雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，以及其在介導(dǎo)對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒（ORSV）的抗性中的應(yīng)用。本發(fā)明的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，其序列如SeqIDNo：1所示。本發(fā)明應(yīng)用于通過基因轉(zhuǎn)化技術(shù)選育雙抗兩種病毒的蝴蝶蘭新品種，可有效的防治蝴蝶蘭生產(chǎn)上的建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。
【專利說明】雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，以及其在介導(dǎo)對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)的抗性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蝴蝶蘭(Phalaenopsis ssp.)為蘭科蝴蝶蘭屬花丼，于1750年最早被發(fā)現(xiàn),迄今已發(fā)現(xiàn)七十多個原生種，在中國臺灣和泰國、菲律賓、馬來西亞、印度尼西亞等地均有分布。蝴蝶蘭因其花形優(yōu)美，顏色華麗，為熱帶蘭中的珍品，有“蘭中皇后”之美譽，再加上耐貯運、宜于室內(nèi)擺放、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點成為花卉業(yè)的新寵，蝴蝶蘭盆花已成為全球重要的農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)。近幾年我國蝴蝶蘭生產(chǎn)發(fā)展迅速，1997年大陸蝴蝶蘭生產(chǎn)企業(yè)屈指可數(shù)，年上市量僅有20萬株左右，而到2003年蝴蝶蘭上市量超過1，000萬株，產(chǎn)值達(dá)5億元，2010年，我國蝴蝶蘭年宵花上市量已達(dá)到2，610萬株。
[0003]隨著我國蝴蝶蘭的大規(guī)模種植，病害也日趨嚴(yán)重。蝴蝶蘭病毒病是蝴蝶蘭上的一類重要病害，由于蝴蝶蘭大多在生產(chǎn)上依靠組織培養(yǎng)進行無性繁殖，病毒在營養(yǎng)器官中不斷積累，同時病毒還會通過組織培養(yǎng)和溫室內(nèi)植株管理造成的傷口進行傳播，使蝴蝶蘭病毒防治困難，嚴(yán)重影響蝴蝶蘭的生長和觀賞品質(zhì)，并且歐美等國家對蝴蝶蘭病毒檢疫非常嚴(yán)格，帶有病毒病的出口蝴蝶蘭種苗和成品給我國出口企業(yè)造成巨大損失。目前生產(chǎn)上還沒有有效的藥物進行防治蝴蝶蘭病毒病，只能通過淘汰病株和莖尖培養(yǎng)脫毒進行防治，但莖尖脫毒技術(shù)操作難度大，耗費大量的人力物力，脫毒效果有時并不理想，并且在擴繁和栽培過程中還會感染病毒，因此利用基因工程等技術(shù)選育蝴蝶蘭抗病品種成為生產(chǎn)上的迫切需要。
[0004]目前，世界上已報導(dǎo)的蘭花病毒有:建蘭花葉病毒、齒蘭環(huán)斑病毒、建蘭輕性花葉病毒、建蘭環(huán)斑病毒、番茄環(huán)斑病毒、萬代蘭花葉病毒、石斛蘭花葉病毒、洋蘭斑點病毒和黃瓜花葉病毒等10來種病毒，其中以建蘭花葉病毒(Cymbidium mosaic virus, CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)發(fā)生最為普遍。建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒是侵染蝴蝶蘭的兩種主要病毒病原。
[0005]CymMV 隸屬線形病毒科、馬鈴薯X病毒屬，線狀粒子長475nm~490nm、直徑13nm。ORSV隸屬煙草花葉病毒屬，桿狀粒子長300nm、直徑18nm。兩種病毒可單獨侵染或復(fù)合侵染蘭科植物，引起花葉、壞死、葉脈褪綠、條斑等癥狀，復(fù)合侵染時可導(dǎo)致植株矮化，葉片畸形等重癥，造成蝴蝶蘭、石槲蘭、大花惠蘭、文心蘭等多種熱帶蘭及國蘭產(chǎn)生嚴(yán)重病害，大大降低蘭花的商品價值。我國報導(dǎo)蘭花病毒始于1983年朱本明等從上海的蘭花上分離到兩種病毒，鑒定為建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。沈淑琳(1990)對這兩種病毒的生物、生化特性進一步系統(tǒng)研究，證實是我國蘭花上最主要的病毒。
[0006]蝴蝶蘭病毒主要通過介體或汁液傳播。介體是重要的傳播途徑，可通過蚜蟲、線蟲、螨類等進行傳播。汁液傳播是通過葉片的相互摩擦，或人的組織培養(yǎng)和田間作業(yè)，使健康葉片造成微傷，導(dǎo)致病毒傳播。通過上述兩種途徑使蝴蝶蘭感染病毒，并通過組培擴繁傳至下一無性世代，從而在蝴蝶蘭營養(yǎng)體中長期積累，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降。
[0007]RNA干擾(RNA interference, RNAi)是最近幾年發(fā)展起來的一門新興的在轉(zhuǎn)錄水平上的基因阻斷技術(shù)。是一種雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平上關(guān)閉相應(yīng)序列基因的表達(dá)或使其沉默的過程，也就是序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。不同的有機體,包括植物、果蜆、線蟲及一些哺乳動物大多能利用RNA干擾機制來抵御病毒及其他外來核酸的侵人。提示它可能是生物體的一種進化保守機制。同時也可能成為特異性沉默內(nèi)源基因和基因功能分析的一個革命性工具。
[0008]根據(jù)一些實驗結(jié)果推測RNAi發(fā)生的主要過程大致分為三個階段:(I)起始階段，dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被Rnase III (如Dicer)均勻切割成21_25nt大小的siRNA。dsRNA可以是外源的(如病毒RNA復(fù)制中間體或是人工導(dǎo)入的dsRNA)，也可以是內(nèi)源的(如細(xì)胞中單鏈RNA在RNA依賴RNA聚合酶(RdRP)的作用下形成的dsRNA)。siRNA的長短是種族特異的，5’端是磷酸化的，3’端往往突出2個nts。(2)擴增階段，siRNA與mRNA靶向性結(jié)合，并作為引物，在RdRP作用下再次形 成dsRNA，dsRNA又被切割成siRNA，新形成的siRNA又可以進入下一輪循環(huán)而達(dá)到擴增的目的。(3)效應(yīng)階段，SiNRA和內(nèi)切核酸以及其他蛋白一切形成RISC(RNA induced silencing complex)。RISC的核酸部分起到革巴向性的作用，蛋白部分則起到降解mRNA的作用。RNAi的生物學(xué)意義就在于它起到了監(jiān)視和抑制異常的或外源的遺傳物質(zhì)在細(xì)胞的存在，維持本身遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性。
[0009]將病毒的某一序列設(shè)計成雙鏈結(jié)構(gòu)導(dǎo)進植物體使之表達(dá)，可誘發(fā)RNA沉默強化植物體內(nèi)自然的RNA沉默抗病毒能力，這使得高抗病毒性的轉(zhuǎn)基因植物的獲得成為可能。Waterhouse等利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片斷構(gòu)建IRS載體進行煙草轉(zhuǎn)化，獲得抗性植株。Wang等利用含有大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf virus, BYDV)PAV株系的復(fù)制酶基因片斷構(gòu)建成可產(chǎn)生發(fā)夾式RNA結(jié)構(gòu)的載體，并將該載體導(dǎo)進大麥得到強抗性植株并得到穩(wěn)定遺傳。Kalantids等在轉(zhuǎn)黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaic virus, CMV) cDNA反向重復(fù)序列的再生煙草植株中檢測到一個完全抗性的株系，并且證實煙草病毒抗性直接與siRNA的產(chǎn)生相關(guān)。同時接種病毒的轉(zhuǎn)化植物體表現(xiàn)出敏感型、恢復(fù)型(表現(xiàn)癥狀但新長出的葉片無癥狀)、完全抗性3種表型。其中的敏感型盡管對病毒敏感，但癥狀要比對照輕得多。這三種表型除了說明RNA沉默信號在植物體內(nèi)可以擴散產(chǎn)生系統(tǒng)性沉默外，還說明利用RNA沉默手段獲得的抗性植株的抗性強度大小并不完全一致。
[0010]在RNA沉默抗病毒的方法研究上，Tenllado等觀察了以直接注射和農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩種方式將病毒dsRNA導(dǎo)進植物葉片細(xì)胞后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方式都成功阻止了煙草蝕刻病毒(Tobacco etch virus, TEV)、辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)和苜猜花葉病毒(Alfalfamosaic virus, AMV)的侵染過程。同時他們還將用于直接注射的dsRNA進行稀釋處理發(fā)現(xiàn)dsRNA誘導(dǎo)的植物病毒抗性是dsRNA劑量依靠的，這與在動物上得出的結(jié)論一致。而Pandolfini等的實驗結(jié)果表明，即使導(dǎo)進煙草的李痘病毒(Plumpoxvirus, PPV)基因組片斷含有可剪切的內(nèi)含子序列，在轉(zhuǎn)化體中也可以檢測到轉(zhuǎn)化片斷siRNA的存在，并表現(xiàn)出對PPV侵染的系統(tǒng)抗性。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，使該載體通過農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化蝴蝶蘭后，可同時干擾建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因表達(dá)，可同時產(chǎn)生對蝴蝶蘭建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)的抗性。
[0012]本發(fā)明的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，其序列如Seq IDNo:1所示。
[0013]所述RNAi載體的構(gòu)建過程是:分別選取建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(CP)中的保守序列(Seq ID No:2、Seq ID No:3);將兩部分嵌合并構(gòu)建反向重復(fù)序列(Seq ID No:4)，插入到內(nèi)含子兩端，克隆到雙元植物表達(dá)載體pCAMBIA1301_220中，得到RNAi植物雙元表達(dá)載體pRNA1-CP。
[0014]本發(fā)明構(gòu)建的利用雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，選取建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因(CP)中的保守序列，利用hpRNA沉默策略不僅可以獲得較高抗性的轉(zhuǎn)基因植株，而且由于不表達(dá)病毒蛋白，能減少人們對攜帶病毒基因的轉(zhuǎn)基因作物安全性的顧慮，使種質(zhì)創(chuàng)新目的性更強也更加安全有效；在高保守區(qū)段設(shè)計靶序列，并且只需20bp的同源序列就能引起病毒沉默，能避免病毒因非保守區(qū)的高突變率而產(chǎn)生的耐抗性突變株；同時還可以將建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因序列串聯(lián)起來而獲得對建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒兩個病毒的廣譜抗性。本發(fā)明應(yīng)用于通過基因轉(zhuǎn)化技術(shù)選育雙抗兩種病毒的蝴蝶蘭新品種，可有效的防治蝴蝶蘭生產(chǎn)上的建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明實施例如下:
[0016]1、構(gòu)建建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因融合片段
[0017]分別根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因設(shè)計引物(表 I),擴增長度為 238bp 和 380bp，分別利用引物 CyMVCP-SacIF/CyMVCP-R 和 0RSVCP-F/ORSVCP-KpnR,以含有建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的cDNA為模板，進行PCR擴增反應(yīng)，擴增采用 50 μ L 體系:模板 2.5μ L,引物各 2.5μ L (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各
2.5mmol/L), 10 XPCR Buffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 33 μ L 滅菌超純水補齊。擴增程序為:94°C預(yù)變性5min ;(94°C變性30s，55°C退火30s，72。。延伸lmin) 35個循環(huán)；72°C后延伸lOmin。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用回收純化試劑盒進行純化去除引物及引物二聚體，回收目標(biāo)條帶。
[0018]利用融合PCR技術(shù)連接兩個病毒外殼蛋白基因序列，在引物CyMVCP-Sac IF和ORSVCP-KpnR作用下，以回收后的產(chǎn)物為模板，進行PCR融合。融合采用50 μ L體系:模板各 2.5 μ L，引物各 2.5 yL (10ymol/L), dNTP Mixture4.0 μ L (各 2.5mmol/L)，10XPCRBuffer (Mg2+plus) 5.0 μ L, TaqE0.5 μ L, 30.5 μ L滅菌超純水補齊。融合條件同以上PCR擴增程序。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，用回收純化試劑盒進行純化去除引物及引物二聚體，回收618bp的目標(biāo)條帶。[0019]表1PCR擴增所用弓丨物序列
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一種雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，其序列如Seq ID No:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體，其特征是:所述RNAi載體的構(gòu)建過程是，分別選取建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒外殼蛋白基因中的保守序列Seq ID No:2、Seq ID No:3 ;將兩部分嵌合并構(gòu)建反向重復(fù)序列Seq ID No -A,插入到內(nèi)含子兩端，克隆到雙元植物表達(dá)載體PCAMBIA1301-220中，得到RNAi植物雙元表達(dá)載體pRNA1-CP。
3.權(quán)利要求1所述雙抗蝴蝶蘭建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒的RNAi載體用于防治蝴蝶蘭生產(chǎn)上的建 蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。
【文檔編號】A01H5/00GK103993033SQ201410049351
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年2月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月12日
【發(fā)明者】言燕華, 王廣東, 張昌偉, 韋武青, 馬志虎 申請人:鎮(zhèn)江市蔬菜研究所