含量，將茶樹成熟葉片中茶氨酸含量與正常氮素條件下成熟葉片中茶氨酸含量的比值定義為茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)；該指數(shù)數(shù)值越大表明茶樹氮素營養(yǎng)水平越高。

所述的一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法，其特征在于包括以下步驟：

1）樣品采集：選取茶樹樹梢上部發(fā)育良好的成熟葉片，既樹冠表層的成熟葉片，摘取葉片20-50片；

2）葉片清洗及烘干：將步驟1）中的葉片用干凈的濕紗布擦拭干凈后，放入網(wǎng)袋中，用名茶烘干機(jī)110-130℃鼓風(fēng)干燥至足干；

3）樣品粉碎與浸提處理：將步驟2）中烘干的茶葉樣品粉碎、過篩，得到茶葉碎末；準(zhǔn)確稱取茶葉碎末0.1g，分別置于10 ml離心管中，加入8 ml沸水，100℃沸水浴浸提25-35 min，每10 min搖晃混勻一次，超濾離心，將過濾液轉(zhuǎn)移到10 ml容量瓶，定容至10 ml；取5 ml溶液，用0.22μm水系濾膜過濾，得到茶葉樣品浸提液；

4）HPLC測定茶氨酸含量：樣品浸提液中茶氨酸含量采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行測定，樣品茶氨酸含量 = 100X茶葉樣品浸提液中茶氨酸含量；

5）茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)計(jì)算：茶樹氮素營養(yǎng)狀態(tài)與茶氨酸含量成正比；將茶樹成熟葉片中茶氨酸含量與正常氮素條件下成熟葉片中茶氨酸含量的比值定義為茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)；

6）茶樹氮素營養(yǎng)診斷：如氮素營養(yǎng)指數(shù)≦0.70，則診斷為氮素缺乏，需要施用氮肥；如氮素營養(yǎng)指數(shù)診斷>0.70,則診斷為氮素營養(yǎng)充足。

所述的一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法，其特征在于步驟1)中：摘取葉片25-45片，優(yōu)選30-40片。

所述的一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法，其特征在于步驟2)中：葉片用干名茶烘干機(jī)115-120℃鼓風(fēng)干燥至足干。

所述的一種茶樹氮素營養(yǎng)的診斷方法，其特征在于步驟3)中：茶葉碎末100℃沸水浴浸提28-30 min。

上述一種茶樹氮素營養(yǎng)診斷方法，采集茶樹樹冠表層成熟葉片，利用高效液相色譜方法測定成熟葉片中的茶氨酸含量，將茶樹成熟葉片中茶氨酸含量與正常氮素條件下成熟葉片中茶氨酸含量的比值定義為茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)，對茶樹氮素營養(yǎng)進(jìn)行化學(xué)分析評價(jià)，減少了茶樹遺傳背景差異對氮素營養(yǎng)診斷的干擾，為茶園施肥提供技術(shù)參考，在現(xiàn)代化的茶園管理中具有重要意義。

附圖說明

圖1 為不同氮素處理下，6個(gè)茶樹品種（系）成熟葉葉色SPAD值的差異圖；

圖2為不同氮素處理下，成熟葉片中的主要氨基酸的含量差異圖；

圖3 不同氮素處理下，6個(gè)茶樹品種（系）成熟葉片中茶氨酸的含量。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例一

1.試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013-2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗(yàn)地完成。試驗(yàn)所采用6個(gè)品種（系）為龍井43、芽大、18A、LY002、LY011及LY20B。

2.試驗(yàn)設(shè)置

2013年10月，每品種（系）選取40株生長一致的14月齡扦插苗，按照雙株側(cè)窩種植，大行距 150cm，小行距 40cm，穴距 33cm。施肥處理：茶苗按照大田常規(guī)管理示范進(jìn)行，施肥方式為單側(cè)開溝施用尿素及餅肥。

3.成熟葉片葉色差異及SPAD值比較

于2016年4月，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)離施肥溝茶樹行（缺N處理,L）的成熟葉片的發(fā)黃，與近施肥溝茶樹行（正常N處理，H）的成熟葉片的葉色與之間存在差異。

選取茶樹新梢上發(fā)育良好的葉片20片，進(jìn)行SPAD值測定。利用葉綠素含量測定儀SPAD-502進(jìn)行SPAD值測定。SPAD值測定結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)，缺氮素（L）處理下，6個(gè)茶樹品種（系）成熟葉的葉色SPAD值均顯著低于正常氮(H)處理下的葉色SPAD值。如圖1所示，研究發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種（系）的葉色SPAD值也存在顯著差異，如龍井43在缺N處理下的葉色SPAD值為73.78,大于正常氮素處理下茶樹品系LY011的葉色SPAD值（71.78）。這說明，當(dāng)用葉片SPAD值進(jìn)行茶樹氮素營養(yǎng)診斷指標(biāo)時(shí)，容易受到不同茶樹品種（系）背景差異的干擾。利用葉色進(jìn)行茶樹氮素營養(yǎng)診斷時(shí)，判斷不同茶樹品種（系）氮素豐缺度的葉色值的閾值會有較大的不同。

4.樣品采集及烘干：選取茶樹樹梢上部發(fā)育良好的成熟葉片，既樹冠表層的成熟葉片，摘取葉片20-50片；然后，葉片用干凈的濕紗布擦拭干凈后，放入網(wǎng)袋中，用名茶烘干機(jī)110-130℃鼓風(fēng)干燥至足干。

5.樣品粉碎與浸提處理：將烘干的茶葉樣品粉碎、過篩，得到茶葉碎末；準(zhǔn)確稱取茶葉碎末0.1g，分別置于10 ml離心管中，加入8 ml沸水，100℃沸水浴浸提25-35 min，每10 min搖晃混勻一次，超濾離心，將過濾液轉(zhuǎn)移到10 ml容量瓶，定容至10 ml；取5 ml溶液，用0.22μm水系濾膜過濾，得到茶葉樣品浸提液；

6.氨基酸組成測定：浸提液中各氨基酸組分含量測定采用高效液相色譜法的Waters AccQ·Tag 氨基酸分析包進(jìn)行，樣品氨基酸含量 = 100X茶葉樣品浸提液中對于氨基酸含量。圖2為不同氮素處理下，成熟葉片中的主要氨基酸的含量差異。圖2結(jié)果表明：在缺氮條件下，茶樹成熟葉片中的茶氨酸（Theanine，THEA）、精氨酸（Argine, Arg）、谷氨酸（Glutamate, Glu）、γ-氨基丁酸（γ－aminobutyric acid, GABA）、天冬氨酸（Asparate, Asp）都有較明顯下降，其中茶氨酸含量下降了72%；但是丙氨酸(Alanine, Ala)含量下降不明顯。

如圖3所示，在缺氮條件下（L）, 6個(gè)茶樹品種（系）成熟葉片中茶氨酸的含量下降及其顯著，下降幅度最小為品系LY20B，茶氨酸含量下降了61 %；下降幅度最大的品系為LY011，茶氨酸含量下降了89 %。

這個(gè)結(jié)果說明，成熟葉片中茶氨酸含量對氮素的敏感度很強(qiáng)，變化幅度大于葉色SPAD值；而成熟葉片中茶氨酸含量受茶樹遺傳背景影響較小，但是葉色受到茶樹不同品種（系）遺傳背景影響較大。因此，相較于葉色值，茶氨酸含量是更為敏感的茶樹氮素營養(yǎng)診斷指標(biāo)。

7.茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)計(jì)算與營養(yǎng)診斷：將茶樹成熟葉片中茶氨酸含量與正常氮素條件下成熟葉片中茶氨酸含量的比值定義為茶樹氮素營養(yǎng)指數(shù)。該指數(shù)數(shù)值越大表明茶樹氮素營養(yǎng)水平越高。茶樹氮素營養(yǎng)診斷，氮素營養(yǎng)指數(shù)≦0.70診斷為氮素缺乏，需要施用氮肥；0.70<氮素營養(yǎng)指數(shù)診斷為氮素營養(yǎng)充足。

表1為不同氮素處理下，6個(gè)茶樹品種（系）的氮素營養(yǎng)指數(shù)及營養(yǎng)診斷結(jié)果。氮素營養(yǎng)指數(shù)計(jì)算結(jié)果表面，在正常氮處理?xiàng)l件下，6個(gè)茶樹品種（系）的氮素營養(yǎng)指數(shù)值為0.83-1.18，診斷為氮素營養(yǎng)充足；在缺氮處理?xiàng)l件下，6個(gè)茶樹品種（系）的氮素營養(yǎng)指數(shù)值很低僅為0.11-0.45，診斷為氮素缺乏。如LY011在缺氮條件下的營養(yǎng)指數(shù)最小僅為0.11，氮素營養(yǎng)缺乏。

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