專利名稱：：測定病毒滴度的酶免疫斑點法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及病毒滴度的測定方法，特別是酶免疫斑點法(EIS)測定病毒滴度。病毒學(xué)理論研究應(yīng)用病毒學(xué)的研究及生產(chǎn)過程都涉及病毒量的測定，即病毒滴度的測定。以往和現(xiàn)行的測定方法主要有動物法、蝕斑法和細(xì)胞病變法，其中常用的是蝕斑法和細(xì)胞病變法，特別是細(xì)胞病變法(CPE)，因其較蝕斑法簡便，利于多份樣品的測定，常在多批量的測定中采用。但是，CPE法是以顯微鏡下觀察細(xì)胞病變?yōu)榕卸ㄖ笜?biāo)，并依此計算半數(shù)細(xì)胞感染劑量(TCID50)；試驗對操作者技術(shù)要求高，不同病毒造成的細(xì)胞病變有差異也有雷同，造成病變結(jié)果不易辯認(rèn)。因此，試驗結(jié)果受主觀因素影響較大，操作誤差大，另外，CPE工作量大，工作強度高，操作時間長。本發(fā)明的目的是提供一種病毒滴度的測定方法，該方法簡便、快速、便于記錄結(jié)果，操作誤差小。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法，它包括以下幾個步驟(1)單層細(xì)胞準(zhǔn)備，并向細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入細(xì)胞懸液；(2)病毒稀釋，并將稀釋后不同濃度的病毒分別加到測定用的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中；(3)感染細(xì)胞的培養(yǎng)；(4)將步驟(3)中的感染細(xì)胞固定、封閉；(5)加入該病毒的特異性抗體；(6)加酶標(biāo)記的第二抗體；(7)加酶底物，數(shù)分鐘后有病變的部位即出現(xiàn)染色斑點。上述測定步驟中，從細(xì)胞準(zhǔn)備至感染細(xì)胞培養(yǎng)系常規(guī)技術(shù)方法，對絕大多數(shù)病毒均適用，在作具體病毒的測定中，僅需改變該病毒的特異性抗體即可，其余各培養(yǎng)、反應(yīng)步驟中，溫度控制在36-37℃之間，抗體反應(yīng)時間控制在20分鐘至60分鐘(除酶與底物作用時間較短外，底物抗體反應(yīng)在室溫下進行)。本發(fā)明利用免疫反應(yīng)的特異性和酶化學(xué)反應(yīng)放大性特點，創(chuàng)造性地形成染色斑點，使顯微鏡下才能辯別出來的細(xì)胞病變以肉眼可見的形式表現(xiàn)出來，并且保證了這種表現(xiàn)方式的特異性(抗原-抗體特異性結(jié)合)，以往的酶聯(lián)免疫吸附試驗(EIA)都以顯色反應(yīng)測定OD值來判定結(jié)果或觀察液體的顏色變化，其抗原、抗體反應(yīng)是在可溶解和分散的狀態(tài)下進行的，底物顯色也是在溶解于液體中再表現(xiàn)出來的，而EIS與EIA的不同在于前者的反應(yīng)及表現(xiàn)都是在細(xì)胞病變部位發(fā)生的，是定位的，有形的，與酶免疫組織化學(xué)技術(shù)相比，EIS是在細(xì)胞培養(yǎng)板上直接檢測染色斑點，是有重要區(qū)別的。本發(fā)明優(yōu)點通過引入酶免疫技術(shù)使微量板上出現(xiàn)的CPE部位形成特異的染色斑點，從而可以用肉眼直接判定各孔是否出現(xiàn)CPE，免去顯微鏡下觀察CPE造成的工作量增加，使結(jié)果客觀、更直觀，快速、便于記錄，操作誤差小。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明實施例11、取培養(yǎng)3-5天，生長良好的FL細(xì)胞(長春生研所提供)，用細(xì)胞消化液處理后，棄干消化液，將細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)液中(MEM培養(yǎng)基含5％小牛血清，青霉素、鏈霉素各1萬u/ml，稀釋成30-50×104/ml濃度。在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上每孔加細(xì)胞懸液100μl。2、取麻疹病毒(長春生物制品研究所(長47株)50批)在試管中稀釋成10-4、10-5濃度，分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔中，每個濃度加8孔，每孔100μ1，繼續(xù)做細(xì)胞培養(yǎng)。3、培養(yǎng)板置于5％CO2培養(yǎng)箱中，37℃，8天，上述幾個步驟可見計劃免疫技術(shù)管理規(guī)程(衛(wèi)生部1987年)。4、固定將培養(yǎng)8天的培養(yǎng)板棄其培養(yǎng)液，各孔加固定液(70％丙酮/PBS(磷酸鹽緩沖液))150μl，置冰盒內(nèi)15分鐘，棄去固定液，通風(fēng)處涼干，置-20℃?zhèn)溆没蛑苯舆M行下一步。5、封閉各孔加稀釋液(PBS/BT)〔即PBS(0.01M，PH7.2)+0.5％明膠及0.15％吐溫-20(Tween-20)〕150μl，37℃，30分鐘，再用洗液(PBS/T)〔PBS+0.05％吐溫-20(Tween-20)〕洗3次。6、加抗麻疹病毒單克隆抗體(McAb)V17株，該抗體以PBS/GT稀釋1∶3000，隨后每孔加75μl，37℃，40分鐘，洗6次(洗液同上。7、加抗鼠IgG-過氧化物酶標(biāo)記物(Ab-E)(美國ZYmed公司產(chǎn)品)用時以PBS/GT稀釋1∶3000，每孔加75μl置37℃，40分鐘，洗6次(洗液同上)。加底物用10ml的底物稀釋液(用1.0M檸檬酸將0.1M醋酸鈉至PH5.5)加入200μlTMB(系Sigma公司產(chǎn)品，100mgTMB溶于20mlDmso中，分裝成1ml/瓶，置-20℃?zhèn)溆?再加20％H2O22μl，混勻后每孔加75μl，室溫下放置5-20分鐘。結(jié)果判定白色背景下肉眼觀察，出現(xiàn)蘭色斑點為陽性，未加病毒細(xì)胞的對照孔不出現(xiàn)染色斑點，記錄各孔情況見圖片(附圖1)。圖1中兩個“S”指兩份樣品，“-4，-5”指10-4和10-5兩個稀釋度，NO.V.Contr指沒有病毒的對照，即沒有感染病毒的細(xì)胞經(jīng)處理后不出現(xiàn)染色斑點，陰性對照。病毒滴度計算(Karber法)計算半數(shù)細(xì)胞感染濃度(TCID50)，用其對數(shù)表示病毒滴定，LogTCID50=Xm+d(50-Σpi100)]]>Xm＝病毒最高濃度的對數(shù)d＝稀釋倍數(shù)對數(shù)ΣPi＝每個稀釋度出現(xiàn)病變(斑點)孔數(shù)占同稀釋度所用孔數(shù)的百分?jǐn)?shù)，在公式中，Xm＝-4，d＝1，Pi計算時分母為8，如10-4濃度下有6孔出現(xiàn)斑點，則P-4＝6/8×100％＝75％，即10-4濃度下有75％孔出現(xiàn)斑點。結(jié)果1、試驗的50批病毒滴度(TCID50/ml)，最低的小于4.5，最高的6.5，分布見表1，50批病毒滴度與CPE法相比較，49份相符，符合率98.0％(49/50)，其中一份病毒滴度不一致，EIS法滴度為6.50，CPE法是6.375。2、50批病毒滴度共用800個試驗孔，各孔結(jié)果(+/-)總符合率為99.88％(799/800)。所有陰性對照孔未出現(xiàn)斑點。3、以800個試驗孔結(jié)果(+/-)計算特異性，按下述方式計算真陽性數(shù)假陰性數(shù)5100510假陽性數(shù)真陰性數(shù)本試驗1289290總數(shù)800敏感性＝510/510×100％＝100％特異性＝289/290×100％＝99.66％表150批麻疹病毒EIS法滴度分布</tables>權(quán)利要求1.一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特征在于它包括以下幾個步驟(1)單層細(xì)胞準(zhǔn)備，并向細(xì)胞培養(yǎng)板各孔中加入細(xì)胞懸液；(2)病毒稀釋，并將稀釋后不同濃度的病毒分別加到測定用的細(xì)胞培養(yǎng)板孔中；(3)感染細(xì)胞的培養(yǎng)；(4)將步驟(3)中的感染細(xì)胞固定、封閉；(5)加入該病毒的特異性抗體；(6)加酶標(biāo)記的第二抗體；(7)加酶底物，數(shù)分鐘后有病變的部位即出現(xiàn)染色斑點。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特征在于所述的病毒為麻疹病毒，特異性抗體為抗麻疹病毒單克隆抗體，酶標(biāo)記的第二抗體為抗鼠IgG一過氧化物酶標(biāo)記物。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特征在于所述的抗麻疹病毒單克隆抗體以PBS/GT稀釋，加至封閉后的感染細(xì)胞上，溫度控制在36-37℃。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的測定病毒滴度的酶免疫斑點法，其特征在于所述的抗體反應(yīng)時間控制在20-60分鐘，溫度37℃。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定病毒滴度酶免疫斑點法，其特征在于所述的加入酶標(biāo)記物以PBS/GT稀釋，溫度控制在36-37℃。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的測定病毒滴度酶免疫斑點法，其特征在于所述的抗體反應(yīng)時間控制在20-60分鐘，溫度37℃。全文摘要一種測定病毒滴度的酶免疫斑點法,它包括以下幾個步驟:單層細(xì)胞準(zhǔn)備,病毒稀釋,感染細(xì)胞培養(yǎng)、固定、封閉,加入該病毒的特異性抗體,加酶標(biāo)記的第二抗體,加酶底物、數(shù)分鐘后有病變的部位即出現(xiàn)染色斑點,本方法通過引入酶免疫技術(shù)使微量板上出現(xiàn)的CPE部位形成特異的染色斑點,從而可用肉眼直接判定各孔是否出現(xiàn)CPE,免去顯微鏡下觀察CPE造成的工作量增加,使結(jié)果客觀、更直觀,便于記錄,快速,操作誤差小,易于推廣使用。文檔編號G01N33/569GK1196394SQ9710007公開日1998年10月21日申請日期1997年2月21日優(yōu)先權(quán)日1997年2月21日發(fā)明者呂長國,馬沈英,吳燕平,扈光偉,李守幫,薄平,宋潔槐申請人:吉林省衛(wèi)生防疫站