專利名稱：一種輔助鑒定李痘病毒的試劑盒及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助鑒定李痘病毒的試劑盒及其應用。
背景技術(shù)：
李痘病毒(Plum pox virus, PPV)是馬鈴薯Y病毒屬成員，病毒粒子呈彎曲桿狀， 大小為700nmXllnm，是我國的檢疫性有害生物。自然條件下，PPV寄主范圍廣，可侵染46 種木本植物和150種草本植物，李、桃、杏和櫻桃等多種核果類果樹均可受害。李痘病毒分 布范圍極廣，在美國、加拿大、日本、埃及、印度、敘利亞、土耳其、智禾I』、及歐洲許多國家均有 報道。李痘病毒可經(jīng)蚜蟲以非持久性方式傳播，擴散速度快，在短時間內(nèi)即可能給國內(nèi)整個 核果類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來災難性后果。加強該病毒的檢疫監(jiān)測，對于防止PPV傳入具有極為 重要的意義。目前，檢測PPV的常用方法主要是ELISA、普通RT-PCR、多重PCR等方法，但這些方 法有的存在假陽性問題，有的難以確定起始模板的拷貝數(shù)。本領(lǐng)域迫切需要特異性更強、靈 敏度更高、方便準確的檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種輔助鑒定李痘病毒的試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的輔助鑒定李痘病毒的試劑盒，包括特異引物對；所述特異引物對為 序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對。所述試劑盒還可包括特異探針；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3所 示。所述特異探針可為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端連接有熒 光報告基團FAM，3’末端連接有熒光淬滅基團Eclipse。特異引物對如下上游引物(F):5，-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3，(序列表的序列 1)；下游引物(R):5，-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3，(序列表的序列 2)。特異探針(TaqMan探針)(核苷酸序列為序列表的序列3)如下5，-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3，。所述試劑盒還可以包括其它PCR常規(guī)試劑、RNA提取試劑和反轉(zhuǎn)錄常規(guī)試劑等。所述試劑盒可用于輔助鑒定李痘病毒。本發(fā)明還保護一種輔助鑒定李痘病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA 為模板，用特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為 候選的李痘病毒；如果沒有得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為候選的非李痘病毒；所述 特異引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對。所述待 測病毒可為李痘病毒(PPV)、馬鈴薯X病毒(PVX)或馬鈴薯Y病毒(PVY)本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步驟以 待測樣本的cDNA為模板，用特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測樣本中含有李痘病毒；如果沒有得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測樣本中不含有李痘 病毒；所述特異引物對為序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸序列組成的引物對。本發(fā)明還提供另一種檢測待測樣本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步驟 以待測樣本的cDNA為模板，用特異引物對和特異探針進行實時熒光PCR，根據(jù)擴增曲線判 斷待測樣本中是否含有李痘病毒；所述特異引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的 序列2所示DNA組成的引物對；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列 3所示，5’末端標記有熒光報告基團FAM，3’末端標記有熒光淬滅基團Eclipse。實時熒光 定量PCR技術(shù)具有定量、高特異性、高敏感性、高通量等優(yōu)點，非常適用于病毒的檢測。如果 擴增曲線均處于閾值以下，待測樣本不含有李痘病毒；如果部分擴增曲線處于閾值以上，待 測樣本含有李痘病毒。本發(fā)明還保護一種輔助檢測李痘病毒的特異引物對，為序列表的序列1所示DNA 和序列表的序列2所示DNA組成的引物對。本發(fā)明還保護一種輔助檢測李痘病毒的特異探針，所述特異探針的核苷酸序列如 序列表的序列3所示。所述探針具體可為TaqMan探針。采用本發(fā)明提供的試劑盒，用引物對與特異性TaqMan探針進行實時熒光PCR檢 測，根據(jù)是否產(chǎn)生熒光信號，可以判斷樣品中是否含有李痘病毒，根據(jù)產(chǎn)生熒光信號值的大 小，即可判斷樣品中李痘病毒含量的高低。與現(xiàn)有技術(shù)比較，本發(fā)明的優(yōu)點如下1)檢測結(jié)果準確性高。在開發(fā)與檢驗特異引物對與特異探針的過程中，檢測準確 率達95%以上。2)檢測靈敏度高。至少能檢測到160個拷貝的病毒RNA。3)可以定量檢測。在定性檢測李痘病毒的基礎(chǔ)上，可以得到樣本中病毒的準確含量。4)檢測方法安全。不需要進行電泳檢測，避免了溴化乙啶以及一些染料對環(huán)境的 污染與人體的損害。5)檢測結(jié)果易于判讀。用引物對與特異性TaqMan探針進行實時熒光PCR檢測，根 據(jù)是否產(chǎn)生熒光信號，可以判斷樣品中是否含有李痘病毒；根據(jù)產(chǎn)生熒光信號值的大小，即 可判斷樣品中李痘病毒含量的高低。6)檢測儀器簡便。僅需實時熒光PCR儀，無需電泳儀。適合在口岸檢驗檢疫局進 行推廣。本發(fā)明公開了一種含有特異引物對和特異探針的試劑盒，可以快速、準確、穩(wěn)定、 定量鑒定出李痘病毒。根據(jù)是否產(chǎn)生熒光信號，可以判斷樣品中是否含有李痘病毒，根據(jù)產(chǎn) 生熒光信號值的大小(擴增曲線)，即可判斷樣品中李痘病毒含量的高低。本發(fā)明的試劑 盒具有特異性強、準確性高、檢測過程操作簡便(僅需一臺實時熒光PCR儀即可進行檢測， 無需進行電泳操作)、檢測所需時間短(從李痘病毒的提取到檢測結(jié)果出現(xiàn)僅需3個小時) 等優(yōu)點，適合農(nóng)業(yè)部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗檢疫局、植物病毒研究機構(gòu)等應用。


圖1為PPV熒光定量的靈敏度；1-6依次為1.6X107，1.6X106，1.6X105，1.6X104,1.6X IO3,1.6X IO20圖2為PPV熒光定量的特異性；A =PPV ；B :PVY, PVX和空白對照的疊加。圖3為PPV熒光定量的重復性；1-5依次為1.6X107，1.6X106，1.6X105，
1. 6X IO4,1.6X IO3O
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平均值。實時熒光 PCR儀為 Rotor-Gene 3000PCR擴增儀；Reverse Transcription System A3500和dNTPs購于Promega公司；實時熒光PCR所用試劑、RNA提取試劑盒購自天根公司； Taq酶、連接酶、pMD18-T載體、大腸桿菌DH5a和DNA Marker DL2000購自TaKaRa ；引物與 探針由大連寶生物技術(shù)公司合成。李痘病毒(PPV)購自ATCC，產(chǎn)品目錄號為PVAS-709 ’馬 鈴薯X病毒(PVX)購自ATCC，產(chǎn)品目錄號為PV-197 ；馬鈴薯Y病毒(PVY)購自ATCC，產(chǎn)品 目錄號為PV-50 ；ATCC即美國標準菌種收藏所(http://WWW. atcc. org/)。實施例1、試劑盒的制備試劑盒由特異引物對和特異探針組成。特異引物對如下上游引物(F):5，-ACTACAGCCTCGCCAGATATG-3，(序列表的序列 1)；下游引物(R):5，-TTTCCATCCAAGCCAAATAAACG-3，(序列表的序列 2)。該特異引物對針對序列表的序列4或序列5所示李痘病毒CP基因自5’末端第 677-815 位核苷酸(139bp)。特異探針(TaqMan探針)(核苷酸序列為序列表的序列3)如下5，-(FAM)CTCAATGCTGCTGCCTTCATCTGGA(Eclipse)-3，。用實施例1的試劑盒進行實施例2、實施例3和實施例4的測定。實施例2、試劑盒的靈敏度測定一、標準曲線的制作1、以PPV的總RNA為模板，用PPV-F和PPV-R組成的引物對進行PCR擴增，得到 PCR擴增產(chǎn)物。PPV-F :5，-CCACCTCCAGTCATACAG-3，；PPV-R 5’ -AGATACCGAGACCACTACAC-3’。PPV-F和PPV-R的靶標序列為序列表的序列4所示的李痘病毒CP基因全序列DNA。2、將步驟1的PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，切膠回收，得到純化后DNA。3、將純化的DNA連接到pMD18_T載體上，得到連接產(chǎn)物。4、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，篩選重組子，提取質(zhì)粒進行PCR鑒 定和測序，結(jié)果表明得到了含有序列4所示DNA的重組質(zhì)粒以及含有重組質(zhì)粒的重組菌。5、用分光光度計測定重組菌菌液的0D260nm值，并換算質(zhì)粒濃度(拷貝數(shù)/ μ L)，-20°c保存作為質(zhì)粒標準品備用。
6、將質(zhì)粒標準品進行10倍梯度稀釋，各個稀釋液分別作為模板，用實施例1制 備的試劑盒進行實時熒光PCR。實時熒光PCR反應體系2. 5Xreal Master Mix 10μ 1, 20 XProbe Enhancer solution 1. 25 μ 1，lOmmol/L 上、下游引物各 0. 5 μ L，20mmol/L 特 異探針 0. 25 μ L，模板 2 μ L，力口 ddH20 至總體積為 25 μ L。PCR 程序-MV 15min ；55°C 20s， 68°C 30s，循環(huán) 40 次。7、根據(jù)各個稀釋度的稀釋液的擴增曲線制作標準曲線，標準曲線的函數(shù)為y ="3. 643X+37. 576 ；y為-Iogltl基因拷貝數(shù)，χ為Ct值，Ct值即每個反應管內(nèi)的熒光信號 到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。二、試劑盒的靈敏度測定1、病毒RNA的提取稱取0. Ig發(fā)病本生煙葉片，采用植物病毒核酸Trizol提取試劑盒提取病毒RNA， 得到病毒RNA液。用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer定量分析儀測定其濃度。2、cDNA 的合成將病毒RNA進行10倍梯度稀釋，分別合成cDNA，每個梯度重復3次。cDNA的合成體系(20. OyL)如下DEPC-H2O7. 8μ L
IOXbuffer2. 0μ L
MgCl2 (25mmol/L)4. 0μ L
dNTP(10mmol/L)LOyL
隨機六聚體引物2. 0μ L
RNasin(44U/μ L)0. 5μ L
病毒RNA2. 0μ L
AMV Reverse Transcriptase (22U/μ L)0. 7μ L合成體系混勻后42°C水浴lh，95°C滅活5min，冰上放置待用。3、靈敏度測定將步驟2的cDNA液作為模板，用實施例1的試劑盒進行實時熒光PCR。實時熒光 PCR反應體系和PCR程序同步驟一的6。結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明，實施例1的試劑盒穩(wěn)定性強，靈敏度高，至少可以檢 測到160個病毒拷貝。實施例3、試劑盒的特異性測定一、病毒RNA的提取分別提取三種病毒(PPV，PVX, PVY)的總RNA 采用RNA提取試劑盒(植物病 毒核酸Trizol提取試劑盒)提取病毒總RNA，得到病毒RNA液；用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer定量分析儀測定其濃度，最終濃度均統(tǒng)一為lOOOng/ul。二、cDNA 的合成分別合成各個病毒的cDNA，cDNA的合成體系同實施例2的步驟二的2。三、實時熒光PCR擴增將步驟二的cDNA液作為模板，用實施例1的試劑盒進行實時熒光PCR。實時熒光 PCR反應體系和PCR程序同實施例1的步驟一的6。
結(jié)果見圖2。PPV出現(xiàn)典型的擴增曲線，Ct值讀數(shù)為17. 25，判為陽性。PVX和PVY 的擴增曲線均在所設定的閾值線之下，判為陰性?？梢姡捎帽景l(fā)明的試劑盒進行檢測具有 很強的檢測特異性。實施例4、試劑盒的重復性測定一、病毒RNA的提取分別將實施例2的步驟二得到的10倍梯度稀釋的各濃度的cDNA液(分別含有 1.6X107個拷貝數(shù)、1.6X106個拷貝數(shù)、1.6X105個拷貝數(shù)、1.6X104個拷貝數(shù)、1.6X103個 拷貝數(shù)；每個濃度3次重復)作為模板，用實施例1的試劑盒進行實時熒光PCR。實時熒光 PCR反應體系和PCR程序同實施例1的步驟一的6。結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，表明該方法各梯度的變異系數(shù)均小于0. 6% ；具有較好的 組內(nèi)重復性。
權(quán)利要求
一種輔助鑒定李痘病毒的試劑盒，包括特異引物對；所述特異引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括特異探針；所述特異探 針的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述特異探針為TaqMan探針，其5’末端 連接有熒光報告基團FAM，其3’末端連接有熒光淬滅基團Eclipse。
4.權(quán)利要求1至3中任一所述的試劑盒在輔助鑒定李痘病毒中的應用。
5.一種輔助鑒定李痘病毒的方法，包括如下步驟以待測病毒的cDNA為模板，用特異 引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為候選的李痘病 毒；如果沒有得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測病毒為候選的非李痘病毒；所述特異引物對為 序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述待測病毒為李痘病毒、馬鈴薯X病毒或 馬鈴薯Y病毒。
7.—種檢測待測樣本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步驟以待測樣本的cDNA為模板，用特異引物對進行PCR，檢測PCR產(chǎn)物；如果得到139bp的 PCR產(chǎn)物，則待測樣本中含有李痘病毒；如果沒有得到139bp的PCR產(chǎn)物，則待測樣本中不 含有李痘病毒；所述特異引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組 成的引物對。
8.—種檢測待測樣本中是否含有李痘病毒的方法，包括如下步驟以待測樣本的cDNA 為模板，用特異引物對和特異探針進行實時熒光PCR，根據(jù)擴增曲線判斷待測樣本中是否含 有李痘病毒；所述特異引物對為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成 的引物對；所述特異探針為TaqMan探針，核苷酸序列如序列表的序列3所示，5’末端連接 有熒光報告基團FAM，3’末端連接有熒光淬滅基團Eclipse。
9.一種輔助檢測李痘病毒的特異引物對，為序列表的序列1和序列表的序列2所示核 苷酸序列組成的引物對。
10.一種輔助檢測李痘病毒的特異探針，所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列 3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助鑒定李痘病毒的試劑盒及其應用。本發(fā)明提供的試劑盒，包括特異引物對和/或特異探針；特異引物對為序列1和序列2所示DNA組成的引物對；所述特異探針的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本發(fā)明提供的試劑盒，可以快速、準確、穩(wěn)定、定量檢測出李痘病毒，根據(jù)是否產(chǎn)生熒光信號，可以判斷樣品中是否含有李痘病毒，根據(jù)產(chǎn)生熒光信號值的大小，即可判斷樣品中李痘病毒含量的高低。本發(fā)明的試劑盒具有特異性強、準確性高、檢測過程操作簡便、檢測所需時間短等優(yōu)點，適合農(nóng)業(yè)部門的各檢疫檢查站、各口岸檢驗檢疫局、植物病毒研究機構(gòu)等應用。
文檔編號C12N15/11GK101928786SQ20101025417
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者張永江, 李明福, 李桂芬, 王進忠, 高雅紅 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院