專(zhuān)利名稱：齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒及其制備和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒的試劑盒及其制備和檢測(cè)方法，特別是涉及齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒及制備該試劑盒的方法與應(yīng)用該試劑盒進(jìn)行齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
齒蘭環(huán)斑病毒(Odntoglossum ringspot virus，ORSV)屬煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，是危害蘭科植物的兩種主要病毒之一，分布世界各地，主要危害齒蘭、建蘭等。蘭花一旦感染ORSV，其葉片常產(chǎn)生黃化條紋或不規(guī)則褪綠色斑塊，病株花部甚至出現(xiàn)畸形或褪色斑，紅色系花朵褪色斑尤為明顯，對(duì)蘭花的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值造成嚴(yán)重影響。我國(guó)蘭花資源豐富，但研究表明，無(wú)論是盆栽的地生蘭花還是組培的蘭花，該病毒病均相當(dāng)普遍。鑒于ORSV對(duì)我國(guó)蘭花產(chǎn)業(yè)的危害性，研究其檢測(cè)技術(shù)已十分重要。
植物病毒檢測(cè)常用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)方法，酶免疫分析是將抗原抗體結(jié)合的特異性與酶的高效催化性相結(jié)合的技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，但操作步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，且需要相對(duì)昂貴的酶標(biāo)抗體和96孔酶標(biāo)板。
斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)是以酶免疫吸附分析的原理為基礎(chǔ)近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)方法，曾研究報(bào)道該方法用于快速檢測(cè)羊胴體中的沙門(mén)氏菌與常規(guī)分離培養(yǎng)檢測(cè)比較，不僅簡(jiǎn)便，快捷，而且安全、可靠。而目前尚未有關(guān)斑點(diǎn)免疫酶聯(lián)用于檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒的文獻(xiàn)報(bào)道以及用于檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒的斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供簡(jiǎn)便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)的試劑盒。
本發(fā)明的另一目的，在于提供制備齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的方法。
本發(fā)明的再一目的，在于提供利用制備的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)齒蘭環(huán)斑病毒的檢測(cè)方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是
齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成。
所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩沖液 1瓶顯色劑 1支陽(yáng)性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩沖液 1瓶所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液。
所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
所述的陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
所述的洗滌緩沖液為0.005-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的制備方法，它主要包括下列步驟1、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時(shí)加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機(jī)中將病葉搗碎，過(guò)濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過(guò)夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時(shí)，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時(shí)，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑。此后進(jìn)行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機(jī)上以30000rmp離心2.5小時(shí)，離心結(jié)束后將病毒帶取出。
2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定效價(jià)；通過(guò)辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過(guò)夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體。
3、陽(yáng)性、陰性樣品的制備陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4、各種用液的制備保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
洗滌緩沖液為0.005-0.05M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法為斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)法，它包括以下步驟1、試劑準(zhǔn)備根據(jù)檢測(cè)的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2、樣品處理取待測(cè)樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點(diǎn)樣取處理后的樣品在PVDF膜上點(diǎn)樣，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；4、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫30-90min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；
8、檢測(cè)判定根據(jù)檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定檢測(cè)結(jié)果。
采用上述方案后，本發(fā)明由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液、PVDF膜組裝成經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)試劑盒。試劑盒的制備方法簡(jiǎn)便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。樣品用量少，在較短的時(shí)間內(nèi)就可以完成檢測(cè)，且結(jié)果易于保存，應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行斑點(diǎn)酶聯(lián)聯(lián)檢測(cè)的方法與其他血清學(xué)檢驗(yàn)方法相比具有簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等更多的優(yōu)點(diǎn)，且試劑盒使用不需特殊儀器，直接可用肉眼判定結(jié)果，所以便于在基層單位推廣應(yīng)用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明所用的主要試劑齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體為廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園制備；PEG6000(聚乙二醇6000)、2-巰基乙醇、Triton-100(曲拉通X-100)、牛血清白蛋白(BSA)購(gòu)自Sigma公司；羊抗兔酶標(biāo)抗體、BCIP、NBT、DEAE離子交換填充物、IgG親合層析填充物購(gòu)自Pierce公司；試驗(yàn)中所使用的其他常規(guī)藥品和試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br> 一、試劑盒齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶保溫液II 1瓶顯色緩沖液 1瓶顯色劑 1支陽(yáng)性樣品 1支陰性樣品 1支樣品處理液 1瓶洗滌緩沖液 1瓶陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，其濃度為100μg/ml；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.1M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液。
顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP。
樣品處理液為2M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液。
洗滌緩沖液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
二、制備方法本發(fā)明齒蘭環(huán)斑病毒檢測(cè)試劑盒的制備方法，它包括下列步驟1、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時(shí)加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機(jī)中將病葉搗碎，過(guò)濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過(guò)夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時(shí)，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時(shí)，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑。此后進(jìn)行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機(jī)上以30000rmp離心2.5小時(shí)，離心結(jié)束后將病毒帶取出。
2、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔。每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定效價(jià)；通過(guò)辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體。用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過(guò)夜，透析除鹽。取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體。
3、陽(yáng)性、陰性樣品的制備陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4、各種用液的制備保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體0.05M的磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠。
顯色緩沖液為0.1M，pH9.5，含MgCl2 10g/L+NaCl 2g/L的Tris緩沖液；顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；樣品處理液為2M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)；
洗滌緩沖液為0.01M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。
封閉緩沖溶液為20-100mmol/L pH7.4 PBS+1-5％脫脂奶粉。
三、檢測(cè)方法實(shí)施例試劑盒的斑點(diǎn)酶聯(lián)(DIBA)檢測(cè)方法1、試劑準(zhǔn)備根據(jù)檢測(cè)的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2、樣品處理取待測(cè)樣品0.1g加入1ml樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3、點(diǎn)樣取1μL處理后的樣品在PVDF膜上點(diǎn)樣，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；4、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥30min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫45min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫45min。取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；8、檢測(cè)判定根據(jù)檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定檢測(cè)結(jié)果。
斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)在陽(yáng)性對(duì)照顯色、陰性對(duì)照不顯色的情況下，樣品檢測(cè)帶有斑點(diǎn)的判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。
1)待測(cè)樣品按以上標(biāo)準(zhǔn)，定性判斷待測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果的陰、陽(yáng)性。
為檢驗(yàn)斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)效果，用該法檢測(cè)了40份蘭花樣品，檢測(cè)結(jié)果如下附表1 檢測(cè)結(jié)果

注“+”代表陽(yáng)性；“-”代表陰性31份由RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的樣品，DIBA檢測(cè)陽(yáng)性樣品30份，1份陰性；9份由RT-PCR檢測(cè)陰性的樣品，DIBA檢測(cè)陰性樣品份，陽(yáng)性樣品1份；由檢測(cè)結(jié)果可知DIBA的敏感性為96.77％；特異性88.89％；檢測(cè)準(zhǔn)確性為95％。
權(quán)利要求
1.齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，主要由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種瓶裝用液和PVDF膜組成，其特征在于所述的各種瓶裝用液包括保溫液I 1瓶；保溫液II1瓶；顯色緩沖液 1瓶；顯色劑 1支；陽(yáng)性樣品1支；陰性樣品1支；樣品處理液 1瓶；洗滌緩沖液 1瓶。
2.如權(quán)利要求書(shū)1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌緩沖液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
3.如權(quán)利要求1或2所述的建蘭花葉病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒；所述的陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液。
4.如權(quán)利要求3所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度為0.1μg-100μg/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的制備方法主要包括下列步驟1)、齒蘭環(huán)斑病毒的提取和純化取莧色藜病葉加0.52倍重量(g)體積(ml)的1/15M，pH7.0的PB緩沖液，同時(shí)加入1％巰基乙醇和正丁醇、三氯甲烷，在搗碎機(jī)中將病葉搗碎，過(guò)濾，將濾液分裝于離心管內(nèi)，6000rmp離心20分鐘，上清液加入4％體積重量的PEG(MW6000)和2％體積重量的NaCL攪拌溶解，4℃過(guò)夜；6000rmp離心20分鐘，沉淀加入1％TritonX-100和1/15M PB懸浮攪拌1小時(shí)，7000rmp離心20分鐘；取上清，32000rmp·min(Beckman SW40)離心2小時(shí)，沉淀用1/15M PB懸浮，5000rmp·min(BeckmanJA-14)離心15分鐘，上清即為粗提提純病毒制劑，此后進(jìn)行病毒的精提純，將以上粗提純的病毒10％-40％的蔗糖密度梯度柱上，在超速離心機(jī)上以30000rmp離心2.5小時(shí)，離心結(jié)束后將病毒帶取出；2)、抗血清的制備及純化選用雄性白兔作免疫動(dòng)物，加等量Freund氏不完全佐劑乳化的提純病毒做免疫原，采用三次肌肉注射和兩次靜脈注射免疫家兔，每次注射病毒的量分別是0.5mg、0.75mg、1mg、1.5mg和2mg，間隔時(shí)間為7天，最后一次注射后7-10天采血2次，析出血清用瓊脂雙擴(kuò)散法測(cè)定效價(jià)；通過(guò)辛酸沉淀法結(jié)合DEAE離子交換層析純化抗體，用2倍體積0.1M醋酸銨調(diào)節(jié)抗血清至pH4.8，按0.75ml辛酸/1ml血清加入正辛酸，混合攪拌1小時(shí)，5000rpm離心30分鐘，取上清，將透析袋置于10mM Tris-Cl pH8.5緩沖液過(guò)夜，透析除鹽，取透析完全的溶液上樣于離子交換柱中，用10mMTris-HCl pH8.5緩沖液5ml/min沖洗15分鐘，再用含0-1M NaCl的10mM Tris-HCl pH8.5緩沖液濃度梯度進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰部分，濃縮透析，獲得純化的齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體；3)、陽(yáng)性、陰性樣品的制備陽(yáng)性樣品為純化的齒蘭環(huán)斑病毒，濃度在0.1μg-100μg/ml范圍；陰性樣品為封閉緩沖溶液研磨健康葉制備的溶液；4)、各種用液的制備所述的保溫液I為含有齒蘭環(huán)斑病毒多克隆抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的保溫液II為含有羊抗兔酶標(biāo)抗體的0.01-0.1M磷酸鹽緩沖液，內(nèi)含1％明膠；所述的顯色緩沖液為0.05-0.3M，pH9.5，含MgCl210g/L+NaCl2g/L的Tris緩沖液；所述的顯色劑為0.01g/ml NBT+0.005g/ml BCIP；所述的樣品處理液為1-5M，pH9.6的碳酸鹽緩沖液；所述的洗滌緩沖液為0-0.05M，pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
6.如權(quán)利要求1所述的齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檢測(cè)方法為斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)法，它包括以下步驟1)、試劑準(zhǔn)備根據(jù)檢測(cè)的需要，稀釋樣品處理液和洗滌緩沖液，備用；2)、樣品處理取待測(cè)樣品加入樣品處理液充分研磨，離心取上清液，再稀釋備用；3)、點(diǎn)樣取處理后的樣品在PVDF膜上點(diǎn)樣，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；4)、吸附將PVDF膜置于37℃恒溫箱干燥0-60min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；5)、孵育I取PVDF膜浸泡于保溫液I中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；6)、孵育II取PVDF膜浸泡于保溫液II中，于37℃保溫30-90min，取出，用洗滌液洗滌三次，每次3min；7)、顯色將洗滌后的PVDF膜取出浸泡于顯色液中，顯色5-10min；8)、檢測(cè)判定根據(jù)檢測(cè)判定標(biāo)準(zhǔn)，判定檢測(cè)結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了齒蘭環(huán)斑病毒斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法，試劑盒由盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的各種用液和PVDF膜組裝成經(jīng)濟(jì)實(shí)用的檢測(cè)試劑盒。試劑盒的制備方法簡(jiǎn)便、快捷、安全、可靠且經(jīng)濟(jì)實(shí)用。樣品用量少，在較短的時(shí)間內(nèi)就可以完成檢測(cè)，且結(jié)果易于保存，應(yīng)用該檢測(cè)試劑盒進(jìn)行斑點(diǎn)酶聯(lián)檢測(cè)的方法與其他血清學(xué)檢驗(yàn)方法相比具有簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，并具有較高的可重復(fù)性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用等更多的優(yōu)點(diǎn)，所以便于在基層單位推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1975426SQ20061016443
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月10日
發(fā)明者明艷林, 鄭國(guó)華, 童慶宣, 李梅, 陳良華 申請(qǐng)人:廈門(mén)華僑亞熱帶植物引種園