本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及化學(xué)領(lǐng)域化合物的分離提取方法，具體涉及植物天然藥理活性物質(zhì)原薯蕷皂苷的一種制備方法。

背景技術(shù)：

穿山龍是薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino的干燥根莖，性溫，味甘、苦，歸肝、腎、肺經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、舒筋通絡(luò)、活血止痛、止咳平喘之效。民間多用其泡酒或煎服，治療風(fēng)濕弊病、關(guān)節(jié)腫痛、跌打損傷和閃腰岔氣。現(xiàn)代研究表明穿山龍有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰等多種藥理作用，臨床用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、冠心病、高血壓、心肌硬塞、支氣管哮喘。穿山龍中主要有效成分為甾體皂苷，而甾體皂苷主要為薯蕷皂苷和原薯蕷皂苷。

原薯蕷皂苷(protodioscin)，分子式為C₅₁H₈₄O₂₂，結(jié)構(gòu)見圖1，屬于甾體皂苷，又名呋喃固醇皂苷，有很強的藥理作用，如增強性功能、降血脂作用、對癌細(xì)胞的毒殺作用和抗白血病作用。目前，尚未有一種適合產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)同時制備高純度原薯蕷皂苷的工藝路線披露。市場上原薯蕷皂苷的產(chǎn)量很低，得率較小，難以滿足科研或新藥研發(fā)需求，從而嚴(yán)重限制其深入研究。本發(fā)明利用大孔吸附樹脂柱層析、反相硅膠柱層析以及反相樹脂基柱層析技術(shù)，從穿山龍中制備原薯蕷皂苷，純度好，得率較高，為其開發(fā)利用提供良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種制備高純度原薯蕷皂苷的方法，本發(fā)明方法不僅操作工藝簡單，生產(chǎn)周期短，而且利用本發(fā)明可在一個工藝流程中制備得到純度達(dá)到90％以上的原薯蕷皂苷。

為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種制備原薯蕷皂苷的方法，包括依次以大孔吸附樹脂柱層析、反相硅膠柱層析、反相樹脂基柱層析的方法來分離穿山龍藥材提取液中的原薯蕷皂苷。

一種制備原薯蕷皂苷的方法，包括以下步驟：

1)將干燥的穿山龍藥材加入到提取溶劑中，對藥材進(jìn)行提取處理，得到穿山龍?zhí)崛∫?，將提取液濃縮、靜置、過濾，取濾液；

2)將濾液采用洗脫劑通過大孔吸附樹脂柱法進(jìn)行洗脫處理，收集、合并含有原薯蕷皂苷的洗脫液，得到樹脂柱洗脫液；

3)將樹脂柱洗脫液濃縮、靜置、過濾，得到濾液；

4)將濾液采用洗脫劑通過1-3次反相硅膠柱層析處理，收集、檢測、合并洗脫液；

5)將反相硅膠柱洗脫液濃縮，濃縮液采用反相樹脂基柱層析處理，收集、檢測、合并洗脫液，洗脫液干燥后，得到原薯蕷皂苷。

所述的步驟1)中的提取溶劑選取質(zhì)量百分比濃度為20％-90％的乙醇溶液，優(yōu)選為50％-75％含水乙醇溶液。不宜采用水、甲醇或者含水甲醇提取，文獻(xiàn)報道原薯蕷皂苷用甲醇回流提取時不穩(wěn)定，會發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)(參見Kostova I，Dinchev D，Rentsch G H，et al.Z.Naturforsch.57c，33-38(2002))。

所述的步驟1)中的提取處理是通過加熱回流來進(jìn)行提取處理，其中，提取溶劑的體積與藥材的重量之比為5-8∶1(即如果藥材的重量為1kg，則提取溶劑的體積為5-8L；如果藥材的重量為1g，則提取溶劑的體積為5-8mL)；提取次數(shù)為2-3次，優(yōu)選為2次；提取時間為2-3h/次；另外，步驟1)中所述的將提取液濃縮是將提取液濃縮至相對密度為1.0-1.2；所述的靜置是將濃縮提取液靜置過夜(濃縮提取液的相對密度范圍以及靜置時間有利于雜質(zhì)沉淀完全，便于后述分離制備)。

所述的步驟2)中的大孔吸附樹脂所采用D101、AB-8、DM130H、XAD-2、D201、HP-20、X-5、H103、DM11或ADS-17型樹脂中的一種，優(yōu)選為HP-20、AB-8、D101型大孔吸附樹脂；上樣比例選擇為：大孔吸附樹脂的體積與穿山龍藥材重量(干重)之比為0.5-1.5∶1，即當(dāng)穿山龍藥材重量為100kg，則大孔樹脂柱的柱體積為50-150L，優(yōu)選為0.7-1.0∶1；進(jìn)一步的，大孔樹脂柱分離處理過程中，大孔樹脂柱的柱直徑與柱高之比為1∶8-20。

所述的步驟2)中的洗脫劑選依次采用水和含水的乙醇溶液，首先采用水為沖洗液進(jìn)行沖洗，然后采用質(zhì)量百分比濃度為20％-50％的乙醇溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集、合并含有原薯蕷皂苷的樹脂柱洗脫液；其中，步驟2)中采用水為沖洗液進(jìn)行沖洗的過程中，水與大孔吸附樹脂的體積之比為2-6∶1，優(yōu)選為2-3.5∶1；采用所述乙醇溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫的過程中，乙醇溶液與大孔吸附樹脂的體積之比為4-6∶1。

步驟3)中所述將含有原薯蕷皂苷的洗脫液濃縮，將提取液濃縮至相對密度為1.0-1.2；所述的靜置，可將濃縮提取液靜置過夜(濃縮提取液的相對密度范圍以及靜置時間有利于雜質(zhì)沉淀完全，便于后述分離制備)。

所述的步驟4)中的反相硅膠柱層析采用C₁₈反相柱，所述的C₁₈反相柱可選用預(yù)裝柱或DAC制備柱；其中，步驟4)中所述反相硅膠柱分離，首先采用水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后采用質(zhì)量百分比濃度為10％-50％的乙腈溶液為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集、合并含有原薯蕷皂苷的洗脫液或者首先采用水為洗脫劑進(jìn)行洗脫，然后采用質(zhì)量百分比濃度為20％-60％的乙醇溶液為洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集、合并含有原薯蕷皂苷的洗脫液；其中，步驟4)中第二次反相硅膠柱層析處理過程中，選擇乙腈與水的混合溶劑為洗脫劑，所述的乙腈溶液的質(zhì)量百分比濃度為28％-40％，優(yōu)選28％-35％。

進(jìn)行反相柱分離時，采用多次含水乙醇作為洗脫溶劑或含水乙腈作為洗脫溶劑相結(jié)合，可進(jìn)一步提高原薯蕷皂苷的純度；例如，先使用含水乙醇作為洗脫劑，再使用含水乙腈作為洗脫劑，得到的原薯蕷皂苷純度可達(dá)到90％以上。如再進(jìn)一步采用反相柱層析，使用含水乙醇或者含水乙腈進(jìn)行洗脫，可以進(jìn)一步提高原薯蕷皂苷的純度。

進(jìn)一步的，步驟3)和步驟4)中所述的將含有原薯蕷皂苷的洗脫液濃縮，將提取液濃縮至相對密度為1.0-1.2。

反相樹脂基填料比傳統(tǒng)的C₁₈硅膠具有更高的化學(xué)穩(wěn)定性，可以在強酸、強堿介質(zhì)下使用，可以用多種有機溶劑作為洗脫劑，可以在較高的濃度下使用，壽命非常長；反相樹脂基填料吸附量高，顆粒均勻，機械強度好，不易破碎，殘留物少，與相同粒徑的C₁₈固定相的柱效相當(dāng)，無論對極性或非極性樣品，幾乎無不可逆吸附，非常適用于制備色譜分離純化微量物質(zhì)，而C₈和C₁₈柱由于硅醇基的存在，樣品不可逆吸附到柱子上，使回收率低。

本發(fā)明中，對反相硅膠柱層析分離得到的產(chǎn)品進(jìn)一步采用反相樹脂基柱層析，即在所述的步驟5)中的采用反相樹脂基柱層析，以進(jìn)一步提高原薯蕷皂苷的純度；所選擇反相樹脂基填料可以為SMB、MCI、GEL、PRP型反相樹脂基色譜柱中的一種，柱子規(guī)格選擇預(yù)裝柱或或DAC制備柱；其中，步驟5)中所述的反相樹脂基柱層析處理過程中選擇乙腈與水的混合溶劑為洗脫劑，其乙腈的溶液的質(zhì)量百分比濃度為15％-35％。

進(jìn)一步的，所述的穿山龍藥材為蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponica Makino的干燥根莖。

由于反相硅膠柱層析使用的反相硅膠粒徑對分離效果亦有較大影響，理論上，粒粒徑越小的反相硅膠，分離效果越好，但是柱壓會明顯升高，對設(shè)備的要求也相應(yīng)增加，且反相硅膠的成本也會顯著增加，故而本發(fā)明優(yōu)選反相硅膠粒徑為40-60μm的反相硅膠。

由于反相樹脂基柱層析使用的反相樹脂基粒徑對分離效果亦有較大影響，理論上，粒徑越小的樹脂基填料，分離效果越好，但是柱壓會明顯升高，對設(shè)備的要求也相應(yīng)增加，且填料成本也會顯著增加，故而本發(fā)明優(yōu)選粒徑為50-70μm的反相樹脂基填料。

其中原薯蕷皂苷純度檢測如下：樣品經(jīng)高效液相色譜儀在色譜條件為：流動相為乙腈-水(26∶74)，波長203nm，色譜柱為Kromasir C₁₈色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流速為1.0mL·min^-1，柱溫為35℃下檢測，樣品在HPLC色譜中為單一對稱峰，由面積歸一化法測定，純度大于98％，色譜圖見圖2。

原薯蕷皂苷結(jié)構(gòu)確定的方法如下：使用核磁共振波普儀，對樣品進(jìn)行分析，其中13C-NMR(400MHz，Pyridine-d5)δ：37.5(C-1)，30.2(C-2)，78.2(C-3)，39.0(C-4)，140.9(C-5)，121.8(C-6)，32.4(C-7)，31.7(C-8)，50.4(C-9)，37.1(C-10)，21.1(C-11)，40.0(C-12)，40.8(C-13)，56.6(C-14)，32.5(C-15)，81.1(C-16)，63.8(C-17)，16.5(C-18)，19.4(C-19)，40.7(C-20)，16.3(C-21)，110.7(C-22)，37.1(C-23)，28.3(C-24)，34.3(C-25)，75.2(C-26)，17.4(C-27)；C-3糖分：100.3(GlcC-1′)，77.9(GlcC-2′(inner))，78.2(GlcC-3′)，79.0(Glc C-4′)，76.8(GlcC-5′)61.4(GlcC-6′)；102.0(RhaC-1″)，72.4(RhaC-2″(1→2))，72.8(Rha C-3″)，74.1(RhaC-4″)，69.4(RhaC-5″)，18.4(RhaC-6″)，102.9(Rha C-1″′)，72.4(Rha C-2″′(1→2))，72.7(Rha C-3″′)，73.9(Rha C-4″′)，70.5(Rha C-5″′)，18.6(Rha C-6″′)；C-26糖部分：104.9(Rha C-1″′)，75.2(Rha C-2″′)，78.3(RhaC-3″′)，71.8(RhaC-4″′)，78.6(RhaC-5″′)，62.9(RhaC-6″′)，¹³C-NMR和¹³H-NMR與原薯蕷皂苷的文獻(xiàn)報道核磁數(shù)據(jù)一致，鑒定為原薯蕷皂苷(protodioscin)。

有益效果：本發(fā)明的優(yōu)點包含以下幾點：

1)應(yīng)用本發(fā)明方法，可制備得到高純度的原薯蕷皂苷，原薯蕷皂苷含量達(dá)到90-99.9％；

2)應(yīng)用本發(fā)明方法，可得到公斤級的原薯蕷皂苷；

3)本發(fā)明制備工藝方法簡單，精制效率高，耗能低，環(huán)保，操作工藝條件容易控制，質(zhì)量可控性強；

4)本發(fā)明綜合反相硅膠柱層析和反相樹脂基柱層析的分離技術(shù)，得率高，除雜質(zhì)和色素效果好；

5)本發(fā)明所述的高純度原薯蕷皂苷，無溶劑殘留，安全性高，可以單獨作為制備藥品和保健品的原料，也可與相關(guān)藥理活性成分相須使用，以達(dá)協(xié)同增效之功。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的原薯蕷皂苷結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本發(fā)明的原薯蕷皂苷樣品純度檢測色譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明：

具體實施例一：

準(zhǔn)備干燥的穿山龍藥材150kg，粉碎成粗粉后，裝入不銹鋼中藥提取罐中，用質(zhì)量百分比濃度為70％乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次8倍量，每次2h；其次，合并提取液，過濾，濾液減壓濃縮至相對密度為1.08(40℃)，放冷，靜置過夜后，過濾，濾液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱層析，大孔吸附樹脂柱內(nèi)大孔吸附樹脂的柱體積為200L(柱直徑0.4m，柱高1.6m)，其中柱體積是指大孔吸附樹脂裝柱后，從柱的底板到樹脂沉積表面的體積；樹脂柱內(nèi)樹脂的體積與藥材重量(干重)之比為4∶3，待濾液完全流入樹脂柱后，先用2.5倍柱體積的水洗滌至流出液清澈透明后，再用3倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為20％的乙醇溶液洗脫洗滌至流出液清澈透明后，然后接著用5倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為20％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫流速為150L/h，每50L洗脫液收集為一流分，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，得到大孔樹脂柱洗脫液。將大孔樹脂柱洗脫液減壓濃縮至相對密度為1.13(40℃)，放冷，靜置過夜，取上清液；然后將上清液經(jīng)C₁₈柱(直徑500mm，高度800mm，50-70μm)柱層析，分別用水洗脫、25％乙腈洗脫、34％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，濃縮；再進(jìn)行第二次C₁₈柱(100mm×250mm，50μm)柱層析，分別用25％乙腈和34％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，濃縮；然后利用反相樹脂基柱(200mm×250mm，50μm)分離，依次用25％乙腈和30％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并目標(biāo)流分，減壓回收溶劑至干，冷凍干燥，得原薯蕷皂苷0.72公斤(純度95.2％)。

具體實施例二：

準(zhǔn)備干燥的穿山龍藥材90kg，粉碎成粗粉后，裝入不銹鋼中藥提取罐中，用質(zhì)量百分比濃度為50％乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次8倍量，每次2h。合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.01(40℃)，放冷，靜置過夜后，過濾，濾液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱層析，大孔吸附樹脂柱內(nèi)大孔吸附樹脂的柱體積為120L，其中柱體積是指大孔吸附樹脂裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積。待濾液完全流入樹脂柱后，先用2.5倍柱體積的水洗滌至流出液清澈透明后，再用3倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為20％的乙醇溶液洗脫洗滌至流出液清澈透明后，然后接著用5倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為30％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫流速為90L/h，每50L洗脫液收集為一流分，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，減壓濃縮至相對密度為1.07(40℃)，放冷，靜置過夜，取上清液；然后將上清液經(jīng)C₁₈柱(200mm×250mm，50-70μm)柱層析，分別用水洗脫、25％乙腈洗脫、34％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并，合并含原薯蕷皂苷的流份，減壓濃縮至相對密度為1.11(40℃)，放冷，然后利用反相樹脂基柱(200mm×250mm，70μm)分離，依次用20％乙腈和30％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并目標(biāo)流分，減壓回收溶劑至干，冷凍干燥，得原薯蕷皂苷0.4公斤(純度91.2％)。

具體實施例三：

準(zhǔn)備干燥的穿山龍藥材120kg，粉碎成粗粉后，裝入不銹鋼中藥提取罐中，用質(zhì)量百分比濃度為70％乙醇溶液，加熱回流提取3次，每次8倍量，每次2h。合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮至相對密度為1.05(40℃)，放冷，靜置過夜后，過濾，濾液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂柱層析，大孔吸附樹脂柱內(nèi)大孔吸附樹脂的柱體積為160L，其中柱體積是指大孔吸附樹脂裝柱后，從柱的底板到凝膠沉積表面的體積；待濾液完全流入樹脂柱后，先用2.5倍柱體積的水洗滌至流出液清澈透明后，再用3倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為20％的乙醇溶液洗脫洗滌至流出液清澈透明后，然后接著用5倍柱體積的質(zhì)量百分比濃度為20％的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，洗脫流速為120L/h，每50L洗脫液收集為一流分，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，減壓濃縮至相對密度為1.07(40℃)，放冷，靜置過夜，取上清液；然后將上清液經(jīng)C₁₈柱(500mm×800mm，50-70μm)柱層析，分別用水洗脫、35％乙醇洗脫、55％乙醇洗脫，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，濃縮，進(jìn)行第二次C₁₈柱(500mm×800mm，50-70μm)柱層析，分別用25％乙腈和32％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，減壓濃縮至相對密度為1.14(40℃)，放冷，然后利用反相樹脂基柱(200mm×250mm，70μm)分離，依次用20％乙腈和30％乙腈洗脫，液相跟蹤檢測，合并目標(biāo)流分，減壓回收溶劑至干，冷凍干燥，得原薯蕷皂苷0.55公斤(純度96.8％)。

具體實施例四：

首先先通過具體實施例一的步驟得到原薯蕷皂苷0.5公斤，然后用20％乙醇溶解，然后經(jīng)C₁₈柱(500mm×800mm，50-70μm)柱層析，依次用450L 20％乙醇洗脫、450L 40％乙醇洗脫，750L 50％乙醇洗脫，液相跟蹤檢測，合并含原薯蕷皂苷的流份，減壓回收溶劑至干，冷凍干燥，得原薯蕷皂苷0.43公斤(純度98.7％)。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明的技術(shù)范圍作出任何限制，故凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。