專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重金屬酶標(biāo)物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重金屬酶標(biāo)物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
重金屬是環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品中的重要污染物質(zhì)，可以通過(guò)食物鏈在動(dòng)物及人的體內(nèi)尤 其是肝臟內(nèi)富集，對(duì)人類(lèi)健康會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的危害。銅是生命體生長(zhǎng)所必須的微量元素之一， 但是高濃度的銅會(huì)對(duì)生命體產(chǎn)生毒害作用。水生生物對(duì)銅離子的毒害作用尤為敏感。目前，重金屬銅的分析方法主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體發(fā)射光/ 質(zhì)譜法、X-射線熒光光譜法、電位溶出分析法以及近幾年發(fā)展的生物傳感器檢測(cè)法等。但 是用這幾種方法檢測(cè)銅離子需要昂貴的儀器設(shè)備，檢測(cè)費(fèi)用高，耗時(shí)，不能用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢 測(cè)。與儀器分析法相比，直接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)具有快速、簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)、易于進(jìn)行 現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、樣品前處理簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性強(qiáng)、適合于高通量分析等優(yōu)點(diǎn)，而且還能大幅 度降低檢測(cè)成本。獲得好的抗原酶標(biāo)物是建立高靈敏度的直接ELISA檢測(cè)方法的前提。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備重金屬酶標(biāo)物的方法。本發(fā)明所提供的制備重金屬酶標(biāo)物的方法，包括如下步驟(1)將酶活化，得到活化后的酶；(2)將所述活化后的酶與絡(luò)合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到重金屬酶標(biāo)物；所述絡(luò)合物是按照包括如下步驟的方法制備的I、將螯合劑重氮化，得到重氮化的螯合劑；II、將載體蛋白與所述重氮化的螯合劑混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到載體蛋白與所述 重氮化的螯合劑的偶聯(lián)物；III、將金屬離子的溶液與所述偶聯(lián)物混合，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，得到所述絡(luò)合物。上述任一所述制備方法中，所述步驟(1)中，所述活化的方法包括如下步驟將酶 的水溶液與Naio4水溶液混合，反應(yīng)，得到活化的酶；上述任一所述制備方法中，所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與絡(luò)合物進(jìn)行交 聯(lián)反應(yīng)的方法包括如下步驟將所述絡(luò)合物溶于碳酸鹽緩沖液中，再加入所述活化后的酶， 反應(yīng)，得到所述重金屬酶標(biāo)物；上述任一所述制備方法中，所述步驟I中，所述重氮化的方法包括如下步驟將所 述螯合劑溶于酸的水溶液中，再向其中加入亞硝酸鹽，進(jìn)行重氮化反應(yīng)，得到所述重氮化的 螯合劑；所述重氮化反應(yīng)的條件包括溫度為0-5°C、避光和時(shí)間為15min ；所述溫度優(yōu)選為 0°C或4°C ；所述螯合劑、酸和亞硝酸鹽的配比為4mg 2X lirtiol 1.2X10"4mol ；上述任一所述制備方法中，所述步驟II中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的條件包括溫度為 40C -10°C或4°C，pH值為8. 5-9. 0或8. 5，反應(yīng)時(shí)間為4h_24h或4h ；所述重氮化的螯合劑 與所述載體蛋白的投料摩爾比為10 1 ；
上述任一所述制備方法中，所述步驟III中，所述絡(luò)合反應(yīng)的條件包括溫度為 25°C、pH值為7. 5和時(shí)間為12h;所述偶聯(lián)物與所述金屬離子的投料摩爾比為1 20。上述任一所述制備方法中，所述步驟(1)中，所述活化的方法中，所述反應(yīng)的溫度 為25°C，反應(yīng)的時(shí)間為20min ；(酶與NaIO4的投料配比為IOmg酶0. 02mol NaIO4 ；)上述任一所述制備方法中，所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與所述絡(luò)合物進(jìn) 行交聯(lián)反應(yīng)的方法中，所述反應(yīng)的溫度為25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為2小時(shí)，所述反應(yīng)的PH值 為8.0;(所述活化后的酶與所述絡(luò)合物的投料摩爾比為2 1 ；)；上述任一所述制備方法中，所述步驟(1)中，所述活化的方法中，在所述反應(yīng)后， 包括如下用乙二醇終止反應(yīng)的步驟向所述反應(yīng)的體系中加入乙二醇水溶液，25°C攪拌反 應(yīng)IOmin ；其中乙二醇與NaIO4的投料摩爾比為1:1;上述任一所述制備方法中，所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與所述絡(luò)合物進(jìn) 行交聯(lián)反應(yīng)的方法中，在所述反應(yīng)后，包括如下步驟向所述反應(yīng)的體系中加入NaBH4,4°C 攪拌反應(yīng)2小時(shí)。上述任一所述制備方法中，所述重金屬為銅；所述螯合劑為對(duì)氨基芐基乙二胺四 乙酸；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白；所述酶為辣 根過(guò)氧化物酶。所述對(duì)氨基芐基乙二胺四乙酸的結(jié)構(gòu)式為由上述任一所述制備方法得到的重金屬酶標(biāo)物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重金屬酶標(biāo)物。本發(fā)明所提供的重金屬酶標(biāo)物，是絡(luò)合物與酶通過(guò)共價(jià)鍵形成的交聯(lián)物；所述絡(luò) 合物為螯合劑與載體蛋白通過(guò)共價(jià)鍵連接形成的偶聯(lián)物再與重金屬通過(guò)配位鍵連接形成 的絡(luò)合物。所述絡(luò)合物中，螯合劑與載體蛋白間的共價(jià)鍵是所述螯合劑上的氨基基團(tuán)與所述 載體蛋白中酪氨酸上的酚基基團(tuán)形成的，所述配位鍵是所述重金屬離子與所述偶聯(lián)物中螯 合劑上的EDTA形成的；所述絡(luò)合物與酶間的共價(jià)鍵是所述絡(luò)合物中載體蛋白上的氨基基 團(tuán)與所述酶上的糖基基團(tuán)形成的。其中，所述重金屬為銅；所述螯合劑為對(duì)氨基芐基乙二胺四乙酸；所述載體蛋白 為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清白蛋白；所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于檢測(cè)樣品中是否含有重金屬的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測(cè)樣品中是否含有重金屬的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被原 和上述任一所述重金屬酶標(biāo)物；所述包被原為抗待檢重金屬的抗體；所述重金屬酶標(biāo)物中的重金屬與所述待檢重金屬相同。上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述酶聯(lián)免疫試劑盒中包括包被緩沖液、洗滌 液、樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品為EDTA與所述待檢重金屬的螯合 物；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品是按照如下方法制備得到的(1)將每29. 3mg EDTA溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8. 0，得到溶液I ；(2)將13. 5mg待檢重金屬的可溶性鹽溶解于去離子水中，并逐滴加入到所述溶液 I中，磁力攪拌反應(yīng)12小時(shí)，再將溶液定容至6. 4mL，得到EDTA與所述待檢重金屬的螯合 物；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液中所述待檢重金屬離子濃度為 10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL、0. 31ng/mL、0. 156ng/mL、0. 078ng/mL 和 0.039ng/mL ；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述包被緩沖液為0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖 液；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，每1升洗滌液按照如下方法配制將8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、lmlTween-20 溶于水中，并用水補(bǔ)足至 IL ；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，樣品稀釋液按照如下方法配制將ImL吐溫20 和Ig明膠溶于IL PBS緩沖液中，得到樣品稀釋液；每1升PBS緩沖液由NaCl、KH2PO4, Na2HPO4 · 12H20和水組成；NaCl在磷酸鹽緩沖 液中的濃度為8. Og/L, KH2PO4在磷酸鹽緩沖液中的濃度為0. 2g/L，Na2HPO4 · 12H20在磷酸鹽 緩沖液中的濃度為2. 96g/L，pH值為7. 5。 上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述抗待檢重金屬的抗體為抗待檢重金屬的單 克隆抗體或多克隆抗體。上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒中，所述待檢重金屬為銅；所述抗待檢重金屬的抗 體是由保藏號(hào)為CGMCC No. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu-EDTA 6A9產(chǎn)生。保藏號(hào)為CGMCC No. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu-EDTA 6A9產(chǎn)生的抗金屬銅的單克隆 抗體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍；保藏號(hào)為CGMCC No. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu-EDTA 6A9也屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍；上述任一所述重金屬酶標(biāo)物在檢測(cè)樣品中是否含有重金屬中的應(yīng)用也屬于本發(fā) 明的保護(hù)范圍；上述任一所述酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測(cè)樣品中是否含有重金屬中的應(yīng)用也屬于本 發(fā)明的保護(hù)范圍。在小分子物質(zhì)的直接ELISA檢測(cè)方法中，其酶標(biāo)物的制備一般是通過(guò)活化小分子 上的活性集團(tuán)然后與HRP分子上的游離氨基、巰基或羧基連接，此方法經(jīng)常容易導(dǎo)致所制 備的酶標(biāo)物酶活性的很大損失。本發(fā)明所提供的方法避開(kāi)了小分子經(jīng)活化后直接與HRP相 連的常規(guī)方法，而是小分子先與載體蛋白連接后，再通過(guò)載體蛋白與HRP連接，這樣可以極 大地避免HRP在交聯(lián)反應(yīng)中的酶活性損失。
本發(fā)明所提供的制備銅離子酶標(biāo)物的制備方法簡(jiǎn)單，合成成本低，HRP活性損失 小。用本發(fā)明方法制備的酶標(biāo)物所建立的ELISA檢測(cè)方法具有很高的靈敏度。本發(fā)明的制 備銅離子ELISA檢測(cè)用酶標(biāo)物的方法對(duì)其他重金屬ELISA檢測(cè)用酶標(biāo)物的成功制備具有重 要的參考價(jià)值，由該方法建立的銅離子快速免疫檢測(cè)方法將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為銅離子直接ELISA檢測(cè)用酶標(biāo)物的合成路線圖。圖2為以EDTA-Cu為標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的銅離子直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。對(duì)氨基芐基乙二胺四乙酸{l-(4-Amin0benZyl)-EDTA}購(gòu)于日本同仁化學(xué)研究所 (Dojindo Laboratories)，產(chǎn)品號(hào)M029-10。乙二胺四乙酸(EDTA)，牛血清白蛋白，卵清白 蛋白和原子吸收級(jí)金屬銅離子均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司。其余常規(guī)試劑均購(gòu)自北京化學(xué) 試劑公司。辣根過(guò)氧化物酶(HRP)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為P6782。所述對(duì)氨基芐基乙二胺四乙酸的結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
一種制備重金屬酶標(biāo)物的方法，包括如下步驟(1)將酶活化，得到活化后的酶；(2)將所述活化后的酶與絡(luò)合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到重金屬酶標(biāo)物；所述絡(luò)合物是按照包括如下步驟的方法制備的Ⅰ、將螯合劑重氮化，得到重氮化的螯合劑；Ⅱ、將載體蛋白與所述重氮化的螯合劑混合，進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)，得到載體蛋白與所述重氮化的螯合劑的偶聯(lián)物；Ⅲ、將金屬離子的溶液與所述偶聯(lián)物混合，進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)，得到所述絡(luò)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述活化的方法包括如 下步驟將酶的水溶液與NaIO4水溶液混合，反應(yīng)，得到活化的酶；所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與絡(luò)合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的方法包括如下步驟將 所述絡(luò)合物溶于碳酸鹽緩沖液中，再加入所述活化后的酶，反應(yīng)，得到所述重金屬酶標(biāo)物；所述步驟I中，所述重氮化的方法包括如下步驟將所述螯合劑溶于酸的水溶液中，再 向其中加入亞硝酸鹽，進(jìn)行重氮化反應(yīng)，得到所述重氮化的螯合劑；所述重氮化反應(yīng)的條件 包括溫度為0-5°C、避光和時(shí)間為15min ；所述溫度優(yōu)選為0°C或4°C ；所述螯合劑、酸和亞 硝酸鹽的投料配比為4mg 2X10_3mol 1. 2X10"4mol ；所述步驟II中，所述偶聯(lián)反應(yīng)的條件包括溫度為4°C -10°C或4°C，pH值為8. 5-9. 0 或8. 5，反應(yīng)時(shí)間為4h-24h或4h ；所述重氮化的螯合劑與所述載體蛋白的投料摩爾比為 10 1 ；所述步驟III中，所述絡(luò)合反應(yīng)的條件包括溫度為25°C、PH值為7. 5和時(shí)間為12h ；所 述偶聯(lián)物與所述金屬離子的投料摩爾比為1 20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，所述活化的方法中， 所述反應(yīng)的溫度為25°C，反應(yīng)的時(shí)間為20min ；所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與所述絡(luò)合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的方法中，所述反應(yīng) 的溫度為25°C，所述反應(yīng)的時(shí)間為2小時(shí)，所述反應(yīng)的PH值為8. 0 ；所述步驟(1)中，所述活化的方法中，在所述反應(yīng)后，包括如下用乙二醇終止反應(yīng)的步 驟向所述反應(yīng)的體系中加入乙二醇水溶液，25°C攪拌反應(yīng)IOmin ；其中乙二醇與NaIO4的 投料摩爾比為11;所述步驟(2)中，所述將活化后的酶與所述絡(luò)合物進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)的方法中，在所述反 應(yīng)后，包括如下步驟向所述反應(yīng)的體系中加入NaBH4,4°C攪拌反應(yīng)2小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述重金屬為銅；所述螯合劑為 對(duì)氨基芐基乙二胺四乙酸；所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、血藍(lán)蛋白或卵清 白蛋白；所述酶為辣根過(guò)氧化物酶。
5.由權(quán)利要求1-4中任一所述方法得到的重金屬酶標(biāo)物。
6.一種重金屬酶標(biāo)物，是絡(luò)合物與酶通過(guò)共價(jià)鍵形成的交聯(lián)物；所述絡(luò)合物為螯合劑 與載體蛋白通過(guò)共價(jià)鍵連接形成的偶聯(lián)物再與重金屬通過(guò)配位鍵連接形成的絡(luò)合物。
7.一種用于檢測(cè)樣品中是否含有重金屬的酶聯(lián)免疫試劑盒，包括包被原和權(quán)利要求5 或6所述重金屬酶標(biāo)物；所述包被原為抗待檢重金屬的抗體；所述重金屬酶標(biāo)物中的重金 屬與所述待檢重金屬相同。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述酶聯(lián)免疫試劑盒中包括 包被緩沖液、洗滌液、樣品稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液；所述標(biāo)準(zhǔn)品為EDTA與所述待檢重金屬的螯合物；所述標(biāo)準(zhǔn)品是按照如下方法制備得到的(1)將每29.3mg EDTA溶解于去離子水中，調(diào)節(jié)pH至8.0，得到溶液I ；(2)將13.5mg待檢重金屬的可溶性鹽溶解于去離子水中，并逐滴加入到所述溶液I 中，磁力攪拌反應(yīng)12小時(shí)，再將溶液定容至6. 4mL，得到EDTA與所述待檢重金屬的螯合物；所述標(biāo)準(zhǔn)品溶液中所述待檢重金屬離子濃度為10ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/ mL、0. 625ng/mL、0. 31ng/mL、0. 156ng/mL、0. 078ng/mL 禾口 0. 039ng/mL ；所述包被緩沖液為0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液；每1升洗滌液按照如下方法配制將8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、 lmlTween-20溶于水中，并用水補(bǔ)足至IL ；樣品稀釋液按照如下方法配制將ImL吐溫20和Ig明膠溶于IL PBS緩沖液中，得到 樣品稀釋液；所述抗待檢重金屬的抗體為抗待檢重金屬的單克隆抗體或多克隆抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特征在于所述待檢重金屬為銅；所 述抗待檢重金屬的抗體是由保藏號(hào)為CGMCC No. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu_EDTA6A9產(chǎn)生。
10.保藏號(hào)為CGMCCNo. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu-EDTA 6A9產(chǎn)生的抗金屬銅的單克隆 抗體；保藏號(hào)為CGMCC No. 3987的雜交瘤細(xì)胞株Cu-EDTA 6A9 ；權(quán)利要求6或7所述重金屬酶標(biāo)物在檢測(cè)樣品中是否含有重金屬中的應(yīng)用；權(quán)利要求6或7所述酶聯(lián)免疫試劑盒在檢測(cè)樣品中是否含有重金屬中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種酶標(biāo)物及其應(yīng)用。該重金屬酶標(biāo)物，是絡(luò)合物與酶形成的交聯(lián)物；所述絡(luò)合物為螯合劑與載體蛋白的偶聯(lián)物與重金屬形成的絡(luò)合物。本發(fā)明所提供的制備銅離子酶標(biāo)物的制備方法簡(jiǎn)單，合成成本低，HRP活性損失小。用本發(fā)明方法制備的酶標(biāo)物所建立的ELISA檢測(cè)方法具有很高的靈敏度。本發(fā)明的制備銅離子ELISA檢測(cè)用酶標(biāo)物的方法對(duì)其他重金屬ELISA檢測(cè)用酶標(biāo)物的成功制備具有重要的參考價(jià)值，由該方法建立的銅離子快速免疫檢測(cè)方法將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/91GK101949921SQ201010253930
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者南鐵貴, 孫碩, 曹振, 李召虎, 王保民, 王敏, 譚桂玉, 趙洪偉, 高巍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)