專利名稱：一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)的 一種靈敏特異的測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的酶聯(lián)免疫檢測方法
背景技術(shù)：
近年來，手足口疾病肆虐我國大部分地區(qū)，給人們帶來了巨大的危害。大量的流行 病學(xué)研究表明，腸道病毒71型是引發(fā)手足口病的主要病原體之一。EV71屬于小RNA病毒 科，腸道病毒屬成員。該病毒的感染疾病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起手、足、口腔 等部位的皰疹，個(gè)別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥，具有較高的致 殘和致死率。因此研制安全、有效的EV71疫苗來防控手足口疾病的傳播，具有非常重要的 意義。目前，在市場上還未見有相關(guān)的疫苗，而在研發(fā)的疫苗主要包括甲醛滅活疫苗、類病 毒顆粒(VLP)疫苗和DNA疫苗等，其中又以甲醛滅活疫苗的進(jìn)展最快。在EV71滅活疫苗的研制過程中，均需要進(jìn)行EV71病毒抗原(EV71Ag)的檢測，盡 管EV71病毒能產(chǎn)生細(xì)胞病變(CPE)，能夠通過病毒感染組織培養(yǎng)細(xì)胞檢測來進(jìn)行EV71抗原 含量的測定。但是該方法周期較長，往往需要數(shù)天時(shí)間才能得到結(jié)果，并且由于CPE只能檢 測有感染活性的病毒使得其無法正確檢測出滅活疫苗中的抗原含量，如空泡病毒，失活病 毒等，因此無法在疫苗的生產(chǎn)過程中進(jìn)行有效、即時(shí)、正確的監(jiān)控，從而給EV71滅活疫苗的 生產(chǎn)工藝研發(fā)帶來了 一些不便和瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要克服CPE只能檢測有感染活性的病毒使得其無法正確檢測出 滅活疫苗中的抗原含量狀況(情況)，利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，提供一種特異 性好、靈敏度高、使用方便、檢測快速的腸道病毒71型滅活疫苗抗原的檢測方法，可以應(yīng)用 于腸道病毒71型滅活疫苗生產(chǎn)及質(zhì)量檢定。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案完成一種腸道病毒71型滅活疫苗抗原的檢測方法，其 特征在于經(jīng)過下列步驟A.酶標(biāo)板的預(yù)制A. 1酶標(biāo)板的包被用碳酸鹽緩沖液(pH9. 0)將兔抗EV71血清抗體稀釋至5 20 微克/毫升，按50 100微升/孔的量，加入酶標(biāo)板的空中，放于4°C孵育過夜，用PBS洗液 洗板3 5次；A. 2酶標(biāo)板的封閉用封閉液按200微升/孔的量加入封閉液，37°C孵育1 2小 時(shí)，PBS洗液洗板3 5次，晾干，冰箱4°C保存?zhèn)溆茫籅.按50 100微升/孔的量，在步驟1的預(yù)制酶標(biāo)板的孔中，加入不同稀釋度的 待檢抗原，并設(shè)陰性對照和空白調(diào)零孔，放入濕盒中，放入37°C搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng) 1 2小時(shí)后，PBS洗液洗板3 5次；C.按50 100微升/孔的量，在步驟2. 1的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為
31 800 1 1500的鼠抗EV71病毒單克隆抗體，放入濕盒中，放入37°C搖床，180轉(zhuǎn)/分 鐘震蕩培養(yǎng)1 2小時(shí)，PBS洗液洗板3 5次；D.按50 100微升/孔的量，在步驟2. 2的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為 1 1000 1 2000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體，放入37°C 搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)0. 5 1小時(shí)，PBS洗液洗板3 5次；E.按50 100微升/孔的量，在步驟2. 3的酶標(biāo)板的各孔中，加入OPD顯色液，放 入濕盒中，于37°C保溫10 20分鐘；F.按50 100微升/孔的量，在步驟2. 4的酶標(biāo)板的各孔中，加入終止液，而后置 于酶標(biāo)儀上，在492nm波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值，即得到檢測結(jié)果。根據(jù)檢測的結(jié)果按下列條件進(jìn)行判定域值(Cut off) = 2. 1XN(N為陰性對照平均A值，陰性對照的平均值大于0. 05， 按實(shí)際值計(jì)算；若陰性對照的平均值小于0. 05則按0. 05計(jì)算)，標(biāo)本A值小于Cut off值 為陰性，大于等于Cut off值為陽性。所述A. 1步驟中的兔抗EV71血清抗體按下面的方法制備a、將病毒的濃度稀釋成LogTCID50/ml (感染滴度)為7. 0 8. 0 (即將病毒作 107_° 108_°稀釋，每孔接種1毫升，可使半數(shù)的組織細(xì)胞發(fā)生病變)，吸取1 2毫升的病 毒接種于大耳白兔子，分3 4個(gè)部位皮下注射；b、12 15天后，以同樣的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫；C、在初次注射免疫后的第4 6周采血，處理血清；d、用市售的親和純化柱純化血清中的抗體。所述B步驟中的鼠抗EV71病毒單克隆抗體為市購。所述C步驟中的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)抗體為市購。所述磷酸鹽緩沖液(PBS)、磷酸鹽緩沖液洗液、碳酸鹽緩沖液、OPD顯色液、終止 液、封閉液為常規(guī)用液。所述洗板為用PBS洗液在洗板機(jī)上洗板或者手工洗板。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果采用上述方案，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免 疫球蛋白G抗體作為抗抗體有助于放大顯色信號，提高檢測的靈敏度，通常能檢測到3. 7 4. 3LogTCID50/ml的病毒抗原，并且在對EV71滅活疫苗抗原進(jìn)行檢測時(shí)，由于不需要進(jìn)行 細(xì)胞培養(yǎng)等一系列復(fù)雜費(fèi)時(shí)的工作，從而縮短了檢測時(shí)間，即由通常的數(shù)天縮短為4小時(shí)， 并且采用該方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)時(shí)，具有低背景的優(yōu)點(diǎn)，通常陰性對照孔的A值在小于 0. 08 (空白孔調(diào)零后)。本發(fā)明所建立的檢測方法是一種特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好、簡 單方便的測定EV71病毒滅活疫苗抗原滴度的檢測方法。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和 權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1 兔抗腸道病毒71型病毒血清抗體的制備與純化1)將病毒的濃度稀釋成LogTCID50/ml (感染滴度)為8. 0吸取2毫升的病毒接種 于新西蘭大耳白兔子，分4個(gè)部位皮下注射；
2) 14天后，以同樣的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫；3)在初次注射免疫后的第4周采血；4)分離血清，-200C以下保存待用；5)取市購的Protein A親和抗體純化柱于室溫放置平衡30分鐘，用五倍柱體積 的平衡液(20毫摩爾濃度磷酸鹽緩沖液)對層析柱進(jìn)行平衡，將4)中的血清融化后上樣過 柱，用10倍柱體積的平衡液洗脫雜蛋白，保留目的蛋白，用3個(gè)柱體積的洗脫液(0. 1摩爾 濃度的檸檬酸，PH值為3. 0)將目的蛋白從柱上洗脫下來，收集洗脫液。1)取1摩爾濃度的三羥甲基氨基甲烷(pH值為9. 0)以1 9的比例加入收集的 洗脫液中，中和過多的檸檬酸，用Iowry法測定蛋白含量，-20°C以下保存待用。實(shí)施例2酶標(biāo)板的預(yù)包被1)酶標(biāo)板的包被用碳酸鹽緩沖液(pH9. 0)將兔抗EV71血清抗體稀釋至10微克 /毫升，按100微升/孔的量，加入酶標(biāo)板的空中，放于4°C孵育20小時(shí)以上，PBS洗液洗板 3次；2)酶標(biāo)板的封閉用封閉液按200微升/孔的量加入封閉液，37°C孵育1小時(shí)，PBS 洗液洗板3次，晾干，冰箱4°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例3腸道病毒71型病毒抗原的測定1)先將待檢抗原樣品用PBS稀釋液進(jìn)行不同稀釋度的系列稀釋1 90,1 270、 1 810、1 2430、1 7290、1 14580、1 29160，1 58320 具體稀釋方法如下取 100 微升待檢EV71病毒抗原樣品加入900微升PBS稀釋液，混勻即成1 10樣品；取100微升 1 10樣品加入800微升PBS稀釋液，混勻即成1 90樣品，如此類推稀釋；用微量移液 器將稀釋好的EV71病毒抗原樣品從低稀釋(1 90)開始依次加入預(yù)包被的酶標(biāo)板孔中， 100微升/孔，每個(gè)稀釋樣品加兩孔，同時(shí)在酶標(biāo)板的另外孔中設(shè)立陰性孔2個(gè)，并留2孔作 空白調(diào)零孔，放入37°C搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS洗液洗板4次；2)在上述酶標(biāo)板的各孔中加入稀釋度為1 1000的鼠抗EV71病毒單克隆抗體， 100微升/孔，放入37°C搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1小時(shí)，用PBS洗液洗板4次；3)在上述酶標(biāo)板的各孔中加入稀釋度為1 1500的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗 鼠免疫球蛋白G (IgG)抗體，100微升/孔，放入37°C搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)0. 5小時(shí)， 用PBS洗液洗板5次；4)在上述酶標(biāo)板的各孔中加入OPD顯色液，100微升/孔，放入濕盒中，于37°C保 溫15分鐘；5)在上述酶標(biāo)板的各孔中加入終止液，50微升/孔，置于酶標(biāo)儀在490nm波長下， 用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值，結(jié)果見表1 ；6)判定結(jié)果7)陰性對照孔平均A值0. 0608) Cutoff值=0. 060X2. 1 = 0. 1260，(陰性對照平均A值大于0. 05，按實(shí)際值計(jì)算)。9)按照樣品的A值彡Cutoff值，該樣品判定為陽性樣品；樣品的A值< Cutoff 值，該樣品判為陰性。則本樣品1 90 1 29160稀釋度均為陽性、1 58320為陰性， 因此，該樣品中的EV71病毒抗原滴度價(jià)為1 29160。
所用溶液如下1、包被緩沖液(0. 05M碳酸鹽緩沖液，PH9. 6)碳酸鈉1. 59克，碳酸氫鈉2. 93克， 加蒸餾水至1000毫升。2、磷酸鹽緩沖液(PBS，PH7.4)磷酸二氫鉀0. 2克，磷酸氫二鈉2. 9克，氯化鈉8. 0 克，氯化鉀0. 2克，Tween-200. 5毫升，加蒸餾水至1000毫升。3、PBS洗液1000毫升磷酸鹽緩沖液中，加入0. 5毫升吐溫20。4、封閉液100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混勻。5、OPD顯色液稱取20mg鄰苯二胺，溶于50毫升0. 1摩爾濃度/升pH 5.0的檸 檬酸鈉_磷酸鹽緩沖液，再加入20微升雙氧水，混勻后避光保存。6、終止液(2N硫酸)取濃硫酸10毫升，緩慢加入80毫升水中，冷卻待用。表一、實(shí)施例1的檢測A值 實(shí)施例4本發(fā)明的靈敏度分析以通過細(xì)胞病變法(CPE)檢測得到新鮮的病毒抗原樣品為檢測對象，將其滅活 后，運(yùn)用本發(fā)明進(jìn)行檢測。結(jié)果見表一表一 *靈敏度檢測限換算公式為靈敏度檢測限=CPE檢測結(jié)果-Logltl(滴度)由以上結(jié)果可以看出，運(yùn)用本發(fā)明檢測疫苗樣品中的抗原滴度含量，可以檢測出 相當(dāng)于病毒滴度(LogTCID50/ml)為4. 006士0. 257時(shí)樣品中的抗原滴度含量，具有較好的 靈敏度。實(shí)施例5本發(fā)明的重復(fù)性分析運(yùn)用本方法對同一樣品在不同時(shí)間進(jìn)行檢測，結(jié)果見表二 表二 通過以上結(jié)果可以看出，每次實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV%)小于10%，不同時(shí)間 所得的檢測結(jié)果具有很好的一致性。因此，運(yùn)用本發(fā)明來檢測腸道病毒71型滅活疫苗抗原 滴度具有非常良好的可重復(fù)性。
權(quán)利要求
一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法，其特征在于具有如下步驟A.酶標(biāo)板的預(yù)制A.1酶標(biāo)板的包被用碳酸鹽緩沖液將兔抗EV71血清抗體稀釋至5～20微克/毫升，按50～100微升/孔的量，加入酶標(biāo)板的空中，放于4℃孵育過夜，用磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；A.2酶標(biāo)板的封閉用封閉液按200微升/孔的量加入封閉液，37℃孵育1～2小時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次，晾干，冰箱4℃保存?zhèn)溆茫籅.按50～100微升/孔的量，在步驟1的預(yù)制酶標(biāo)板的孔中，加入不同稀釋度的待檢抗原，并設(shè)陰性對照和空白調(diào)零孔，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時(shí)后，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；C.按50～100微升/孔的量，在步驟2.1的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶800～1∶1500的鼠抗EV71病毒單克隆抗體，放入濕盒中，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)1～2小時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；D.按50～100微升/孔的量，在步驟2.2的酶標(biāo)板的各孔中，加入稀釋度為1∶1000～1∶2000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G抗體，放入37℃搖床，180轉(zhuǎn)/分鐘震蕩培養(yǎng)0.5～1小時(shí)，磷酸鹽緩沖液洗液洗板3～5次；E.按50～100微升/孔的量，在步驟2.3的酶標(biāo)板的各孔中，加入OPD顯色液，放入濕盒中，于37℃保溫10～20分鐘；F.按50～100微升/孔的量，在步驟2.4的酶標(biāo)板的各孔中，加入終止液，而后置于酶標(biāo)儀上，在492納米波長下，用空白孔調(diào)零后檢測吸光度A值，即得到檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于A步 驟所述的兔抗EV71血清抗體經(jīng)過下列方法制備a、將病毒的濃度稀釋成感染滴度LogTCID50/ml為7.0 8. 0，吸取1 2毫升的病毒 接種于大耳白兔子，分3 4個(gè)部位皮下注射；b、12 15天后，以同樣的劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫；c、在初次注射免疫后的第4 6周采血，處理血清；d、用市售的親和純化柱純化血清中的抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于洗板 用磷酸鹽緩沖液洗液在洗板機(jī)上洗板或手工洗板。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度檢測方法，其特征在于磷酸 鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液洗液、碳酸鹽緩沖液、終止液、OPD顯色液、封閉液為常規(guī)用液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的酶聯(lián)免疫檢測方法。該方法，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G抗體作為抗體，有助于放大顯色信號，提高檢測的靈敏度，通常能檢測到病毒滴度為3.7-4.3LogTCID50/ml的病毒抗原，并且在對EV71滅活疫苗抗原進(jìn)行檢測時(shí)，由于不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)等一系列復(fù)雜費(fèi)時(shí)的工作，從而縮短了檢測時(shí)間，由通常的數(shù)天縮短為4小時(shí)，并且采用該方法進(jìn)行酶聯(lián)免疫反應(yīng)時(shí)，具有低背景的優(yōu)點(diǎn)，通常陰性對照孔的A值小于0.08。本發(fā)明所建立的檢測方法是一種特異性好、靈敏度高、重復(fù)性好、簡單方便的測定EV71病毒滅活疫苗抗原滴度的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK101881774SQ201010206469
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者周康鳳, 唐彩華, 姜云水, 朱蓮, 毛子安, 毛江森, 王平, 羅永能, 高麗美, 高孟 申請人:浙江普康生物技術(shù)股份有限公司