病毒試劑的遞送的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種附著有噬菌體的植物材料，其中該噬菌體保持著感染性。該植物材料包括水果、蔬菜、葉、莖、花、根、塊莖、幼苗和種子。可以治療植物病害和動物疾病。一單獨的組合物包含載體以及共價附著其上的噬菌體，載體選自（i）細絲，（ii）平面材料和（iii）顆粒和/或小珠，其中，所述噬菌體保持著感染性，對深部傷口中的治療或預(yù)防細菌感染是有用的。
【專利說明】病毒試劑的遞送
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種以可持續(xù)的有活力狀態(tài)和不同的方式來遞送病毒試劑(如噬菌體或其他病毒)的方法，所述方式適合用于防止和控制微生物感染、定殖和/或污染。還提供了一個作為一種方法的系統(tǒng)，其將適于遞送特定基因/蛋白的經(jīng)遺傳修飾的有活力的病毒進行定位和遞送，以用于治療或免疫。本發(fā)明可用于抵抗微生物/細菌在幾乎任何情況的生長和/或定殖，所述情況中存在或可能發(fā)生微生物/細菌的污染、定殖或感染，以及在所述情況處，保持病毒如噬菌體的抗菌活性是有利的。
【背景技術(shù)】
[0002]如今，普遍接受的是微生物/細菌的污染或感染(infection)是影響許多生物系統(tǒng)和過程中正常生物/生理功能(例如，愈合或生長)和分解速度的主要原因。在傷口愈合過程中，防止傷口感染是傷口護理和修復(fù)的至關(guān)重要方面。因為所有的傷口都容易受到感染，傷口護理最好的實踐是爭取將此納入考慮。通常，清洗傷口來清除可能藏匿有細菌的外來碎屑，而當組織遭受嚴重創(chuàng)傷時，常常是通過縫合來幫助組織的修復(fù)。在重大的外科手術(shù)，如髖關(guān)節(jié)置換中，這涉及多個組織層的修復(fù)，隨后通常可用一種無菌的傷口敷料。無菌的傷口敷料通常是用在皮膚表面，用來幫助清潔和防止感染的。
[0003]盡管有這些預(yù)防措施，但是在受傷過程中，或非故意地，在不同醫(yī)療程序/外科手術(shù)中通過材料的入口可形成感染。而且，傷口感染的問題并不限于深部傷口。尤其對于老年人、糖尿病患者或體弱者，感染可能從相對輕微的損傷轉(zhuǎn)變成慢性傷口，逐漸引起重大的健康問題。
[0004]除了傷口清潔以外，已有采用多種不同方法來嘗試防止深層傷口感染的建立。通常，整體或局部地施用抗生素，或使用強烈的化學(xué)消毒藥品(例如，在牙重建中)來嘗試處理深部傷口，使其擺脫感染細菌。令人遺憾的是，即使采用強烈的抗菌化學(xué)藥品也經(jīng)常不能成功防止感染的建立或復(fù)發(fā)。這在很大程度上是由于消毒試劑不能完全消滅所有的問題細菌。此外，眾所周知的是，現(xiàn)在許多的細菌對抗生素是有抗性的，并且抗生素的效力隨時間推移而被削弱。
[0005]因此，需要更有效的方法來抵抗細菌的感染和污染。一種方法是涉及使用噬菌體(攻擊并消滅細菌的病毒)，并且許多團體已經(jīng)報道過他們成功的應(yīng)用例子。與采用噬菌體作為抵抗感染方法相關(guān)的核心問題是獲得合適的遞送方法，同時要確保噬菌體保持足夠長時間的穩(wěn)定和有活力，以發(fā)揮出它們強大的抗菌效果。
[0006]在許多情況下，液體形式使用時是不現(xiàn)實或不實用的。需要一種遞送的方法，其大體上適用于噬菌體充當殺菌劑的應(yīng)用，并且其在許多情況下，包括傷口護理中具有實用性。由于噬菌體容易退化和脫水，因此理想地，這種方法也應(yīng)該賦予增強的活力(viability)和穩(wěn)定性。
[0007]許多傳統(tǒng)敷料采用一種旨在吸收傷口中過量液體的材料；因為這種液體通常富有營養(yǎng)并且能支持大量細菌的生長。由于外科手術(shù)口或皮膚表面是很少完全沒有細菌的，所以敷料或繃帶材料很快就提供了生長的細菌群體。細菌不僅能造成嚴重的感染，還會釋放有害的毒素引起在傷口處理方面的明顯問題。一種解決方式是為了防止細菌積聚，定期地更換傷口敷料或繃帶，但這并不總是令人滿意的和/或可行的。
[0008]另一種方式是采用一種旨在限制微生物生長的試劑來處理敷料。然而，很多這類試劑一旦接觸到傷口滲出液就會從敷料中濾出，因此限制了敷料的效力，并且活性試劑確實會造成刺激或破壞周圍組織的問題。
[0009]因此，有需要提供抗菌敷料，其中的抗菌試劑不會容易地從敷料中釋放，或者其中試劑的釋放不會對處理的對象造成傷害。
[0010]W003/093462公開了一種用于將病毒，如卩遼菌體固定到一基質(zhì)的方法，從而使病毒仍然保持感染性。
[0011]本發(fā)明的一個目的是為了提供一種將噬菌體引入到被污染區(qū)域和環(huán)境中的方法，使得噬菌體的穩(wěn)定性增強，并保留它們的抗菌活性。這包括被感染的傷口，范圍從表面損傷到深部傷口環(huán)境。
[0012]植物細菌感染能分別導(dǎo)致發(fā)芽率、生長和/或產(chǎn)量的降低。人們希望處理或防止那些感染，但是目前使用的方法冒著對另一影響植物生長的因子產(chǎn)生不利影響的風(fēng)險。
[0013]本發(fā)明的另一個目的是為了對付植物的細菌感染，并根據(jù)本發(fā)明提供經(jīng)過處理的植物材料及其用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]在本發(fā)明的第一個方面中，公開了一種將活病毒如噬菌體提供到期望的位置或其中，例如傷口或傷口中的器械，所述器械定義為一活病毒載體復(fù)合物(LVCC)，其包含附著(attach)在載體基質(zhì)上的活病毒。當有利地，在所述病毒的生物作用能傳遞治療或其他抗菌益處的情況中，可以使用這種LVCC。這通常需要病毒保持它們的生物學(xué)特性，而在噬菌體的例子中，需要保持它們能靶定、感染和破壞細菌細胞的能力。所述病毒可以是靶定造成傷口感染的細菌的噬菌體。在本發(fā)明中，它們附著在載體基質(zhì)材料的表面，使得它們的生物學(xué)特性在感染的或污染的環(huán)境中能保持。
[0015]所述載體表面可由例如，細絲狀材料、平面(片狀)材料(例如是條料(strip))提供，或者由顆粒和/或小珠的表面提供，并且足以使病毒附著和固定，從而保持病毒的活力。
[0016]可單獨或組合地將LVCC提供到深部傷口中或另一相關(guān)的部位，從而使附著的活病毒的有利特性如所需那樣被提供和遞送。載體/基質(zhì)可以是任意材料，病毒能固定在其上面，同時維持活力和保持抗菌特性，以適于用作LVCC。
[0017]本發(fā)明的一種組合物包含載體以及共價附著其上的噬菌體，所述載體選自(i)細絲，(ii)平面材料和(iii)顆粒和/或小珠，其中，所述噬菌體保持著感染性。
[0018]合適地，所述載體是可生物降解和/或生物兼容的。其分別可以是組織兼容的和能原地被吸收的。
[0019]所述組合物的一個用途是治療或防止深部傷口中的細菌感染,深部傷口意味著傷口不是在身體的暴露面上。深部傷口可以是內(nèi)部的傷口，包括體表上手術(shù)縫合線縫合的內(nèi)部損傷。一般地，本發(fā)明的組合物是置于深部傷口中，然后被封閉起來。因此，本發(fā)明的細絲可置于深部傷口，并留在其中。以下本發(fā)明的一實施例中更詳細地描述，與對照相比，將噬菌體附著的細絲置于深部傷口中獲得一愈合很好的傷口。
[0020]有利地，所述組合物的材料是可生物降解和/或生物兼容的材料，或者是由組織兼容性的并能在原位被吸收的聚合物或其他材料制成。降解隨時間推移而發(fā)生，使得附著的病毒(例如，噬菌體)的抗菌作用或其他相關(guān)特性大體上不會受到影響。
[0021]本發(fā)明的一實施例中，LVCC附在不同的外科移植體上，如假體、支架、導(dǎo)管、用于手術(shù)修復(fù)的假膜(membrane)或支架材料，或用于再生目的用作支架或框架的材料、縫合錨、縫合線和其他傷口閉合器械(例如，粘合帶或縫合釘(staples))、分流器、導(dǎo)管、留置套管、管(tube)以及類似的器械及其元件等。它們可附在表面上或納入到支架或支撐材料中，這些材料單獨地或組合地含有多種不可生物降解的聚合物、可生物降解的聚合物、膠原蛋白、角蛋白、纖維素、棉、絲和其他類似的基質(zhì)(參見下面)。
[0022]本發(fā)明描述LVCC的構(gòu)建，其通過將病毒固定到載體基質(zhì)材料的表面，從而保持及延長在有害環(huán)境中的活力和生物學(xué)特性(對于噬菌體，這包括它們的殺菌特性)，有害環(huán)境將迅速使游離病毒(fee virus)變性(denature)。以下列出可單獨或組合或作為混合物或作為共聚合物(co polymers)來使用并適于在LVCC中用作載體基質(zhì)的材料的例子。
[0023]合適的聚合物種類包括生物聚合物、導(dǎo)電聚合物、共聚物、含氟聚合物、多萜、酚醛樹脂、聚酸酐、聚酯、聚烯烴(聚烯屬烴)、橡膠、硅樹脂、硅橡膠、超吸水性聚合物、合成橡膠、乙烯基聚合物、核酸、多肽、糖、聚乳酸(PLA)、聚3-羥基丁酸、無機聚合物、同素聚合物(homo-atomic polymers)、聚硅烷、聚錯燒(polygermanes);聚錫燒(poIystannanes)、雜原子聚合物(hetero-atomic po lymers)、聚三硼三胺(polyborazylenes)、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基氫硅氧烷(PMHS)和聚二苯基硅氧烷；聚硅氨烷如全氫聚硅氮烷PHPS、聚膦腈、聚氮化硫、聚硫化物、超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、常見的塑料、聚丙烯、聚酯(PES)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚乙烯(PE)、高密度聚乙烯、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC) (Saran)、低密度聚乙烯(LDPE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、高抗沖聚苯乙烯(HIPS)、聚酰胺(PA) (Nylons)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚碳酸酯(PC)、聚碳酸酯/丙烯腈丁二烯苯乙烯(PC/ABS)、聚氨酯(PU)、專用的塑料、單體和聚合物(包括可生物降解的/可重吸收的材料)、乙烯甲基丙烯酸酯、三聚氰胺甲醛(MF)、可塑性淀粉材料、酚醛塑料(PF)或(苯酚甲醛)、聚已酸內(nèi)酯(PCL)、聚對二氧環(huán)己酮(PD0或H)S)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酰亞胺(PEI) (Ultem)、聚乙醇酸(PGA)、聚羥基丁酸酯(PHB)、聚乳酸(PLA)的D和L型立體異構(gòu)體、聚乳酸、聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚三亞甲基碳酸酯(TMC)、聚碳酸酯、聚酸酐、聚(酰亞胺酸酐)(poly-(imide anhydrides))和聚正酯。
[0024]其他材料包括脲醛(UF)、磷酸三鈣(TCP)、自然材料、木、陶瓷、巖石、粗砂和石頭；角和角蛋白；骨頭；皮；紙；絲；棉；大麻；玻璃、含鐵和不含鐵的金屬和金屬合金。
[0025]能使用的專門材料包括處理過的纖維素，如纖維或織布(羧甲基化的)、膠原蛋白、透明質(zhì)酸、水解膠體、水凝膠、薄膜、泡沫、藻酸鹽、乙基甲基丙烯酸酯、專門的玻璃(可生物降解的和不可生物降解的)、專門的尼龍、多糖。
[0026]本發(fā)明的另一個實施例中，病毒(例如，曬菌體)可直接固定到包含所述器械的材料的表面。本質(zhì)上，形成所述器械的材料成為LVCC載體材料。例如，將噬菌體固定在外科手術(shù)縫合線上，同時就提供了一具有雙重用途的LVCC，能封閉傷口，同時能遞送有效的抗菌能力。手術(shù)縫合線可以是多種類型的，包括可生物降解的聚合物。
[0027]本發(fā)明的又一個實施例中，LVCC (作為細絲或條料，噬菌體已單獨地或組合地附于其上)可被添加到傷口敷料和/或在其下面，或與有特定優(yōu)勢的其他類型敷料或器械結(jié)合使用，但是，作為同時使用LVCC的結(jié)果，那會獲得增強的抗菌功能。
[0028]本發(fā)明的進一步實施例涉及將LVCC納入作為傷口敷料的一部分。這可以是單獨的(LVCC)組分，該組分被設(shè)計成敷料的一整體部分，或與其不同，被引入敷料中和/或敷料下面，以提供抗菌功能?；蛘撸鲚d體材料可以是敷料的一部分?？梢圆捎貌煌姆绞絹碓O(shè)計LVCC或載體材料，如下所描述的，但其不解釋為限制。
[0029]本發(fā)明的一特別的傷口敷料包含多種細絲，噬菌體附著其上，其中存在至少第一細絲和第二細絲，第一噬菌體附著于第一細絲，并且第二噬菌體附著于第二細絲，以及其中所述第一和第二噬菌體感染不同株或種的細菌。
[0030]所述第一和第二細絲可以是不同的顏色。這為敷料提供了顏色編碼。因此，在使用中，通過給予的敷料，顏色可以用來識別可治療或可防止的疾病，所述顏色始終地顯示由附在細絲或敷料的部分上的噬菌體展示的細菌特異性。在一具體實施例中，一種顏色的細絲具有感染附著的金黃色葡萄球菌(s.aureus)的噬菌體，而第二種顏色的細絲具有感染附著的艱難梭菌(C.difficile)的噬菌體。
[0031]一般地，傷口敷料或繃帶包含提供傷口保護和/或吸收傷口液體的敷料層，以及一傷口接觸面，其至少一部分可包含 固定其上的病毒。
[0032]所述接觸面可以是所述敷料層的一部分，或可以是另一組分的一部分，如包圍或覆蓋第一材料的覆蓋物的一部分。在一個實施例中，所述接觸面可以是有滲透性的，使得液體能夠通過并進入所述敷料層。雖然可能不是直接的接觸，但傷口的接觸面通常是與待處理的傷口接觸的材料的一部分。因此，例如，在傷口和其上固定有病毒的接觸面之間可以進一步放置有滲透性的基質(zhì)。如此，可能包含任何微生物媒介(microbial agent)的傷口液體可以滲透到有滲透性的基質(zhì)，并與接觸面上存在的固定的病毒接觸。
[0033]事實上，所述接觸面可將LVCC納入作為一個組分，LVCC被設(shè)計成插入到敷料內(nèi)形成的袋子等諸如此類中。如此，可以提供包含不同的固定病毒的不同插入物，并且根據(jù)待處理的傷口類型，可以選擇理想的插入物并放置在敷料中。事實上，可檢測傷口以查明哪種類型的微生物媒介存在，并且合適地選擇插入物來靶定這些微生物。或者，可以采用包含能提供廣譜性殺菌作用的多種噬菌體的LVCC。
[0034]在一個實施例中，一傷口敷料可包含三種組分:將敷料附著在皮膚上的外包層，例如通過繃帶或粘合劑；一敷料中間層，其起抵抗敲擊和磨損的緩沖作用，并且也能提供幫助愈合過程的功能一一個例子可以是有吸收能力的軟麻布(lint)，已多年被用于基礎(chǔ)敷料形式的材料；以及一形成接觸面的內(nèi)膜，其是接觸傷口的。例如，這可包含一合成的聚合物，其編織成薄片或網(wǎng)，并且可能被一基質(zhì)包覆，以確保敷料可以輕易清除。
[0035]在納入噬菌體的敷料的一個簡單例子中，噬菌體可附在內(nèi)層(所述接觸面)的表面上，或該內(nèi)層作為LVCC引入，不同于敷料，但其被用于與傷口接觸。常規(guī)定位可用作將噬菌體放置到細菌性傷口感染所在/可能建立的區(qū)域中，并且優(yōu)化初始感染性噬菌體事件發(fā)生的可能性，從而啟動一直擴大的滅菌循環(huán)。[0036]在一個實施例中，敷料或LVCC可被設(shè)計成有活性抵抗單種類型的細菌，因此就涉及有活性抵抗單種類型細菌的噬菌體(或多噬菌體)的固定。
[0037]另一個實施例可涉及橫跨整個接觸表面區(qū)域的噬菌體固定。然而，在某些情況下，這證實是不必要的，或?qū)τ诠潭ɑ蛏a(chǎn)不是最經(jīng)濟的方法?？赡芸梢允瞧渌男问?。例如，噬菌體可以僅僅附在接觸面的限定區(qū)域。這可通過僅活化部分表面，以及允許噬菌體進入整個表面但僅在活化區(qū)域發(fā)生固定的附著過程來實現(xiàn)?；蛘?，噬菌體可采用打印技術(shù)的形式，僅直接進入活化的區(qū)域。這可能需要一種安排(與上面的相反)，其中，噬菌體在附著過程之前活化，然后，被“打印”到合適的表面上?；蛘?，噬菌體和表面可同時活化，或當敷料攜帶多種噬菌體時，在不同時期活化——為生產(chǎn)攜帶多種類型噬菌體的敷料提供替代的方法。
[0038]以上的所有情況可能會涉及盛裝在合適緩沖液中的病毒/噬菌體，該緩沖液可包含或不包含用于產(chǎn)品識別的染料，或作為指示劑的染料，為敷料到期更換與否提供信號。或者，作為指示劑的染料可單獨用作標記，或用于區(qū)分病毒/噬菌體附著的具體區(qū)域。染料也可形成一連接物，以將病毒/噬菌體附著到某些表面。
[0039]此外，可將病毒/噬菌體附著到特定區(qū)域，并以不同的式樣(pattern)應(yīng)用，這樣來降低生產(chǎn)中要求的病毒/噬菌體數(shù)量。再者，可在LVCC或敷料識別中采用式樣和/或顏色標記。進一步地，可根據(jù)病毒/噬菌體的類型將病毒/噬菌體附著到預(yù)先染色的區(qū)域。或者將它們附著到?jīng)]有顏色的區(qū)域。
[0040]在上述情況的一個變形中，病毒/噬菌體可附著在敷料的外圍來阻止后來的微生物進入，或可在外圍使用傳統(tǒng)的抗菌劑(消毒劑或抗生素)。像這樣，噬菌體可單獨或與抗菌化合物(消毒劑、抗生素或其他)和/ 或酶一起應(yīng)用到敷料或LVCC，為了特定的目的也可固定抗菌化合物和/或酶，以增強附著的噬菌體的效果、促進它們的作用，例如通過移除生物膜，或連同曬菌體一起應(yīng)用來提供抗菌屏障。這樣，敷料和LVCC可包含多于一種類型的抗菌試劑，以及可包含聯(lián)合多種其他傳統(tǒng)抗菌化學(xué)劑或酶的試劑的多種病毒/曬菌體。事實上，這些組合可協(xié)同發(fā)揮作用。
[0041]一個供替代的選擇涉及將噬菌體附著到如上所描述的LVCC纖維或線股(strands)，纖維或線股可以被染色(也是如上所描述)，并且能附著到表面，或交錯編織到表面中，或兩者兼具。纖維可以不同的式樣編織或附著來表示敷料或LVCC的類型。噬菌體可在纖維納入到活化/接觸面上/中之前/之后附著。此外，LVCC纖維可根據(jù)采用的噬菌體來染色，或替換地，不染色，但編織到敷料接觸面的顏色打印區(qū)域中或敷料的其他區(qū)域中。
[0042]或者，纖維狀的LVCC可包含兩種或多種線股，染色或不染色，且使病毒/噬菌體附著到一種線股或兩種線股上(如下面對多種噬菌體敷料的選擇所描述)，并附著到敷料中，又或許完全整合到敷料中。
[0043]另一種選擇是，通過根據(jù)上面方法中的任一種，將病毒/噬菌體附著到中間敷料層來納入到敷料中，以便它們通過與傷口相鄰布置的有滲透性的或網(wǎng)狀的膜來接近靶標微生物。
[0044]另一實施例可涉及LVCC的納入，LVCC包含附著在由不同屏障基質(zhì)組成的顆粒和/或小珠上的噬菌體。這可通過直接附著在顆粒/小珠上，或固定在薄片或平面上來實現(xiàn)，所述薄片或平面能精細地劃分以形成許多小的顆粒，或細的條料。顆?？梢酝ㄟ^霧化劑或噴霧器來給予，并且也可噴涂或打印在任意敷料或LVCC上，或直接噴涂或打印在需要的區(qū)域上/中。
[0045]此外，噬菌體可通過一個兩階段活化過程來附著在不同的表面，其中，噬菌體被固定到細絲、顆粒或小珠來產(chǎn)生LVCC。在第二步中，該LVCC本身被固定/附著到器械(如前所描述的那些)的表面。或者，噬菌體能固定其上的材料不可逆轉(zhuǎn)地結(jié)合到器械(例如，假體)，然后進行第二活化步驟，將噬菌體固定到載體基質(zhì)，所述載體基質(zhì)結(jié)合到器械。
[0046]LVCC或敷料的結(jié)構(gòu)有活性抵抗多種微生物/細菌是可能的。一種方法是涉及利用包含多種不同曬菌體類型的異類混合物(heterogeneous mixture),這被用作一團曬菌體源，用于固定在整個接觸面上，或如上所描述的固定在特定位置。
[0047]一個替代的方法是涉及單獨保存在不同勻質(zhì)溶液中的特定噬菌體，將它們活化并且并行地分布——雙(或多)噴射打印的一種類型。根據(jù)這個實施例，在病毒/噬菌體移動通過打印噴射口前或同時，它們被活化并做好用于固定的準備。
[0048]另一個實施例涉及通過多個表面活化步驟，以確定的順序?qū)⑻囟ǖ氖删w類型固定到LVCC或敷料的接觸面上。這個方法利用在起始固定過程后仍然保留的那些結(jié)合位點，以使得連續(xù)的活化和附著步驟不會影響先前固定了的噬菌體。
[0049]或者，根據(jù)需要治療的類型，通過特定區(qū)域的連續(xù)激活，噬菌體可單獨地或組合地附著在敷料接觸面的特定區(qū)域。這些區(qū)域可以用顏色編碼。
[0050]此外，特定的病毒/噬菌體可附著在由單獨的纖維或細條料組成的LVCC上，并附著到或編織到敷料表面中，或附著到其他器械上，如上所描述。纖維可具有已經(jīng)固定其上的病毒/噬菌體，或一旦被納入就被活化以接收病毒/噬菌體，或簡單地接收活化了的噬菌體。
[0051]根據(jù)病毒/噬菌體的類型，可將纖維以顏色編碼，然后扭成由兩條或多條細絲(類似理發(fā)店的旋轉(zhuǎn)立柱)的線股，然后將線股編織或附著(或兩者兼具)到敷料或接觸面。此外，可以加入(附著、編織或打印)著色了的指示劑條料，這樣隨時間推移，顏色的變化提示更換敷料的最佳時機。
[0052]如果不納入纖維或條料，以上全部可通過納入或附著到平面LVCC材料的敷料表面的“補丁”(以不同的形狀)達到，該“補丁”可具有附著的或處于可附著的適當位置的病毒/噬菌體，以及其本身可由交錯編織的纖維組成，或者這兩者的組合。
[0053]接觸面、纖維或條料可包含指示劑，如顏色標記等，從而使使用者了解附著的病毒類型和/或幫助使用者正確定位LVCC或敷料。
[0054]可以修飾固定了的病毒本身，使得它們能表達以標記蛋白，如綠色熒光蛋白或類似的，這樣，當微生物被病毒侵染時，標記基因?qū)磉_，并且產(chǎn)生標記蛋白。繼而可以檢測到，并使醫(yī)生注意到傷口中存在微生物的事實。然后，醫(yī)生可以在適當?shù)臅r候更換敷料，以便在污染的位置保留活性的噬菌體群，并且持續(xù)這樣做，直到觀察到顏色沒有改變，就表示傷口是沒有微生物了。為了方便這一過程，該敷料優(yōu)選地是透明的或部分透明的，這樣就可以觀察到傷口表面的染色。
[0055] 傷口可以是內(nèi)部的傷口，或涉及多個組織層的傷口，或處于皮膚層內(nèi)的傷口，或?qū)ο笃つw表面的傷口。已知許多類型的傷口，包括由創(chuàng)傷、手術(shù)、燒傷、割傷、擦傷、潰瘍、壓瘡引起的那些傷口，以及由糖尿病、血液循環(huán)不良等引起的其他損傷。該術(shù)語也廣泛地被用于包含其他應(yīng)用，在所述其他應(yīng)用中可能希望用于吸收體液并防止任何嚴重的細菌感染發(fā)生；一種這類應(yīng)用可以是在婦女的衛(wèi)生產(chǎn)品中，例如，衛(wèi)生棉條，用于吸收月經(jīng)并同時防止中毒性休克綜合癥或?qū)⑵浒l(fā)展減低。也可包括實際的手術(shù)部位，因此，固定的噬菌體會將抗菌特性傳遞到通常放置在手術(shù)區(qū)域中的吸收材料，以吸收過量的液體，或傳遞到阻隔材料，如一次性產(chǎn)品。
[0056]所述對象可以是任何動物對象，如家畜或農(nóng)畜，但特別地，可以是人。
[0057]本發(fā)明的一個實施例是提供一種吸收性醫(yī)療或衛(wèi)生產(chǎn)品，其包含吸收性材料，固定的病毒附著到吸收性材料上，或附著在吸收性材料內(nèi)，或附著到吸收性材料的可滲透表面覆蓋物的至少一部分。這類產(chǎn)品包括衛(wèi)生巾和衛(wèi)生棉條、尿布、海綿、衛(wèi)生濕巾等。上面和別處描述的吸收性材料可以是天然或合成的產(chǎn)品，其包含纖維素或棉、凝膠聚合物、羧甲基纖維素或任何其他合適的材料。
[0058]在另一個實施例中，LVCC可用于幫助易被微生物降解的材料和產(chǎn)品的儲存、包裝和運輸。這可通過包含在媒介物中，或包裝中，或幫助來改善材料和產(chǎn)品的儲存。這類材料可包括器官和其他組織，或被用于移植的材料。一個例子是角膜移植，在使用前，角膜被儲存和運輸，其容易受微生物污染和降解，致使該組織無法使用。
[0059]在另一個實施例中，將LVCC應(yīng)用到廣泛的植物材料上，包括水果、蔬菜、葉、莖、花、根、塊莖、幼苗和將用來食用或作為儲存的種子儲備(seed stock)的種子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，噬菌體被直接固定到種子的表面，這樣，種子仍然有活力，同時其表面實際上變成所述LVCC的載體組分，如此提供了對抗在儲存、發(fā)芽、收獲和運輸銷售過程中發(fā)生的細菌性植物疾病的方法。
[0060]因此，本發(fā)明提供了一種附著有噬菌體的植物材料，其中該噬菌體保持著感染性。
[0061]可以附著感染不同細菌的多種噬菌體，給予更廣譜性的活性。
[0062]合適的植物材料包括水果、蔬菜、葉、莖、花、根、塊莖、幼苗和種子。食用的種子，例如，動物或鳥吃的種子是一個例子。種子儲備，例如，播撒前儲存的種子是另一個例子。
[0063]本發(fā)明的植物材料可用于預(yù)防或治療植物病害，或吃這些植物材料的動物的疾病，例如在胃腸道中的細菌感染。
[0064]本發(fā)明組合物的一個例子是包含本發(fā)明植物材料特別是種子的動物食物或鳥食。這些食物可以是塊狀的或小球狀的，包含或由本發(fā)明的種子制成。這些食物可以是塊狀的或小球狀的，隨后經(jīng)處理以附上噬菌體，例如，通過用噬菌體共價附著的顆粒的水性制劑來處理食物，然后通常將食物干燥來使顆粒附著。或者，將干燥的顆粒制劑與食物混合。
[0065]一般地，可將噬菌體間接附著到植物材料，例如，附著到一顆?；蚨囝w粒，顆粒提供遞送噬菌體的方法，如抵抗植物病害。例如，附著有噬菌體的顆粒的溶液可以噴灑到植物材料上，并讓其干燥，從而讓它們粘在植物材料上。在下面的一個例子中，這類顆粒通過這種方法附到馬鈴薯塊莖上。噬菌體保留活力，并且有效地防止塊莖的病害。
[0066]因此，本發(fā)明包括這樣的方法，該方法包括將噬菌體共價附著的顆粒的水性制劑與植物材料混合，并將混合物干燥，使得顆粒附著到所述植物材料上?；蛘?，將干燥的顆粒制劑與植物材料混合，例如，將其撒到植物材料上。
[0067]下面更詳細地描述本發(fā)明的一個具體實施例，將噬菌體共價附著到西紅柿種子上。在單獨實施例中的測試證實了，以這種方式將噬菌體附著在纖維素(例如，在西紅柿種子表面上找到的)上仍然保持噬菌體的活力。使用西紅柿種子充當一個例子。使用其他種子能得到類似的結(jié)果，從小的(煙草)到大的(玉米)種子。化學(xué)和電暈(corona)激活種子導(dǎo)致種皮表面的瞬時改變，其中種皮包含與纖維素或果膠相關(guān)的聚合物，具有可變量的蛋白質(zhì)和脂肪酸。當暴露到電暈場時，所有這些材料會產(chǎn)生多種活性自由基，它們會與噬菌體的蛋白質(zhì)衣殼或其他實體反應(yīng)，并使這些材料腐壞(decay)以在幾秒內(nèi)賦予穩(wěn)定的共價鍵。結(jié)果顯示，電暈激活是一種表面現(xiàn)象，而如通過發(fā)芽進行測試的，種子的活力沒有受到不利的影響——事實上，與沒有經(jīng)電暈處理的相比，發(fā)芽得到改善。[0068]當其他植物材料(例如，葉、莖、花、根)在電暈場中處理時，看到類似的效果；激活和反應(yīng)發(fā)生在表皮的表面，并且使得噬菌體附著；對植物的損傷僅會發(fā)生在植物材料的尖端和電暈電極之間發(fā)生放電時。因此，植物材料能直接附著噬菌體，例如，共價地附著。植物材料還能與共價附著有噬菌體的顆粒聯(lián)合在一起，或混合在一起。攜帶噬菌體的顆粒能干燥到植物材料上。不然，該顆?？梢耘c植物材料聯(lián)合在一起。
[0069]本發(fā)明進一步的具體實施例中，用固定的噬菌體來處理馬鈴薯塊莖。詳細地，將噬菌體附著在纖維素顆粒的表面，并通過向塊莖噴灑顆粒的溶液，并隨后干燥塊莖——為了確保顆粒粘附，將它們固定在馬鈴薯的表面。意外地，馬鈴薯植物的生長在這樣的處理后得到改善:感染發(fā)生率降低，并且經(jīng)處理的植物的生長明顯更好。
[0070]在一實施例中，基于種子形式的LVCC可用于遞送噬菌體，以治療容易受細菌感染，如那些容易受到胃腸道感染的吃種子的動物。類似地，LVCC可應(yīng)用到其他食物素材，以治療消化疾病和其他疾病?；蛘?，用LVCC代替粗砂，并用于治療鳥類的疾病(aviandisease)。以這種方式，抵抗細菌性病原體的噬菌體能施用到腸中，以治療動物的細菌性疾病。
[0071]也可直腸給藥LVCC來遞送，以對下消化道進行抗菌治療。
[0072]在另一個實施例中，LVCC可通過注射到需要的循環(huán)系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)或直接注射到腦脊髓液中或其他體腔或器官中，實現(xiàn)動物的系統(tǒng)性噬菌體治療，例如，提供抗菌作用?；蛘撸琇VCC可允許通過吸入來遞送噬菌體或其他病毒，從而抵抗呼吸道的感染。
[0073]固定被理解為與特定的物理固定相關(guān)，例如，通過任何化學(xué)鍵(共價鍵、離子鍵、氫鍵或范德華力)，并且因此與病毒對基質(zhì)的任何被動的凸起相區(qū)別。此外，固定是這樣的，其能保持病毒感染一細胞或多細胞的能力。因此，固定可通過病毒的頭部或衣殼蛋白，或確實的病毒任何其他表面蛋白發(fā)生，假如病毒依然能感染期望的靶標細胞。更優(yōu)選地，噬菌體/病毒通過它們的頭基或核衣殼固定到基質(zhì)，這通過在加入和偶聯(lián)噬菌體/病毒之前激活基質(zhì)來完成。共價附著是附著的優(yōu)選方式。
[0074]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“病毒”包括雙鏈或單鏈的RNA或DNA病毒，包括感染細菌的那些病毒，并且通常稱為噬菌體。在優(yōu)選的實施例中，所述病毒為噬菌體。
[0075]本領(lǐng)域已知許多不同類型的噬菌體/病毒，并且根據(jù)所要解決的細菌問題，可以選擇合適的噬菌體/病毒。例如，對于傷口處理，臨床醫(yī)生可能知道一般類型的細菌/原生動物/真菌，它們可能感染特定的傷口，而傷口敷料可包含一種或多種不同類型的被設(shè)計用于感染的噬菌體/病毒，并且因此將感染特定傷口的細菌/原生動物/真菌的生長減到最低。[0076]潛在的傷口病原體的例子包括鏈球菌(Streptococci )，例如釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)；腸球菌(enterococci),如幾腸球菌(Enterococcusfaecalis);葡萄球菌(staphylococci),如金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),特別是抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA);綠膿假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa);腸桿菌各種(Enterobacter species);大腸桿菌(Escherichia coli );克雷白氏桿菌各種(Klebsiella species);變形桿菌各種(Proteus species);擬桿菌(Bacteroides);梭狀芽胞桿菌(Clostridium);酵母,例如念珠菌(Candida);以及曲霉菌。 [0077]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“載體/基質(zhì)”被理解為病毒可固定的任何固態(tài)材料。例如，所述載體可以是這樣的材料，其有利地被激活以允許，例如病毒(如復(fù)合噬菌體(complexbacteriophage))的頭基特異性結(jié)合。所述基質(zhì)可以采用多種形式，例如，尼龍和任何其他類似的聚合物、具有活性基團如氨基或羧基表面基團的聚合物、纖維素或其他含羥基的聚合物、聚苯乙烯或其他類似的聚合物?；|(zhì)也可包括聚合物作為長鏈高分子，其由多個共價鍵結(jié)合的單體子單元組成，并由單種重復(fù)單體或多種單體類型的組合組成。通常，它們包括天然的、合成的或生物合成的生物可降解/生物可重吸收的材料，其為單體形式或聚合形式，單獨地或組合在一起或作為共聚物，例如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)對映體及聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚對二氧環(huán)己酮(PD0)、聚三亞甲基碳酸酯(TMC)、聚醚醚酮(PEEK)以及它們的混合物和復(fù)合物?；|(zhì)也可包括塑料或其他前述的聚合物或小珠或顆粒，它們可以是磁性的或包含生物材料，例如藻酸鹽、玻璃或玻璃纖維、不銹鋼、硅樹脂、絲、膠原蛋白或陶瓷材料。更優(yōu)選地，所述基質(zhì)由治療或治療支持中，在醫(yī)療器械中常規(guī)使用的材料制備。例如，常規(guī)用作縫合線的材料，以及還有用于敷貼開放性傷口的軟麻布或紗布材料。在某些實施例中，所述基質(zhì)可以是生物可降解的/生物可重吸收的，并且因此當與體液接觸放置時，可在體內(nèi)隨時間降解和被重吸收。例如，敷料層可由凝膠材料制成，其中，附著有所述病毒，其也可用來吸收來自傷口的液體，并且使這些液體與固定的病毒相接觸。
[0078]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“激活的/激活/活化”理解為基質(zhì)和/或病毒通過與多種化學(xué)基團(留下的表面化學(xué)性質(zhì)能結(jié)合病毒，例如噬菌體頭部或衣殼表面蛋白或基團)反應(yīng)進行的活化?；蛘撸ㄟ^電活化或其他放電、電場或電場效應(yīng)如等離子體、微波、光電效應(yīng)、射頻場效應(yīng)、伽馬和其他能源輻射等實現(xiàn)固定化。這可應(yīng)用到載體基質(zhì)或病毒或基質(zhì)和病毒兩者。
[0079]基質(zhì)的活化也可這樣來實現(xiàn)，例如，用酸來初步水解，優(yōu)選鹽酸，然后用水和堿的清洗步驟來去除酸。優(yōu)選地，所述堿為碳酸氫鈉。病毒，如噬菌體通過它們頭基的結(jié)合是重要的。在復(fù)合噬菌體的情況下，例如，通過頭基的結(jié)合留下尾基，這對于細菌特異性識別來說是必須的，使得可以自由感染，即結(jié)合并穿透宿主細菌細胞。應(yīng)當理解的是，這種感染宿主細胞的機制與除了僅感染細菌并在其中繁殖的病毒以外的許多其他病毒相似。多種病毒，例如不同菌株特異性的噬菌體，在任何一個時間可固定到基質(zhì)。
[0080]病毒偶聯(lián)到基質(zhì)是化學(xué)鍵形成的結(jié)果，例如在病毒衣殼蛋白和基質(zhì)之間例如通過肽上的氨基形成的共價鍵，例如肽鍵。協(xié)助這一過程的“偶聯(lián)劑”可以不同，取決于使用的基質(zhì)。例如，為了通過氨基或羧基表面基團偶聯(lián)到基質(zhì)尼龍或其他聚合物，可以使用偶聯(lián)劑碳二亞胺或戊二醛。[0081]為了偶聯(lián)到基質(zhì)纖維素或其他含羥基的聚合物，可以使用偶聯(lián)劑磺?；蚁┗阴?vinylsulfonylethylene ether)或三嗪。
[0082]將病毒偶聯(lián)到基質(zhì)聚乙烯或其他類似聚合物或許多其他聚合物類型的偶聯(lián)手段包括電暈放電或高錳酸鹽氧化。
[0083]已經(jīng)證明，使用電暈放電技術(shù)是可能將病毒固定到范圍廣泛的基質(zhì)，這樣在使游離病毒變性的環(huán)境條件下，可以使病毒抗菌活性保持的時間延長。此處以上給出一廣泛的列舉，并且包括這些基質(zhì):尼龍和相關(guān)的聚合物、滌綸、聚苯乙烯、塑料和相關(guān)的聚合物、天然和合成的橡膠、可生物吸收/可生物重吸收的單體、聚合物和共聚物，單獨地或組合地或作為共聚物地，例如，聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)對映體和聚-D-L-乳酸和聚乙醇酸的共聚物(PDLLA-co-PGA)、聚對二氧環(huán)己酮(PD0)、聚三亞甲基碳酸酯(TMC)、聚醚醚酮(PEEK)以及它們的混合物和復(fù)合物，硅、陶瓷、玻璃和玻璃纖維、金屬包括不銹鋼、鋁和金屬合金，膠原蛋白、角蛋白、丙烯酸和各種不同的覆層(coatings)、骨、絲、纖維素-包括紙、棉、軟麻布、膠帶和紗布，人造纖維絲、天然或合成的海綿、藻酸鹽、透明質(zhì)酸、凝膠表面-例如水凝膠。
[0084]一般來說，將噬菌體偶聯(lián)到基質(zhì)的偶聯(lián)劑包括:S_乙酰巰基丁二酸酐；S_乙酰巰基乙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；己二酸二酰肼；4_疊氮苯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯；N- (5-疊氮基-2-氧硝基芐基)琥珀酰亞胺；6- (4-疊氮基-2-硝基苯基氨基)己酸N-羥基丁二酰亞胺酯；4_疊氮苯甲酰甲基溴(p-Azidophenacyl bromide) ；4~疊氮水楊酸N-羥基丁二酰亞胺酯；溴乙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；1，4- 丁二醇二縮水甘油醚；2_重氮基-3，3，3-三氟丙酸對-硝基苯酯；丙二酰亞胺二乙酯；4，4’ - 二異硫氰酰-2，2’ -基二磺酸；己二亞氨二甲酯(Dimethyl adipimidate) ；3, 3’ - 二硫代雙丙亞氨酸二甲酯；庚二亞氨酸二甲酯；辛二亞氨酸二甲酯；4’4-疊氮基苯基二硫醚(4，4’ -Dithiobisphenylazide) ;二硫代雙(丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯)；乙二醇雙(丁二酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)；4-氟-5-硝基疊氮苯；對-甲?；郊姿酦-羥基丁二酰亞胺酯；戊二醛；2_亞氨基硫烷；6-(碘代乙酰胺)己酸N-羥基丁二酰亞胺酯；碘乙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；3_馬來酰亞胺乙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；3_馬來`酰亞胺苯甲酸N-羥基丁二酰亞胺酯；4_ (N-馬來酰亞胺)二苯甲酮馬來酰亞胺丁酸N-羥基丁二酰亞胺酯；s-馬來酰亞胺己酸N-羥基丁二酰亞胺酯；4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烯甲酸N-羥基丁二酰亞胺酯；4_ (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烯甲酸3-磺基-N-羥基丁二酰亞胺酯；馬來酰亞胺丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；N, N’-雙(3-馬來酰亞胺丙?；?-2-羥基-1，3-丙二酰胺；1，4-亞苯基二異硫氰酸酯；N，N’(鄰-苯基)雙馬來酰亞胺；聚乙二醇雙(縮水甘油醚)；雙(聚乙二醇雙(縮水甘油醚))；聚乙二醇雙(咪唑基羰基)I ;雙(聚乙二醇雙[咪唑基羰基]);聚乙二醇雙((對-硝基苯基)碳酸酯)；3- (2-吡啶基二硫代)丙酸N-羥基丁二酰亞胺酯；辛二酸雙(N-羥基丁二酰亞胺)酯；丁二酸馬來酰亞胺乙基-N-羥基丁二酰亞胺酯；1，5- 二(琥珀酰亞胺基氧羰基氧基)戊烷；:(N-琥珀酰亞胺基)碳酸酯。
[0085]有利地，當病毒固定到載體基質(zhì)時，所述固定可提供穩(wěn)定性。例如，以這種方式，所述固定的病毒被穩(wěn)定住，其能保持其活力和感染性，甚至當與試劑如蛋白酶接觸時也能保持，蛋白酶可以另外的方式迅速地使病毒失活。類似地，當暴露到物理壓力，如可使病毒失活的脫水、溫度或PH時也是。【專利附圖】

【附圖說明】
[0086]現(xiàn)在，將通過實施例和附圖的方式對本發(fā)明進一步描述，其中:
[0087]圖1顯示了一 LVCC (作為一種或多種細絲或條料，噬菌體已單獨地或組合地附著其上)添加其中的傷口敷料的示意圖；
[0088]圖2a和2b顯不了納入有LVCC的敷料的不意圖；
[0089]圖3顯示了以可識別式樣方式的攜帶多種噬菌體的敷料的示意圖；
[0090]圖4a顯示了具有深部傷口的動物的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，在術(shù)后7天，該傷口用70 μ I懸浮在5%豬胃粘蛋白中的lX105cfu/ml E15感染，采用正常或噬菌體處理的LVCC ；
[0091]圖4b顯示了具有深部傷口的動物的細菌接種量，在術(shù)后7天，該傷口用70μ I懸浮在5%豬胃粘蛋白中的lX105cfu/ml E15感染，采用正?；蚴删w處理的LVCC ；
[0092]圖5顯示了 MRSA的清除，其通過固定在插入大鼠受感染傷口 14天后回收的手合線上的噬菌體來清除；
[0093]圖6a顯示了通過LVCC抵抗干燥帶來的穩(wěn)定性；
[0094]圖6b顯示了通過LVCC抵抗紫外輻射帶來的穩(wěn)定性；
[0095]圖6c顯示了通過LVCC抵抗溫度帶來的穩(wěn)定性；
[0096]圖7顯示了土壤中固定的噬菌體的存活；
[0097]圖8顯示了將具有兩種噬菌體的LVCC暴露到兩種細菌，其中每種細菌對噬菌體中的一種敏感；
[0098]圖9顯示了受感染的對照傷口位置在第14天的側(cè)面外部視圖；
[0099]圖10顯示了受感染的對照傷口位置在第14天的背面內(nèi)部視圖；
[0100]圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明采用細絲處理的傷口位置在第14天的側(cè)面外部視圖；
[0101]圖12顯示了圖11的位置的背面內(nèi)部視圖，顯示出棘突旁的肌肉中在第14天腫脹降低以及膿水減少；
[0102]圖13顯示了發(fā)芽的西紅柿種子(對照)；
[0103]圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明，噬菌體固定在種子表面上的發(fā)芽的西紅柿種子；
[0104]圖15顯示了用電暈放電處理(但沒有經(jīng)噬菌體處理)的發(fā)芽的西紅柿種子；
[0105]圖16顯示了用游離噬菌體處理的發(fā)芽的西紅柿種子；以及
[0106]圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明，纖維素顆粒周圍細菌的清除。
【具體實施方式】
[0107]實施例1-LVCC遞送噬菌體以抵抗深部傷口感染的效率。
[0108]圖1示意性地顯示了通過敷料(2)將本發(fā)明LVCC (I)壓到組織(3)中的傷口(4)上。
[0109]圖2a是納入了LVCC的本發(fā)明倒轉(zhuǎn)的敷料，顯示其橫截面。袋子(5)封裝著粘附到敷料(7)的LVCC (6)，其具有敷料頂面(8)-因此，其在圖中是倒轉(zhuǎn)的。
[0110]圖2b示意性顯示了編織到敷料(10)中的LVCC (9)。兩種細絲(9a和9b)是不同的顏色，并且附著有不同的噬菌體 。圖3顯示了敷料(11)的進一步示意圖，其中納入了附有噬菌體的細絲(12)。[0111]在第一個實施例中，采用體內(nèi)模型證明了 LVCC遞送噬菌體的效率，用來抵抗在受感染的深部傷口環(huán)境中的細菌感染。滲透到多個組織層的深部傷口被抗甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MRSA) (E15)感染所有的層,采用包含對抗感染的MRSA菌株的噬菌體的LVCC來處理該傷口。
[0112]將噬菌體固定到合成的尼龍聚合物細絲，其與傷口封閉用縫合線生產(chǎn)中使用的類似。使用LVCC作為縫合線，在多個層上封閉感染的傷口。該絲狀LVCC的表面固定有抗-MRSA噬菌體(待測原型(prototype) LVCC),或者不具有(對照)。
[0113]在所有用LVCC處理的對象中，感染得到控制和減少(如視覺上以及通過細菌計數(shù)證明的)(見圖4a和4b)，伴隨正常的傷口愈合過程。與之相比，MRSA在對照對象中生長的過程沒有進行抑制，結(jié)果導(dǎo)致了發(fā)炎化膿的傷口不能痊愈。 [0114]該結(jié)果顯示，采用LVCC，噬菌體能在體內(nèi)模型中較長時間地遞送一有效的抗菌效果——見表1A和IB。
[0115]實施例2—延長的穩(wěn)定性
[0116]清洗從受感染的對象中回收的LVCC，并保存在4°C，并且定期地評估其在體外持續(xù)抵抗MRSA生長的抗菌活性。
[0117]在一系列的試驗中，通過將LVCC放置在一細菌菌苔中，證明了其抗MRSA活性得到維持。儲存后，噬菌體活性(如回收的LVCC周圍看到的清除區(qū)域顯示的)延續(xù)數(shù)周一見圖5。
[0118]實施例3-LVCC抵抗干燥、紫外輻射和溫度所帶來的穩(wěn)定性
[0119]在這些例子中，使用活化的尼龍聚合物或棉纖維作為載體基質(zhì)來產(chǎn)生LVCC。將附著有噬菌體的LVCC暴露于一系列的環(huán)境條件中，包括干燥，通過相對濕度對噬菌體存活的影響所顯示的(見圖6a)，紫外光(見圖6b)和升高的溫度(見圖6c)，已知所有條件都能使游離噬菌體變性。
[0120]將三條2 X Icm的噬菌體條料放置在LBM瓊脂上，并放置在無菌操作柜中暴露于紫外光5、15和30min。然后將條料翻過來，并放置在瓊脂的新鮮區(qū)域，重復(fù)紫外線照射。類似地處理對照噬菌體條料，但是屏蔽紫外線。然后，將這些條料轉(zhuǎn)移到15ml LB液體培養(yǎng)基中，接種50 μ I金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)懸浮液并培養(yǎng)。
[0121]結(jié)果一見表2
[0122]結(jié)論:附著的噬菌體暴露在柜子紫外線中能經(jīng)受30分鐘。暴露于紫外線源5分鐘能殺死金黃色葡萄球菌(S.aureus)細菌細胞。
[0123]實施例4一在極端環(huán)境中保持活力
[0124]在這個實施例中，在暴露到土壤提供的嚴格條件后，確定LVCC噬菌體增強的穩(wěn)定性和活力。該研究涉及兩種類型LVCC的結(jié)構(gòu)，采用的噬菌體是固定到尼龍聚合物或纖維的。隨后，將每種LVCC埋在沒有滅菌或滅菌的土壤中，3周后取樣評定LVCC的抗菌活性。
[0125]結(jié)果顯示，與游離噬菌體相比，兩種LVCC噬菌體都有提高的生存率(見圖7)。
[0126]實施例5—多種噬菌體構(gòu)成的LVCC
[0127]將兩種噬菌體固定到共同的載體基質(zhì)上并測試抗菌活性，評估LVCC的性能這兩種噬菌體對抵抗兩種不同的靶標細菌具有活性。在細菌菌苔上的清除百分率是基于每種噬菌體在它們的宿主菌種上的平均清除范圍，測量單位為mm。[0128]結(jié)果顯示，抗菌活性沒有減低，LVCC噬菌體在抵抗兩種靶標細菌方面仍然有活性(見圖8)。將處理的材料暴露在2種細菌種類中(I種宿主，I種非宿主)，結(jié)果仍然能清除易受感染的宿主。
[0129]實施例6—深部傷口的處理
[0130]在10只對照動物(大鼠)中，用100 μ I懸浮在5%豬胃粘蛋白中的5X107cfu/mlE15MRSA感染深切到棘突旁肌肉的切口中，并且用一般的縫合線將傷口縫合。10只測試動物具有相同的切口，采用100μ I懸浮在5%豬胃粘蛋白中的5X107cfu/ml E15MRSA感染，并且在該深部傷口中插入噬菌體處理過的細絲。被固定的噬菌體為噬菌體K。
[0131]手術(shù)后，所有動物用鎮(zhèn)痛劑處理，并且在起初的12小時內(nèi)每小時進行觀察，在隨后的12小時內(nèi)，每3小時進行觀察，然后在感染后的接下來2天每6小時進行觀察，并且這以后每天觀察2次。
[0132]在這些時間間隔檢查傷口位置，檢查發(fā)炎和感染(膿形成)的現(xiàn)象14天。觀察的結(jié)果顯不在表3中。
[0133]關(guān)于圖9，其顯示受感染的對照:如所見，在第14天，該位置依然很大，腫脹并且如果全部愈合，情況欠佳，切口位置凸起。如圖10所示，當打開時，顯露出填充膿汁的切口位置。
[0134]圖11中顯示使用附著有噬菌體的測試細絲。在第14天，這個愈合良好的切口位置有最小的腫脹。在第14天，內(nèi)部位置顯示向傷口位置的腫脹減少，棘突旁肌肉中的膿形成減少。
[0135]實施例7—在西紅柿種子上固定噬菌體
[0136]噬菌體的制備
[0137]我們在20%胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基(其他合適的培養(yǎng)基也是已知的)上培養(yǎng)果膠桿菌(Pectobacterium carotovorum)菌株,并用對數(shù)生長期的溶解性曬菌體來感染培養(yǎng)基。當發(fā)生溶解時，我們通過離心將噬菌體純化，并通過將其重懸于蒸餾水中來洗滌噬菌體小球3次，并通過離心進行濃縮。
[0138]電暈處理
[0139]用75kV的電暈場對西紅柿種子處理I秒，然后將種子浸入曬菌體懸浮液中(一種替代方式是將噬菌體懸浮液噴到經(jīng)處理的種子上)。我們將種子用水洗滌3次來去掉沒有結(jié)合的噬菌體(一種替代方式是在電暈處理前，將噬菌體懸浮液施加到種子上)。請注意，其他場強度也是有效的，而僅需要洗滌來證明觀察到的抗菌效果是由共價結(jié)合的噬菌體產(chǎn)生的，而不是吸附的“游離”噬菌體產(chǎn)生的。
[0140]發(fā)芽
[0141]因此，我們制備的種子為(i)沒有處理的，(ii)電暈放電處理的，(iii)在噬菌體存在下用電暈放電處理，以及(iv)用游離噬菌體處理的，在室溫下，使種子在盤子中用水濕潤的紙上發(fā)芽(一種替代方式是在有或沒有果膠桿菌屬(Pectobacterium)的胰蛋白酶大豆瓊脂(加入2%瓊脂的液體培養(yǎng)基)上發(fā)芽)。
[0142]結(jié)果
[0143]與對照(圖13，沒有電暈處理)和沒有噬菌體(圖16)相比，西紅柿種子在用電暈處理(圖15)和電暈處理并帶有抗果膠桿菌屬噬菌體(圖14)的情況下顯示提高的發(fā)芽率。在與合適的果膠桿菌屬菌種(易受使用的噬菌體感染的)一起培養(yǎng)的瓊脂上，用電暈和抗果膠桿菌屬的噬菌體處理的種子周圍，將看到清除區(qū)域。西紅柿種子表面大部分為纖維素，而我們隨后分別測試固定在纖維素顆粒上的噬菌體的活力--見以下。
[0144]實施例8—體內(nèi)植物病原體檢測
[0145]根據(jù)W02007/072049的電暈放電法，我們將果膠桿菌屬噬菌體固定到纖維素粉(粒度范圍大約100微米-1毫米)。
[0146]我們將合適的果膠桿菌屬菌株(易受使用的噬菌體感染的)接種到瓊脂平板，并在三個位置加入經(jīng)處理的纖維素顆粒。
[0147]參考圖17中顯示的結(jié)果，可以看到粉末顆粒周圍的清除情況，顯示出固定的噬菌體抵抗軟腐病細菌的活性。這證明了附著在纖維素材料上的噬菌體是有活力的。
[0148]實施例9—纖維素顆粒上的噬菌體
[0149]按照W02007/072049的電暈放電法，我們將果膠桿菌屬噬菌體固定到纖維素粉(粒度范圍大約100微米-1毫米)。
[0150]我們將合適的果膠桿菌屬菌株(易受使用的噬菌體感染的)接種到瓊脂平板，并在三個位置加入處理的纖維素顆粒。
[0151]我們用(i)空白=對照，(ii)溶液中的游離噬菌體和(iii)溶液中附著在纖維素顆粒的噬菌體來處理平板，并滴定(i i)和(iii)直到觀察到類似的細菌清除活性。與使用1份附著在纖維素顆粒的噬菌體相比，當使用大約100份游離噬菌體時，出現(xiàn)類似的活性。這證明了固定的噬菌體的性能比游離噬菌體的性能提高了。
[0152]實施例10—馬鈴薯的處理
[0153]用以下對馬鈴薯塊莖進行處理:(i )滅菌水=對照，(ii )游離噬菌體和(iii )對造成馬鈴薯“黑脛病”的細菌具有特異性的噬菌體，按照實施例8和9固定在纖維素顆粒上。用溶液噴灑塊莖，并使其干燥。
[0154]種植塊莖，并用植株的數(shù)目、莖的總數(shù)和感染黑脛病的植株數(shù)來記錄其生長。結(jié)果顯不在表4中。
[0155]因此，我們發(fā)現(xiàn)，與其他處理相比，用果膠桿菌屬處理并噴灑水(陽性對照)的處理具有最低出苗數(shù)，并且莖有更大幾率出現(xiàn)黑脛病。
[0156]用游離噬菌體處理對出苗總數(shù)影響很小。
[0157]當與陽性對照比較時，每株的莖數(shù)有增加。
[0158]僅有一株用游離曬菌體處理的植株出現(xiàn)黑胚病的病征。
[0159]當與對照相比，用固定的噬菌體處理增加了每顆植株的莖數(shù)，以及出苗數(shù)。種植8周后，在最后的觀察中，用固定的噬菌體處理的塊莖中沒有發(fā)現(xiàn)黑脛病的病征，顯示出持續(xù)的抗菌活性。
[0160]表 IA
【權(quán)利要求】
1.一種附著有噬菌體的植物材料，其特征在于，所述噬菌體保持著感染性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料附著有多種感染不同細菌的噬菌體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料選自水果、蔬菜、葉、莖、花、根、塊莖、幼苗和種子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料為食用種子。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料為種子儲備。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于預(yù)防或治療植物病害。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求1-5中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于預(yù)防或治療食用所述植物材料的動物的疾病。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求7所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于預(yù)防或治療胃腸道中的細菌感染。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求7或8所述的植物材料，其特征在于，所述植物材料用于預(yù)防或治療鳥類疾病。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌體被物理固定到所述植物材料上。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌體通過共價鍵、離子鍵、氫鍵或范德華力附著到所述植物材料。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌體是通過共價附著的。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的植物材料，其特征在于，所述噬菌體附著到一顆粒，并且所述顆粒附著到所述植物材料。
14.一種處理植物材料的方法，包括將噬菌體附著到所述植物材料，其中，所述噬菌體保持著感染性。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，包括活化所述植物材料，然后將所述噬菌體附著到該活化了的植物材料。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的方法，其中，所述植物材料附著有多種感染不同細菌的噬菌體。
17.根據(jù)權(quán)利要求14-16中任一項所述的方法，其中，所述植物材料選自水果、蔬菜、葉、莖、花、根、塊莖、幼苗和種子。
18.根據(jù)權(quán)利要求14-17中任一項所述的方法，其中，所述植物材料包括食用種子或用于種子儲備的種子。
19.根據(jù)權(quán)利要求14-18中任一項所述的方法，其特征在于，該方法用于制備植物材料來用于預(yù)防或治療植物病害。
20.根據(jù)前述權(quán)利要求14-19中任一項所述的方法，其特征在于，該方法用于制備植物材料來用于預(yù)防或治療食用所述植物材料的動物的疾病。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求14-20中任一項所述的方法，包括將所述噬菌體通過共價鍵、離子鍵、氫鍵或范德華力附著到所述植物材料。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述噬菌體是通過共價附著的。
23.根據(jù)權(quán)利要求14-22中任一項所述的方法，包括將所述噬菌體附著到一顆粒或多顆粒，并且將所述一顆?；蚨囝w粒附著到所述植物材料。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，包括將噬菌體共價附著的顆粒的水性制劑與植物材料一起混合，并將混合物干燥，使得顆粒附著到所述植物材料上。
25.—種包含根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項所述的植物材料的組合物。
26.一種預(yù)防或治療食用植物材料的動物的疾病的方法，包括給予所述動物一根據(jù)權(quán)利要求25所述的組合物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中，所述疾病是胃腸道疾病。
28.一種組合物，包含載體以及共價附著其上的噬菌體，所述載體選自(i)細絲，(ii)平面材料和(iii)顆粒和/或小珠，其中，所述噬菌體保持著感染性。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組合物，其中，所述載體是可生物降解的和/或可生物兼容的。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29所述的組合物，其中所述載體是組織兼容的，并且能被原位吸收。
31.根據(jù)權(quán)利要求28-30中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物用于深部傷口中細菌感染的治療或預(yù)防。
32.—種根據(jù)權(quán)利要求28-31中任一項的細絲。
33.一種細絲納入到敷料中的傷口敷料，其特征在于，所述細絲附著有噬菌體，并且可選地是根據(jù)權(quán)利要求28-32中的任一項。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的傷口敷料，其中，所述細絲是編織到所述敷料中的。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的傷口敷料，其中，所述細絲是松散在所述敷料上的。
36.一種治療身體部位上的感染的方法，包括將細絲定位在所述部位，所述細絲附著有噬菌體，并且可選地是根據(jù)權(quán)利要求28-32中的任一項。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中，所述部位是深部傷口。
38.一種傷口敷料，其特征在于，所述傷口敷料包含多種細絲，噬菌體附著其上，其中存在至少第一細絲和第二細絲，第一噬菌體附著到第一細絲，第二噬菌體附著到第二細絲，以及其中所述第一和第二噬菌體感染不同株或種的細菌。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的傷口敷料，其中，所述第一和第二細絲是不同的顏色。
【文檔編號】A61K35/76GK103747792SQ201280035218
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2012年6月25日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月23日
【發(fā)明者】J·查德威克, M·馬泰 申請人:固定噬菌體有限公司