本發(fā)明屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型酶聯(lián)免疫分析方法。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme-linked immunoassay，簡(jiǎn)稱(chēng)ELISA)，是一種利用抗原抗體之間專(zhuān)一性鍵結(jié)的特性對(duì)檢體進(jìn)行檢測(cè)的方法。ELISA分析法由于其快速、簡(jiǎn)便的分析特性，廣泛用于血清、血漿、尿、便、組織液等樣品中各種生化指標(biāo)、疾病標(biāo)志物的臨床檢驗(yàn)。其中，雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的ELISA分析方法，其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測(cè)抗原分子上的兩個(gè)抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對(duì)于待測(cè)抗原是過(guò)量的，因此復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原的含量在檢測(cè)范圍內(nèi)成正比。測(cè)定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量，即可確定待測(cè)抗原含量。
已有的酶聯(lián)免疫分析試劑盒，多基于抗原與抗體特異性識(shí)別的原理構(gòu)建。其中，辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)由于其比活性高、穩(wěn)定、分子量小且純酶容易制備的特性，常常被用作信號(hào)介導(dǎo)物質(zhì)，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)對(duì)象的信號(hào)讀出。HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。HRP催化反應(yīng)的過(guò)程如下：
DH2+H2O2→D+2H2O
利用HRP催化過(guò)氧化氫(H2O2)氧化染料產(chǎn)生顯色反應(yīng)，并采用光度檢測(cè)儀器得到定性或定量分析結(jié)果，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的檢測(cè)。因此，所有以HRP作為信號(hào)介導(dǎo)的免疫試劑盒，均需要外源性H2O2作為顯色反應(yīng)試劑配套使用。
H2O2由于分子結(jié)構(gòu)的低對(duì)稱(chēng)性及過(guò)氧鍵的存在，導(dǎo)致其化學(xué)穩(wěn)定性較差，易發(fā)生自分解反應(yīng)或與共存組分發(fā)生氧化還原反應(yīng)。另外，H2O2在高溫、光照或與一些不兼容化學(xué)物質(zhì)(如過(guò)渡態(tài)金屬離子、有機(jī)可燃物等)作用下，會(huì)迅速分解生成水和氧氣并放出大量的熱，激發(fā)其熱危險(xiǎn)性，進(jìn)而引發(fā)熱失控反應(yīng)，最終導(dǎo)致爆炸事故的發(fā)生。因此，H2O2屬易燃易爆品，無(wú)論在試劑盒的生產(chǎn)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等環(huán)節(jié)，均需要較為苛刻的存放環(huán)境和包裝材料；由于不得與其他試劑共存，通常要求使用單獨(dú)的包裝；H2O2的自分解，會(huì)導(dǎo)致不同批次試劑盒檢測(cè)結(jié)果的可比性變差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述采用HRP作為抗體標(biāo)記物進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析存在的缺點(diǎn)，提供一種簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析方法。
解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案由下述步驟組成：
1、將待測(cè)抗原標(biāo)準(zhǔn)品加入pH值為7.4的PBS緩沖液中，配制1～10000pg/L抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入到包被抗體的固相載體表面，使抗原與抗體鍵合，隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體并拍干。
2、將葡萄糖氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體溶解于pH值為7.4的PBS緩沖液后，加入到步驟1中鍵合抗原的固相載體表面，與鍵合在固相載體表面的抗原反應(yīng)，隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體并拍干。
3、將葡萄糖水溶液加入到步驟2中獲得的固相載體表面，30～37℃反應(yīng)10～20分鐘，加入葡萄糖氧化酶顯色劑和催化量的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行顯色反應(yīng)，并測(cè)定光密度，繪制光密度隨抗原標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
4、按照上述步驟1～3的方法測(cè)試待測(cè)抗原樣品對(duì)應(yīng)的光密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程即可確定待測(cè)抗原樣品中抗原的含量。
上述步驟3中，所述的葡萄糖氧化酶顯色劑優(yōu)選4-氨基安替比林和N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽的顯色體系。
上述的洗滌緩沖液是由pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.1％。
上述的固相載體為聚苯乙烯酶標(biāo)板。
上述葡萄糖氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體用戊二醛二步法制備得到，具體制備方法如下：
1、將25mg葡萄糖氧化酶溶于1mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.25％的戊二醛水溶液中，室溫靜置12小時(shí)，所得反應(yīng)液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫，流速為1mL/min，收集棕色流出液。若收集得到的棕色流出液體積大于5mL，用聚乙二醇濃縮至5mL，置于25mL燒杯中。
2、將12.5mg待標(biāo)記的單克隆抗體用生理鹽水稀釋至5mL，攪拌下逐滴加入到步驟1得到的酶溶液中，并加入0.25mL 1mol/L pH＝9.5的碳酸緩沖液，繼續(xù)攪拌3小時(shí)，再加入0.25mL 0.2mol/L賴(lài)氨酸水溶液，混勻后，室溫下放置2小時(shí)，然后在攪拌下逐滴加入與反應(yīng)混合液等體積的飽和硫酸銨，4℃靜置1小時(shí)，3000rpm離心0.5小時(shí)，取下層沉淀物用半飽和硫酸銨洗滌兩次，將沉淀物溶于5mL0.15mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液后裝入透析袋中，用0.15mol/L pH＝7.4的PBS緩沖液透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))10000rpm離心30min去除沉淀物，上清液即為葡萄糖氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體。
本發(fā)明的免疫分析方法通過(guò)葡萄糖氧化酶(GOD)與單克隆抗體鍵合形成酶標(biāo)抗體復(fù)合物，被檢測(cè)抗原與酶標(biāo)復(fù)合物特異性結(jié)合后，加入酶反應(yīng)底物葡萄糖，與GOD作用產(chǎn)生初生態(tài)活性氧，然后在催化量的HRP催化作用下，初生態(tài)活性氧與顯色劑經(jīng)顯色反應(yīng)放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)抗原的檢測(cè)。本發(fā)明通過(guò)被標(biāo)記GOD和底物葡萄糖作用產(chǎn)生的初生態(tài)氧代替外源性H2O2，成功地避免了H2O2易分解不穩(wěn)定從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，并且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
本發(fā)明建立的免疫分析方法為夾心法酶聯(lián)免疫分析法，是一種簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)的免疫分析方法，且在生產(chǎn)成本、運(yùn)輸儲(chǔ)存特性、使用安全性和環(huán)保性等幾個(gè)方面均具有顯著的意義。本發(fā)明方法既可以制作成試劑盒商品化廣泛使用，也可用作公司或?qū)嶒?yàn)室自測(cè)樣使用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
附圖說(shuō)明
圖1是實(shí)施例1中光密度隨血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
測(cè)定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的含量，具體步驟如下：
1、將VEGF標(biāo)準(zhǔn)品加入0.1mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液中，分別配制1pg/L、10pg/L、100pg/L、1000pg/L和10000pg/L的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將包被Anti-VEGF抗體的聚苯乙烯酶標(biāo)板的各個(gè)孔分別用洗滌稀釋液(由0.05mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.05％)洗滌后拍干(1次)，分別設(shè)空白孔(空白孔不加待測(cè)樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同)、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，在標(biāo)準(zhǔn)孔中分別加入50μL濃度為1pg/L、10pg/L、100pg/L、1000pg/L和10000pg/L的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待測(cè)樣品孔中先加40μL 0.1mol/L pH為7.4的PBS緩沖液，然后再加10μL血清樣本(待測(cè)樣品最終稀釋度為5倍)，37℃溫育1小時(shí)，棄去酶標(biāo)板中液體，拍干，隨后用洗滌緩沖液(由pH值為7.4的PBS緩沖液和吐溫-20組成，其中吐溫-20占洗滌緩沖液質(zhì)量的0.1％)洗滌酶標(biāo)板并拍干(3次)。
2、將葡萄糖氧化酶標(biāo)記的單克隆抗體(Recombinant人VEGF 165A protein)加入0.1mol/L pH值為7.4的PBS緩沖液中，配制成0.038U/mL的溶液，在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔中各加入50μL該溶液，空白孔除外，37℃溫育1小時(shí)，棄去酶標(biāo)板中液體，拍干，隨后用洗滌緩沖液(與步驟1相同)洗滌酶標(biāo)板并拍干(3次)。
3、在每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔、空白孔中均加入50μL 1mol/L的葡萄糖水溶液，30℃反應(yīng)10分鐘，再加入50μL 0.005mol/L 4-氨基安替比林水溶液和50μL0.004mol/L N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺鈉鹽水溶液、10μL 40U/mL HRP水溶液，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘；采用酶標(biāo)儀，以空白孔調(diào)零，在555nm波長(zhǎng)下分別測(cè)量各個(gè)孔的光密度，以VEGF標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值(lgC)為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)，繪制光密度隨VEGF標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(結(jié)果見(jiàn)圖1)，其檢出限為3.24×10-4ng/L。
4、根據(jù)上述步驟1～3得到的待測(cè)樣品孔對(duì)應(yīng)的光密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性方程，計(jì)算出血清樣本中VEGF的含量為5.30ng/L，再乘以稀釋倍數(shù)，即為待測(cè)樣品的實(shí)際含量。