本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物及其制備方法，以及這一類衍生物在抗病毒方面的藥理作用。

背景技術(shù)：

連翹脂素，為連翹苷的糖配基部分，又稱作連翹苷元，為木犀科連翹屬植物連翹的主要活性成分，其結(jié)構(gòu)如下式所示，現(xiàn)代藥理研究表明，連翹脂素有抗病毒、抗氧化、降低血脂、清除自由基、抑菌、抗腫瘤、抗炎等作用。

連翹脂素分子不穩(wěn)定，易被氧化，且在酸性環(huán)境下分子構(gòu)型容易發(fā)生改變。通過大鼠腸內(nèi)菌模擬連翹苷的代謝研究發(fā)現(xiàn)，極易被腸道內(nèi)菌群代謝為新的代謝物。通過含酚類結(jié)構(gòu)藥物代謝研究發(fā)現(xiàn)，含酚羥基結(jié)構(gòu)的藥物易被體內(nèi)葡萄糖醛酸酶代謝為酚的葡萄糖醛酸衍生物，大部分葡萄糖醛酸衍生物具有良好的活性。例如青蒿素葡萄糖醛酸衍生物(Efficient Preparations of the β-Glucuronides of Dihydroartemisinin and Structural Confirmation of the Human Glucuronide Metabolite.Paul M.O'Neill,Feodor Scheinmann,Andrew V.Stachulski,James L.Maggs,and B.Kevin Park.J.Med.Chem.,2001,44(9),pp 1467–1470)、依達(dá)拉奉葡萄糖醛酸衍生物(Synthesis of the metabolites of a free radical scavenger edaravone(MCI-186,Radicut^TM).Kazutoshi Watanabe,Masao Taniguchi,Masaki Shinoda.Redox Report,Vol.8,No.3,2003，157-161)、風(fēng)車子素A-1葡萄糖醛酸衍生物(Regio-and Stereospecific Synthesis of Mono-β-d-Glucuronic Acid Derivatives of Combretastatin A-1.Rajendra P.Tanpure,Tracy E.Strecker,David J.Chaplin，Bronwyn G.Siim,Mary Lynn Trawick and Kevin G.Pinney.J.Nat.Prod.,2010,73(6),pp 1093–1101)、白藜蘆醇葡萄糖醛酸衍生物(WANG LAIXI；Heredia,A.；Song,HJ；ZHANG ZHAOJUN；YU BIAO；Davis,C.；Redfield,R.Resveratrol glucuronides as the metabolites of resveratrol in humans:Characterization,synthesis,and anti-HIV activity.J.Pharm.Sci.2004,93(10),2448-2457)和姜黃素葡萄糖醛酸衍生物(K.S.Psrvathy,M.Sc.University of Mysore.2009)等等。因此我們設(shè)計(jì)出連翹脂素的葡萄糖醛酸衍生物，并進(jìn)行了化學(xué)合成及藥理研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的要解決的技術(shù)問題是采用化學(xué)合成方法制備連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物。本發(fā)明提供的連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物。另外，本發(fā)明還提供了制備連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的方法，適合工業(yè)化放大生產(chǎn)。

首先，本發(fā)明提供了如式(Ⅰ)所示的連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物，

其中，R基團(tuán)選擇H、Me、Na+、K+。

本發(fā)明另一方面提供一種連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的制備方法，包括如下順序進(jìn)行的步驟：

1)連翹脂素與有機(jī)堿進(jìn)行羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物；

2)將糖基供體、催化劑加入到有機(jī)溶劑中，混勻制得糖苷化試劑，然后加入連翹脂素-有機(jī)堿配合物，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)，制得糖苷化反應(yīng)混合物；

3)將糖苷化反應(yīng)混合物加入到甲醇中，接著加入堿性化合物，進(jìn)行脫酰基反應(yīng)，然后加入pH調(diào)節(jié)劑，調(diào)節(jié)混合物溶液pH至4-8.5即得。

其中，步驟1)中所述羥基活化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為0-20℃，優(yōu)選為0-10℃；反應(yīng)時(shí)間為10-20min。

特別是，步驟1)中將連翹脂素與有機(jī)堿溶于有機(jī)溶劑，在攪拌狀態(tài)下進(jìn)行所述的羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物。

尤其是，所述有機(jī)溶劑選擇二氯甲烷、甲苯或吡啶中的一種，優(yōu)選為二氯甲烷。

特別是，所述有機(jī)溶劑選擇無水二氯甲烷、無水甲苯或無水吡啶中的一種，優(yōu)選為無水二氯甲烷。

尤其是，所述連翹脂素質(zhì)量與有機(jī)溶劑的體積之比(g/ml)為1：40-50，優(yōu)選為1：45。

其中，所述有機(jī)堿選擇N,N-二異丙基乙基胺或1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯。

特別是，所述連翹脂素與有機(jī)堿的摩爾配比為1：5-8，優(yōu)選為1：6。

其中，步驟2)中所述糖苷化反應(yīng)的溫度>0℃，優(yōu)選為0-20℃，優(yōu)選為5-15℃，進(jìn)一步優(yōu)選為10℃；反應(yīng)時(shí)間為4-15h，優(yōu)選為8-10h，進(jìn)一步優(yōu)選為10h。

特別是，在惰性氣體氣氛下進(jìn)行所述的糖苷化反應(yīng)。

尤其是，所述惰性氣體選擇氮?dú)?、氬氣或氦氣，?yōu)選為氮?dú)狻?/p>

其中，所述糖基供體和連翹脂素的摩爾比為1-7：1，優(yōu)選為1.5～7：1，進(jìn)一步優(yōu)選為1.5：1。

特別是，步驟2)中所述糖基供體選擇2,3,4,-三-O-?；?α-D-吡喃葡萄糖醛酸酯，優(yōu)選為2,3,4-三-O-苯甲?；?α-D-溴代吡喃葡萄醛酸甲酯或2,3,4-三-O-乙?；?α-D-溴代吡喃葡萄醛酸甲酯；所述有機(jī)溶劑選擇二氯甲烷、三氯甲烷，1，2-二氯乙烷或甲苯，優(yōu)選為二氯甲烷。

本發(fā)明進(jìn)行糖苷化反應(yīng)過程中，糖基供體2,3,4,-三-O-酰基-α-D-吡喃葡萄糖醛酸酯的用量少，糖苷化產(chǎn)物的得率低，而用量增加則導(dǎo)致副產(chǎn)物增多，糖基供體2,3,4,-三-O-?；?α-D-吡喃葡萄糖醛酸酯和連翹脂素的摩爾比優(yōu)選為1.5～2.5：1。

其中，步驟2)中所述催化劑選擇碳酸銀。

特別是，所述催化劑與所述糖基供體的摩爾比為4-8：1，優(yōu)選為4-6：1，進(jìn)一步優(yōu)選為6：1。

催化劑的用量低導(dǎo)致糖基供體2,3,4,-三-O-?；?α-D-吡喃葡萄糖醛酸酯的分解，降低產(chǎn)率；催化劑用量高，導(dǎo)致三酰基連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯(即糖苷化反應(yīng)產(chǎn)物)的分解，降低產(chǎn)率。

特別是，在-20～0℃以下，并且在惰性氣體保護(hù)下將糖基供體、催化劑加入到有機(jī)溶劑中，混均勻，制得所述的糖苷化試劑。

尤其是，在溫度為-10～0℃，并且在惰性氣體保護(hù)下將糖基供體、催化劑加入到有機(jī)溶劑中，混均勻，制得所述的糖苷化試劑；溫度優(yōu)選為0℃。

特別是，在-20～0℃以下，并且在惰性氣體保護(hù)下將連翹脂素-有機(jī)堿配合物加入到所述的糖苷化試劑中，然后再進(jìn)行所述的糖苷化反應(yīng)。

尤其是，在溫度為-10～0℃，并且在惰性氣體保護(hù)性將連翹脂素-有機(jī)堿配合物加入到所述的糖苷化試劑中，然后再進(jìn)行糖苷化反應(yīng)；溫度優(yōu)選為0℃。

本發(fā)明在較低溫度和惰性氣體保護(hù)的條件下配制糖苷化試劑以及將連翹脂素-有機(jī)堿配合物加入到糖苷化試劑中，防止催化劑失活，低溫保證反應(yīng)按照SN2途徑進(jìn)行反應(yīng)，保證了催化劑的反應(yīng)選擇性，提高了反應(yīng)的選擇性。

特別是，所述惰性氣體選擇氮?dú)?、氬氣或氦氣，?yōu)選為氮?dú)狻?/p>

其中，步驟3)中所述脫酰基化反應(yīng)的反應(yīng)溫度0-10℃，優(yōu)選為0-5℃，進(jìn)一步優(yōu)選為0℃。

特別是，步驟3)中所述所述堿性化合物選擇氫氧化鈉、氫氧化鉀或甲醇鈉；所述pH調(diào)節(jié)劑選擇醋酸、丙酸或鹽酸，優(yōu)選為醋酸。

其中，堿性化合物與步驟2)中所述糖基供體的摩爾比為3-5：1，優(yōu)選為3.5：1。

特別是，將堿性化合物溶于水中，制備成堿性化合物溶液后，再加入，進(jìn)行所述的脫羧基反應(yīng)。

尤其是，制備的堿性化合物溶液的質(zhì)量百分比濃度為27-30％。

特別是，調(diào)節(jié)混合物溶液的pH值為5-8，優(yōu)選為pH值為7。

特別是，還包括步驟4)在調(diào)節(jié)混合物溶液pH值后，對混合物進(jìn)行分離、純化處理。

特別是，還包括步驟4)分離、純化處理，對pH調(diào)節(jié)至中心的混合物溶液進(jìn)行濃縮處理和硅膠柱層析處理。

其中，所述的分離、純化處理是對混合物進(jìn)行硅膠柱層析。

特別是，所述硅膠柱層析過程中選用GF254硅膠；洗脫劑選擇氯仿/甲醇＝9：1。

通過上述方法制備得到的本發(fā)明化合物為連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的的結(jié)構(gòu)式如下：

連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物在常溫下為白色固體，溶于氯仿、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇10：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

本發(fā)明再一方面提供一種連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的抗病毒應(yīng)用。

其中，所述抗病毒為流感病毒、抗副流感病毒、抗呼吸道合胞病毒(RSV)、抗柯薩奇病毒B3(CVB3)、抗柯薩奇病毒A16(CoxA16)、抗腸道病毒EV71、抗腺病毒(AdV)、抗單純皰疹病毒I型(HSV-1)。

本發(fā)明又一方面提供連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物在制備抗病毒藥物或保健品中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括本發(fā)明連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物，以及藥學(xué)上可接受的輔料。

在本文中，藥學(xué)上可接受的輔料指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、載體、pH調(diào)節(jié)劑、離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑、緩釋或控釋劑、包裹材料或其他制劑輔料。所用載體可與相應(yīng)的給藥形式相適應(yīng)，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的輔料配成注射劑、(注射用)凍干粉、噴霧劑、口服溶液、口服混懸液、片劑、膠囊、腸溶片、丸劑、粉劑、顆粒劑、持續(xù)釋放或延遲釋釋放等制劑。優(yōu)選本發(fā)明第一方面的連翹脂素硫酸酯衍生物通過注射或經(jīng)消化道方式給藥，因此，本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選為注射劑或經(jīng)消化道給藥的制劑，即適于配制成注射和經(jīng)消化道方式給藥的輔料特別優(yōu)選的。其中，―經(jīng)消化道給藥‖在本文中指藥物制劑通過患者消化道的給藥方式，包括口服、灌胃給藥和灌腸給藥等， 優(yōu)選是口服，如可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知曉的輔料配成口服溶液、口服混懸液、片劑、膠囊、腸溶片、丸劑、粉劑、顆粒劑、持續(xù)釋放或延遲釋釋放等制劑；其中，注射給藥的制劑主要是針劑和粉針劑。

本發(fā)明的連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的化學(xué)合成反應(yīng)式如下：

其中，結(jié)構(gòu)式A為連翹脂素；結(jié)構(gòu)B為2,3,4,-三-O-?；?α-D-溴代吡喃葡萄糖醛酸酯；結(jié)構(gòu)C為三?；B翹脂素葡萄糖醛酸甲酯；結(jié)構(gòu)D為連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物。

本發(fā)明所述的化學(xué)合成連翹脂素葡萄糖醛酸方法的先進(jìn)性和實(shí)用價(jià)值在于，原料來源方便，糖苷化反應(yīng)的催化劑廉價(jià)易得，使制備成本明顯下降，并且化學(xué)合成產(chǎn)品連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物的質(zhì)量易于控制，產(chǎn)品的綜合得率高，適宜工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯的核磁共振氫譜；

圖2本發(fā)明連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯的核磁共振碳譜；

圖3本發(fā)明連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯的高分辨質(zhì)譜；

圖4為流感病毒肺炎模型小鼠肺組織病理切片，其中：A為正常小鼠肺組織；B為流感病毒肺炎小鼠肺組織；C為流感病毒肺炎小鼠模型經(jīng)陽性藥物利巴韋林的治療后的小鼠的肺組織；D為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯高劑量組治療流感病毒肺炎后的小鼠肺組織；E為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯中劑量組治療流感病毒肺炎后的小鼠肺組織；F為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯低劑量組治療流感病毒肺炎后的小鼠肺組織；

圖5為副流感病毒肺炎模型小鼠肺組織病理切片，其中：A為正常小鼠肺組織；B為副流感病毒肺炎小鼠肺組織；C為副流感病毒肺炎小鼠模型經(jīng)陽性藥物利巴韋林的治療后的小鼠的肺組織；D為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯高劑量組治療副流感病毒肺炎后的小鼠肺組織；E為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯中劑量組治療副流感病毒肺炎后的小鼠肺組織；F為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯低劑量組治療副流感病毒肺炎后的小鼠肺組織。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但這些實(shí)施例僅是說明本發(fā)明，而不應(yīng)理解為對本發(fā)明范圍的任何限制。另外，實(shí)施例中的試劑、原料都可以通過商業(yè)渠道獲得，如有未盡之處，可以參考有機(jī)合成指南、藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)的指引以及相應(yīng)儀器、試劑的廠商說明書等。

實(shí)施例1

1、制備連翹脂素-有機(jī)堿配合物

在溫度為10℃的條件下將連翹脂素(4g，10.75mmol)加入到干燥的無水二氯甲烷(180ml)中，攪拌溶解后加入有機(jī)堿N,N-二異丙基乙基胺11.26mL(64.5mmoL)，攪拌10分鐘，進(jìn)行羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液備用，連翹脂素與有機(jī)堿的摩爾之比為1：6；

本發(fā)明進(jìn)行所述羥基活化反應(yīng)的過程中控制反應(yīng)溫度在0-20℃的條件下，均適用于本發(fā)明，本發(fā)明實(shí)施例以10℃為例進(jìn)行說明。本發(fā)明中連翹脂素與有機(jī)堿的摩爾之比除了1：6之外，其他1：5-8的摩爾比均適用于本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施例以1：6為例進(jìn)行說明。

所述羥基活化反應(yīng)是利用堿活化羥基，使糖苷化反應(yīng)更容易進(jìn)行。

2、糖苷化反應(yīng)

2-1)在-10℃以及氮?dú)鈿夥障?，?、3、4-三-O-乙酰基α-D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯6.4g(16.125mmoL)和碳酸銀17.78g(64.5mmoL)溶于二氯甲烷中，攪拌均勻，制得糖苷化試劑，其中糖基供體與連翹脂素的摩爾之比為1.5：1，催化劑碳酸銀與糖基供體的摩爾之比為4：1；

2-2)在-10℃以及氮?dú)鈿夥障?，邊攪拌邊將連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液加入到糖苷化試劑中，然后加熱升溫至10℃，并在溫度保持為10℃的條件下，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)10h，制得糖苷化反應(yīng)混合物；

有機(jī)堿奪去反應(yīng)底物連翹脂素的羥基的氫后，生成的活性中間體配合物遇到氧氣會被氧化，通過惰性氣體保護(hù)使中間體失去與氧接觸的機(jī)會，保證反應(yīng)正常進(jìn)行。惰性氣體除了氮?dú)庵?，氦氣、氬氣均適用于本發(fā)明。

3、脫?；磻?yīng)

在攪拌狀態(tài)下，將糖苷化反應(yīng)混合物溶于甲醇中，然后在0℃的條件下邊攪拌邊加入質(zhì)量百分 比濃度為27％的氫氧化鈉溶液(8.36ml)，NaOH與2、3、4-三-O-乙酰基α-D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的摩爾比為3.5：1，進(jìn)行脫?；磻?yīng)30min之后，加入酸性pH調(diào)節(jié)劑醋酸，調(diào)節(jié)脫?；磻?yīng)的混合物的pH值至7；

本發(fā)明中進(jìn)行脫?；磻?yīng)的過程中加入作為溶劑的甲醇，將糖苷化反應(yīng)混合物溶解；加入的堿(如氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇鈉)的堿性既不會破壞糖苷鍵又可以用作脫?；磻?yīng)的堿，脫除?；Ｗo(hù)基，促進(jìn)糖苷化反應(yīng)的進(jìn)行。脫?；磻?yīng)時(shí)間至少30min，優(yōu)選為30-45min。

本發(fā)明中向脫酰基反應(yīng)后的混合物中加入醋酸調(diào)節(jié)混合物的pH，中和過量的堿，終止反應(yīng)，同時(shí)醋酸活性適中，不會破壞生成的糖苷鍵，提高產(chǎn)物的得率。

4、分離、純化處理

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空狀態(tài)下進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮，蒸發(fā)去除溶劑，獲得脫?；磻?yīng)混合物固體；將脫酰基反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行硅膠柱層析分離、純化處理，其中，洗脫劑：氯仿/甲醇＝9：1；柱層析硅膠：GF254硅膠；得白色固體(化合物1、4.89g)，總產(chǎn)率79.8％。

化合物1溶于水、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇3：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

化合物1的¹H-NMR、¹³C-NMR、高分辨質(zhì)譜、紅外光譜圖如圖1-4所示。

ESI-MS譜中，m/z[M-Na]^-為547.18210，分子量為570.52277。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(11H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):169.75(C-34)，149.51(C-19)，148.95(C-14)，148.09(C-13)，145.74(C-18)，136.26(C-10)，131.67(C-9)，118.55(C-16)，118.05(C-17)，115.72(C-11)，112.03(C-12)，111.07(C-20)，109.92(C-15)，100.21(C-28)，87.11(C-4)，81.74(C-6)，76.26(C-32)，75.70(C-30)，73.41(C-31)，71.91(C-29)，70.81(C-1)，69.46(C-8)，56.15，55.99，55.94(C-25、C-26、C-27)，54.47(C-3)，49.79(C-2)。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物1為連翹脂素葡萄糖醛酸鈉，分子式為：C₂₇H₃₁O₁₂Na，英文名：sodium(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate；中文名：(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-二甲氧基苯基)六氫駢[3,4-c]呋喃-1-基)-2-甲氧基苯 基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸鈉；結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例2

除了步驟1中加入有機(jī)堿1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯(9.63mL，64.5mmol)；步驟2中的糖基供體為2、3、4-三-O-苯甲酰基α-D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的質(zhì)量為43.89g(75.25mmoL)，糖基供體與連翹脂素的摩爾之比為7：1；催化劑碳酸銀(124.5g，0.4515mol)，催化劑與糖基供體的摩爾之比為6：1之外，其余與實(shí)施例1相同，制得白色固體(化合物2、3g)，總產(chǎn)率79.8％。

化合物2為白色固體，溶于水、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇3：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

化合物2的ESI-MS譜中，m/z[M-Na]^-為547.18210，分子量為570.52277。

化合物2的¹H-NMR、¹³C-NMR、IR與實(shí)施例1制得的化合物1相同。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR、IR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物2為連翹脂素葡萄糖醛酸鈉。

實(shí)施例3

1、制備連翹脂素-有機(jī)堿配合物

在溫度為0℃的條件下將連翹脂素(4g，10.75mmol)加入到干燥的無水二氯甲烷(180ml)中，攪拌溶解后加入有機(jī)堿1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯9.63mL(64.5mmol)，攪拌20分鐘，進(jìn)行羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液備用；

2、糖苷化反應(yīng)

2-1)在0℃以及氮?dú)鈿夥障拢瑢?、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯6.4g(16.125mmoL)和碳酸銀17.78g(64.5mmoL)溶于二氯甲烷中，攪拌均勻，制得糖苷化試劑；

2-2)在0℃以及氮?dú)鈿夥障?，邊攪拌邊將連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液加入到糖苷化試劑中，然后加熱升溫至20℃，并在溫度保持為20℃的條件下，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)10h，制得糖苷化反應(yīng)混合物；

3、脫?；磻?yīng)

在攪拌狀態(tài)下，將糖苷化反應(yīng)混合物溶于甲醇中，然后在5℃的條件下邊攪拌邊加入28％的氫氧化鉀溶液(11.28ml)，KOH與2、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的摩爾比為3.5： 1，攪拌，進(jìn)行脫?；磻?yīng)30min之后，加入酸性pH調(diào)節(jié)劑醋酸，調(diào)節(jié)脫?；磻?yīng)的混合物的pH值至7；

4、分離、純化處理

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空狀態(tài)下進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮，蒸發(fā)去除溶劑，獲得脫酰基反應(yīng)混合物固體；將脫酰基反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行硅膠在柱層析分離、純化處理，其中，洗脫劑：氯仿/甲醇＝9：1；柱層析硅膠：GF254硅膠；得白色固體(化合物3、4.96g)，總產(chǎn)率81％。

化合物3溶于水、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇3：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

ESI-MS譜中，m/z[M-K]^-為547.18213，分子量為586.63185。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(11H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):169.75(C-34)，149.51(C-19)，148.95(C-14)，148.09(C-13)，145.74(C-18)，136.26(C-10)，131.67(C-9)，118.55(C-16)，118.05(C-17)，115.72(C-11)，112.03(C-12)，111.07(C-20)，109.92(C-15)，100.21(C-28)，87.11(C-4)，81.74(C-6)，76.26(C-32)，75.70(C-30)，73.41(C-31)，71.91(C-29)，70.81(C-1)，69.46(C-8)，56.15，55.99，55.94(C-25、C-26、C-27)，54.47(C-3)，49.79(C-2)。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物3為連翹脂素葡萄糖醛酸鉀，中文名：(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-二甲氧基苯基)六氫駢[3,4-c]呋喃-1-基)-2-甲氧基苯基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸鉀；英文名：potassium(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylate；分子式為：C₂₇H₃₁O₁₂K；結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例4

除了步驟1中加入有機(jī)堿N,N-二異丙基乙基胺(11.26mL，64.5mmoL)，攪拌時(shí)間為10min；步驟2中的糖基供體為2、3、4-三-O-苯甲?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的質(zhì)量為43.89g(75.25mmoL)，糖基供體與連翹脂素的摩爾之比為7：1；催化劑碳酸銀(124.5g，0.4515mol)，催化劑與糖基供體的摩爾之比為6：1，糖苷化反應(yīng)溫度為5℃，反應(yīng)時(shí)間為9h；步驟3中調(diào)節(jié)pH至8之外，其余與實(shí)施例3相同，制得白色固體(化合物4、5.14g)，總產(chǎn)率84％。

化合物4溶于水、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇3：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

化合物4的ESI-MS譜中，m/z[M-K]^-為547.18213，分子量為586.63185。

化合物4的¹H-NMR、¹³C-NMR與實(shí)施例3制得的化合物3相同。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物4為連翹脂素葡萄糖醛酸鉀。

實(shí)施例5

1、制備連翹脂素-有機(jī)堿配合物

在溫度為20℃的條件下將連翹脂素(4g，10.75mmo)加入到干燥的無水二氯甲烷(180ml)中，攪拌溶解后加入有機(jī)堿N,N-二異丙基乙基胺11.26mL(64.5mmoL)，攪拌10分鐘，進(jìn)行羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液，備用；

2、糖苷化反應(yīng)

2-1)在-10℃以及氮?dú)鈿夥障拢瑢?、3、4-三-O-乙酰基α-D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯6.4g(16.125mmoL)和碳酸銀17.78g(64.5mmoL)溶于二氯甲烷中，攪拌均勻，制得糖苷化試劑，其中糖基供體與連翹脂素的摩爾之比為1.5：1，催化劑碳酸銀與糖基供體的摩爾之比為4：1；

糖基供體除了2、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯之外，還可以使用2、3、4-三-O-苯甲?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯。

2-2)在-10℃以及氮?dú)鈿夥障?，邊攪拌邊將連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液滴加入到糖苷化試劑中，然后加熱升溫至0℃，并在溫度保持為0℃的條件下，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)10h，制得糖苷化反應(yīng)混合物；

3、脫?；磻?yīng)

在攪拌狀態(tài)下，將糖苷化反應(yīng)混合物溶于甲醇中，然后在0℃的條件下邊攪拌邊加入質(zhì)量百分比濃度為27％的氫氧化鉀溶液(11.7ml)，KOH與2、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的摩爾比為3.5：1，攪拌，進(jìn)行脫?；磻?yīng)30min之后，加入酸性pH調(diào)節(jié)劑醋酸，調(diào)節(jié)脫酰基反應(yīng)的混合物的pH值至5；

4、分離、純化處理

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空狀態(tài)下進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮，蒸發(fā)去除溶劑，獲得脫?；磻?yīng)混合物固體；將脫?；磻?yīng)混合物樣品進(jìn)行硅膠在柱層析分離、純化處理，其中，洗脫劑：氯仿/甲醇＝9：1；柱層析硅膠：GF254硅膠；得白色固體(化合物5、5.08g)，總產(chǎn)率83％。

化合物5溶于水、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇3：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

ESI-MS譜中，m/z[M+Na]⁺為571.17916，分子量為548.54109。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(11H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):169.75(C-34)，149.51(C-19)，148.95(C-14)，148.09(C-13)，145.74(C-18)，136.26(C-10)，131.67(C-9)，118.55(C-16)，118.05(C-17)，115.72(C-11)，112.03(C-12)，111.07(C-20)，109.92(C-15)，100.21(C-28)，87.11(C-4)，81.74(C-6)，76.26(C-32)，75.70(C-30)，73.41(C-31)，71.91(C-29)，70.81(C-1)，69.46(C-8)，56.15，55.99，55.94(C-25、C-26、C-27)，54.47(C-3)，49.79(C-2)。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物5為連翹脂素葡萄糖醛酸，中文名：(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-二甲氧基苯基)六氫駢[3,4-c]呋喃-1-基)-2-甲氧基苯基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸；英文名：(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetrahydro-2H-pyran-2-carboxylic acid；分子式為：C₂₇H₃₂O₁₂；結(jié)構(gòu)式為：

實(shí)施例6

1、制備連翹脂素-有機(jī)堿配合物

在溫度為10℃的條件下將連翹脂素(4g，10.75mmo)加入到干燥的無水二氯甲烷(180ml)中， 攪拌溶解后加入有機(jī)堿1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯9.63mL(64.5mmo)，攪拌10分鐘，進(jìn)行羥基活化反應(yīng)，制得連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液，備用；

2、糖苷化反應(yīng)

2-1)在0℃以及氮?dú)鈿夥障?，?、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯6.4g(16.125mmoL)和碳酸銀17.78g(64.5mmoL)溶于二氯甲烷中，攪拌均勻，制得糖苷化試劑，其中糖基供體與連翹脂素的摩爾之比為1.5：1，催化劑碳酸銀與糖基供體的摩爾之比為4：1；

糖基供體除了2、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯之外，還可以使用2、3、4-三-O-苯甲?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯。

2-2)在0℃以及氮?dú)鈿夥障?，邊攪拌邊將連翹脂素-有機(jī)堿配合物溶液滴加入到糖苷化試劑中，然后加熱升溫至10℃，并在溫度保持為10℃的條件下，進(jìn)行糖苷化反應(yīng)10h，制得糖苷化反應(yīng)混合物；

3、脫?；磻?yīng)

在攪拌狀態(tài)下，將糖苷化反應(yīng)混合物溶于甲醇中，然后在0℃的條件下邊攪拌邊加入質(zhì)量百分比濃度為30％的甲醇鈉溶液(10.16ml)，NaOCH₃與2、3、4-三-O-乙?；?D溴代吡喃葡萄糖醛酸甲酯的摩爾比為3.5：1，攪拌，進(jìn)行脫酰基反應(yīng)30min之后，加入酸性pH調(diào)節(jié)劑醋酸，調(diào)節(jié)脫?；磻?yīng)的混合物的pH值至7；

4、分離、純化處理

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空狀態(tài)下進(jìn)行減壓蒸餾、濃縮，蒸發(fā)去除溶劑，獲得脫酰基反應(yīng)混合物固體；將脫酰基反應(yīng)混合物樣品進(jìn)行硅膠在柱層析分離、純化處理，其中，洗脫劑：氯仿/甲醇＝9：1；柱層析硅膠：GF254硅膠；得白色固體(化合物6、5.33g)，總產(chǎn)率87％。

化合物6溶于氯仿、乙醇。在TLC板上展開(層析液為氯仿/甲醇10：1，Rf為0.4)后噴霧10％H₂SO₄-乙醇試劑呈現(xiàn)紫紅色。

ESI-MS譜中，m/z[M+Na]⁺為585.19481，分子量為562.56802。

¹H-NMR(400MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(11H，d，J＝8.4Hz，O-CH3)，3.642(3H，t，J＝8.1Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

¹³C-NMR(100MHz，d₆-DMSO)如下：δ(ppm):169.76(C-34)，149.53(C-19)，148.96(C-14)，148.10(C-13)，145.75(C-18)，136.26(C-10)，131.68(C-9)，118.54(C-16)，118.06(C-17)， 115.74(C-11)，112.04(C-12)，111.09(C-20)，109.93(C-15)，100.22(C-28)，87.11(C-4)，81.74(C-6)，76.28(C-32)，75.69(C-30)，73.42(C-31)，71.92(C-29)，70.83(C-1)，69.47(C-8)，56.17，55.97，55.94(C-25、C-26、C-27)，54.48(C-3)，52.41(C-40)，49.80(C-2)。

根據(jù)ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的測試數(shù)據(jù)，確定化合物6為連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯，中文名：(2R,3R,4R,5S)-6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-二甲氧基苯基)六氫駢[3,4-c]呋喃-1-基)-2-甲氧基苯基)-3,4,5-三羥基四氫-2H-吡喃-2-羧酸甲酯；英文名：(2R,3R,4R,5S)-methyl6-(5-((1R,4S)-4-(3,4-dimethoxyphenyl)hexahydrofuro[3,4-c]furan-1-yl)-2-methoxyphenoxy)-3,4,5-trihydroxytetra hydro-2H-pyran-2-carboxylate；分子式為：C₂₈H₃₄O₁₂；結(jié)構(gòu)式為：

試驗(yàn)例1體外抗病毒試驗(yàn)

1.1試驗(yàn)材料

(1)藥物

①連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物：實(shí)施例1制備的連翹脂素葡萄糖醛酸鈉、實(shí)施例3制備的連翹脂素葡萄糖醛酸鉀、實(shí)施例5制備的連翹脂素葡萄糖醛酸、實(shí)施例6制備的連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯均由大連富生天然藥物開發(fā)有限公司生產(chǎn)，經(jīng)高效液相色譜兩種檢測器(紫外檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器)面積歸一化法測定，其純度分別為為99.3％、99.2％、99.7％、99.6％；

②陽性對照藥：利巴韋林注射液，無色透明液體，由河南潤弘股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：1206261，國藥準(zhǔn)字：H19993553，100mg/ml，作為本次試驗(yàn)陽性對照藥物；磷酸奧司他韋，中國藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品批號：101096-200901，100mg/支作為本次試驗(yàn)陽性對照藥物；連翹脂素，白色粉末，大連富生天然藥物開發(fā)有限公司生產(chǎn)，經(jīng)高效液相色譜兩種檢測器(紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器)面積歸一化法測定，其純度為99.2％。

上述藥品均用純凈水溶解，濾過，除菌分裝，4℃?zhèn)溆?，為本次試?yàn)待測藥物。

(2)細(xì)胞株Vero(非洲綠猴腎細(xì)胞細(xì)胞)由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院保存細(xì)胞株。

(3)病毒株①流感病毒株、副流感病毒株、呼吸道合胞病毒(RSV)株：購于中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所；②柯薩奇病毒B3(CVB3)株：購自中科院武漢病毒所；③柯薩奇病毒A16 (CoxA16)株、腸道病毒EV71株：購自日本仙臺國立醫(yī)院；④腺病毒(AdV)：購于白求恩醫(yī)科大學(xué)一院兒科研究室；⑤單純皰疹病毒I型(HSV-1)：購于中國藥品生物制品檢定所。

(4)主要設(shè)備與試劑

生物安全柜：BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH；CO2培養(yǎng)箱：MCO-18AIC，SANYO；倒置顯微鏡：CKX41，OLYMPUS；電子分析天平：AR1140/C，DHAUS；培養(yǎng)基：DMEM，HyClone；胎牛血清：HyClone；胰蛋白酶：Gibco；MTT：Sigma；DMSO：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

(1)細(xì)胞準(zhǔn)備

Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)1-2d，使之成片，界線清晰，立體感及折光度強(qiáng)時(shí)，用胰酶消化，待細(xì)胞面出現(xiàn)針尖樣小孔，吸盡消化液，取數(shù)毫升培養(yǎng)液吹散細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)液(含10％胎牛血清的DMEM)稀釋至約5107個(gè)/L后，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細(xì)胞長成單層。

(2)藥物毒性測定

細(xì)胞毒性試驗(yàn)：將藥物按表1-1所示濃度進(jìn)行稀釋，用于細(xì)胞毒性測定。

表1-1 藥物稀釋參照表(單位：g/L)

將上述用維持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀釋好的不同濃度的藥品滴加于Vero單層細(xì)胞上，每孔0.2ml，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)6孔正常對照(不加藥物的正常對照組)和6孔空白對照(培養(yǎng)液)，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日置倒置顯微鏡觀察CPE并記錄。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL^－1)，繼續(xù)孵育4h，吸棄各孔培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，振蕩5min，492nm測定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。在SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中，將細(xì)胞存活率進(jìn)行Probit回歸分析，計(jì)算藥物對Vero細(xì)胞的最大無毒濃度(TC₀)和半數(shù)毒性濃度(TC₅₀)。

(3)各種病毒TCID₅₀的測定

將各種病毒進(jìn)行10倍遞減稀釋為10^-1,10^-2,10^-3，10^-4，10^-5，10^-6不同稀釋度，按序接種于單層 的Vero細(xì)胞96孔培養(yǎng)板上，每孔100μL，每個(gè)稀釋度6孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對照組。置37℃，5％CO₂中孵育2h，棄病毒液，隨即每孔加細(xì)胞維持液100μL，置37℃，5％CO₂中培養(yǎng)。第3天開始在顯微鏡下觀察細(xì)胞病變結(jié)果，第7-8天判定結(jié)果并做好記錄，以能使50％細(xì)胞孔發(fā)生陽性病變的最高稀釋度作為終點(diǎn)，用karber法計(jì)算病毒滴度。

公式$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\ΣPi}}{100}$

TCID₅₀：50％組織細(xì)胞感染量

XM：病毒最高濃度稀釋度的對數(shù)

d：稀釋度系數(shù)(倍數(shù))的對數(shù)

Σpi：每個(gè)稀釋度病變百分?jǐn)?shù)的總和

(4)藥物對病毒致細(xì)胞病變作用的影響

取已長滿單層細(xì)胞的培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，以100TCID₅₀對應(yīng)的病毒攻擊量接種細(xì)胞，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱吸附2h，加入特定濃度(最大無毒濃度左右)的各藥液，每濃度6個(gè)復(fù)孔培養(yǎng)，200μL/孔。設(shè)利巴韋林注射液和磷酸奧司他韋為陽性藥物對照組，同時(shí)設(shè)正常對照組(不加病毒不加藥)和病毒對照組(加病毒但不加藥物的對照組)，觀察藥物對病毒致CPE的影響。72h后，用MTT比色法，在492nm波長下測定OD值，計(jì)算藥物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件中用ANOVA法比較各藥物抗病毒有效率之間的顯著性差異。

ER％＝(藥物處理組平均OD值－病毒對照組平均OD值)/(細(xì)胞對照組平均OD值－病毒對照組平均OD值)×100％

1.3試驗(yàn)結(jié)果

(1)各種病毒的TCID₅₀

副流感病毒：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

流感病毒：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

CVB₃：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

HSV-1：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+30}{100}=-4.8$

AdV：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

RSV：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

CoxA16：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

EV71：$\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

(2)藥物毒性測定

1)藥物對細(xì)胞毒性的測定

各藥物對Vero細(xì)胞的最大無毒濃度(TC₀)、半數(shù)毒性濃度(TC₅₀)見表1-2。

表1-2 藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(單位：g/L)

2)藥物對病毒致細(xì)胞病變保護(hù)作用結(jié)果

藥物抗各種病毒的有效率及ANOVA法單因素方差分析結(jié)果，詳見表1-3。

表1-3 藥物抗病毒有效率(ER％)統(tǒng)計(jì)表

注：與病毒對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與連翹脂素比，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-3結(jié)果顯示，連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對流感病毒、副流感病毒、單純皰疹病毒Ⅰ型(HSV-I)、腸道病毒EV71的抑制率及有效率均超過90％，與病毒對照組相比差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對多種病毒的抗病毒療效表現(xiàn)優(yōu)于連翹脂素、利巴韋林和磷酸奧司他韋的優(yōu)勢。

試驗(yàn)例2體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)

2.1實(shí)驗(yàn)材料

(1)實(shí)驗(yàn)動物

昆明小鼠，體重18～22g，雌雄各半性，購自大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，質(zhì)量合格證號：SCXK(13)2012-0003。

(2)藥物

①連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物：

實(shí)施例6制備的連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯：白色固體，大連富生天然藥物開發(fā)有限公司生產(chǎn)，經(jīng)高效液相色譜兩種檢測器(紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器)面積歸一化法測定，其純度為99.6％；

②利巴韋林注射液，無色透明液體，由河南潤弘股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：1206261，國藥準(zhǔn)字：H19993553，100mg/ml，作為本次試驗(yàn)陽性對照藥物；

③磷酸奧司他韋，中國藥品生物制品檢定所，產(chǎn)品批號：101096-200901，100mg/支，作為本次試驗(yàn)陽性對照藥物；

④連翹脂素，白色粉末，大連富生天然藥物開發(fā)有限公司生產(chǎn)，經(jīng)高效液相色譜兩種檢測器(紫外檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器)面積歸一化法測定，其純度為99.2％。

上述藥品均用純凈水溶解，濾過，除菌分裝，4℃?zhèn)溆?，為本次試?yàn)待測藥物。

(2)檢測儀器、試劑

2.2實(shí)驗(yàn)方法

(1)流感病毒和副流感病毒對小鼠半數(shù)致死量的測定

將流感病毒和副流感病毒(細(xì)胞裂解液)10倍遞比稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5濃度的病毒液。取昆明種小鼠120只，流感病毒和副流感病毒組各60只，分別隨機(jī)分成6組，乙醚輕度麻醉小鼠，滴鼻感染不同稀釋度病毒液0.03mL/只。同時(shí)設(shè)空白對照，用生理鹽水代替病毒懸液。以死亡和生存為觀察指標(biāo)，每天觀察，直至感染后的14天。感染24h內(nèi)死亡的為非特異死亡，不予統(tǒng)計(jì)，Karber法計(jì)算病毒液LD50。計(jì)算公式：[其中：LD₅₀：半數(shù)致死量；XM：病毒最高濃度稀釋度的對數(shù)；d：稀釋度系數(shù)(倍數(shù))的對數(shù)；Σpi：每個(gè)稀釋度病變百分?jǐn)?shù)的總和]。

(2)連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究

1)試驗(yàn)動物及分組

取四周齡的昆明小鼠960只，進(jìn)行2項(xiàng)試驗(yàn)。取小鼠480只，隨機(jī)分成48組，每組10只，用于連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的測定試驗(yàn),3次重復(fù)試驗(yàn)，每次取小鼠80只。另取小鼠480只，隨機(jī)分成48組，每組10只，用于連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對肺懸液病毒血凝滴度的測定試驗(yàn)，3次重復(fù)試驗(yàn)，每次取小鼠80只。

2)感染方法

在200～300mL大小的燒杯內(nèi)放入一團(tuán)脫脂棉，然后倒入適量的乙醚(使脫脂棉變濕即可)，把裝有脫脂棉的燒杯倒扣過來，把小鼠放入進(jìn)行麻醉，見小鼠極度興奮，明顯呈無力樣時(shí)，將小鼠仰臥，滴鼻感染15LD₅₀流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常對照組用生理鹽水代替病毒懸液。

3)給藥方法及給藥劑量

連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物組、利巴韋林和磷酸奧司他韋對照組，分別于感染前一天開始常規(guī)灌胃給藥，連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物高、中、低給藥劑量分別為13.0、8.0、4.0mg/kg，利巴韋林陽性藥給藥劑量為58.5mg/kg，磷酸奧司他韋陽性藥給藥劑量為19.5mg/kg，連翹脂素組給藥劑量為13.0mg/kg，每天一次，連續(xù)給藥5d，病毒對照組灌服相同體積的生理鹽水。

4)觀察指標(biāo)

①肺指數(shù)測定

小鼠用藥后第5天，先禁食水8小時(shí)，稱體重后摘眼球放血處死動物，打開胸腔摘出全肺，以生理鹽水洗滌兩次，用濾紙吸干表面水份，電子天平稱肺重，按下列公式計(jì)算計(jì)算肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率：

肺指數(shù)＝(小鼠肺重/小鼠體重)×100％；肺指數(shù)抑制率＝(感染模型組平均肺指數(shù)-實(shí)驗(yàn)組平均肺指數(shù))/感染模型組平均肺指數(shù)×100％。

②肺懸液病毒血凝滴度測定

分別取治療后第5天的各組小鼠肺，低溫下置勻漿器研磨成勻漿，生理鹽水稀釋為10％的肺組織懸液，離心取上清，倍比稀釋，按0.2ml/孔滴于滴定板上,每孔加入0.2ml 1％雞紅細(xì)胞懸液,混勻,置室溫30min,觀察記錄血凝滴度。以紅細(xì)胞凝集(++)時(shí)為終點(diǎn)，以懸液稀釋倍數(shù)表示其滴度。

③肺組織形態(tài)學(xué)觀察

分別取治療后第5天的各組小鼠肺，肉眼觀察記錄肺臟大體病變情況。生理鹽水中漂洗干凈，用濾紙吸干，取一部分10％甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察并拍照，如圖4所示。

2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

(1)流感病毒和副流感病毒對小鼠半數(shù)致死量的測定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組昆明種小鼠分別被滴鼻感染不同濃度流感病毒、副流感病毒液30μL，感染第3天前3組(病毒濃度為10^-1組、10^-2組、10^-3組)小鼠均出現(xiàn)不同程度的發(fā)病癥狀：聳毛、發(fā)抖、飲食減少等；第5天小鼠出現(xiàn)走路搖擺不定；第6天最高病毒濃度組小鼠開始出現(xiàn)死亡，其余各組于感染后第7天陸續(xù)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。觀察14天結(jié)束后，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡數(shù)目，結(jié)果見下表1-4、1-5。計(jì)算該流感病毒的LD₅₀為稀釋度10^-2.9，副流感病毒的LD₅₀為稀釋度10^-2.5。

表1-4 流感病毒半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Karber法計(jì)算病毒的LD₅₀。流感病毒的LogLD₅₀如下：

$\mathrm{Log}{\mathrm{LD}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\&Sigma;Pi}}{100}=-1+0.5-(80\%+60\%+40\%+20\%+0\%+0\%)=-2.9$

表1-5 副流感病毒半數(shù)致死量試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Karber法計(jì)算病毒的LD₅₀。副流感病毒的LogLD₅₀如下：

$\mathrm{Log}{\mathrm{LD}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\&Sigma;Pi}}{100}=-1+0.5-(90\%+70\%+40\%+30\%+10\%+0\%)=-2.5$

(2)連翹脂素葡萄糖醛酸甲酯抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用結(jié)果

①肺指數(shù)測定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指數(shù)測定結(jié)果顯示：與感染模型組比較，連翹脂素 葡萄糖醛酸衍生物(甲酯)濃度在3.25～13.0mg/kg/d范圍內(nèi)有一定保護(hù)作用,肺指數(shù)均明顯降低；連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物高劑量組對流感病毒和副流感病毒的療效優(yōu)于連翹脂素組(P<0.05)。試驗(yàn)結(jié)果見表1-6、1-7。

表1-6 連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對流感病毒感染小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)的抑制率(n＝3)

與病毒對照組比較,^*P<0.05，^**P0.01；與連翹脂素組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-7 連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對副流感病毒感染小鼠肺指數(shù)和肺指數(shù)抑制率的影(n＝3)

與病毒對照組比較,^*P<0.05，^**P0.01；與連翹脂素組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

②肺懸液病毒血凝滴度測定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，感染模型組肺組織病毒血凝滴度(InX)分別為32.40和33.11，不同濃度連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物(甲酯)治療5天后，肺組織病毒血凝滴度均有所下降，與感染模型組比較，差異有顯著性,(P<0.01)；其中，連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物中、高劑量組對流感、副流感病毒血凝滴度均明顯低于模型組，抑制率均高于連翹脂素組，差異顯著(P<0.05，p<0.01)。試驗(yàn)結(jié)果見表1-8、1-9。

表1-8 連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對流感病毒感染小鼠肺懸液血凝滴度的影響(n＝3)

與病毒對照組比較,^*P<0.05，^**P<0.01；與連翹脂素組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-9 連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物對副流感病毒感染小鼠肺懸液血凝滴度的影響(n＝3)

與病毒對照組比較,^*P<0.05，^**P<0.01；與連翹脂素組比較，^#P<0.05，^##P<0.01。

③肺組織學(xué)檢測結(jié)果

由圖4、5的試驗(yàn)結(jié)果可以看出：流感病毒和副流感病毒肺炎模型組小鼠肺臟大多數(shù)有充血，水腫病變，有些呈暗褐色外觀的實(shí)變區(qū)，嚴(yán)重病例呈現(xiàn)棕紅色的出血病灶。鏡下可見，支氣管、細(xì)支氣管壁、肺泡壁等肺間質(zhì)充血、水腫以及淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤，肺泡壁增寬，肺泡呈炎癥反應(yīng)。流感病毒和副流感病毒肺炎小鼠模型經(jīng)連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物治療后，各組鼠肺大體病變明顯減輕，部分肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；與感染模型組相比，肺泡間隔較薄，肺泡壁和細(xì)支氣管壁單個(gè)核細(xì)胞浸潤數(shù)量較少，腔內(nèi)無滲出，病變明顯減輕。連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物治療副流感病毒肺炎的中、高劑量組與感染模型組相比，肺泡間隔明顯較薄，單個(gè)核細(xì)胞浸潤數(shù)量較少，腔內(nèi)無滲出，病變明顯減輕。

2.4結(jié)論

體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物在3.25～13mg/kg/d的劑量范圍對流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有較明顯的抑制作用，能明顯降低其肺指數(shù)和血凝滴度，肺組織病理學(xué)也有明顯改善，與病毒模型對照組比較差異顯著；且連翹脂素葡萄糖醛酸衍生物中、高劑量組療效明顯優(yōu)于連翹脂素(*P<0.05或**P<0.01)，同時(shí)表現(xiàn)出優(yōu)于利巴韋林和磷酸奧司他韋的趨勢。