一種百菌清酶聯(lián)免疫檢測方法
【專利摘要】一種百菌清酶聯(lián)免疫檢測方法，屬于酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明公開了一種百菌清單克隆抗體酶聯(lián)免疫檢測方法，利用合成的百菌清免疫原免疫BALB/c小鼠得到單克隆抗體，以百菌清為標準品，以百菌清半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立了百菌清的間接ELISA方法，為百菌清的殘留檢測提供了快速高效的檢測方法，最低檢測限為0.06ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為0.3ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性和親和性使ELISA檢測百菌清具有極高的選擇性和靈敏度。
【專利說明】一種百菌清酶聯(lián)免疫檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種百菌清酶聯(lián)免疫檢測方法，涉及一種農(nóng)藥殘留檢測方法，更具體的說是用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)檢測百菌清的殘留。屬于酶聯(lián)免疫檢測(ELISA)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]百菌清是一種廣譜有機氯殺菌劑，對各種農(nóng)作物及各種綠化草坪等的真菌病害具有預(yù)防作用。百菌清沒有內(nèi)吸傳導(dǎo)作用，但一旦噴到植物體上之后，就能在其體表具有良好的黏著性，不易被雨水沖刷掉，因此藥效期較長，再加上其廣泛使用，因此，百菌清及其代謝產(chǎn)物在植物與土壤都有較大的殘留，甚至在北極地區(qū)都有檢測到。目前檢測百菌清的方法主要是氣相色譜法(GC)和液相色譜法(HPLC)等儀器方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測，因此建立一種快速簡便的百菌清檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法(ELISA)是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，然而得到高親和力和高特異性的單克隆單體是免疫學(xué)檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是建立了百菌清殘留ELISA檢測方法，為百菌清殘留檢測提供了快速高效的檢測手段。最低檢測限為0.06ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為0.3ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性和親和性使ELISA檢測百菌清具有極高的選擇性和靈敏度。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案，首先通過6-氨基己酸與百菌清原藥反應(yīng)獲得半抗原，再用EDC方法與BSA偶聯(lián)得到完全抗原，免疫BALB/c小鼠得到單克隆抗體，再將半抗原和OVA反應(yīng)制備包被原，以百菌清為標準品，建立百菌清殘留的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法。
[0005]本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn):
(1)以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被原，從2Pg/mL開始倍比稀釋，稀釋4個濃度，稀釋后加入酶標板中，每孔100yL;4°C孵育過夜，封閉、洗滌；
(2)將4個濃度梯度的百菌清標準品加入酶標板中，每孔50μ L ;同時加入以抗體稀釋液稀釋為1: 1000?1: 8000的單克隆抗體，每孔50yL;37°C競爭30min，再用含吐溫的磷酸鹽緩沖液PBST洗滌3次，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，IOOyL/孔，37°C作用0.5h，再用PBST洗滌3次；
所述 PBST 溶液:含 0.05% Tween-20 的 0.0lM PBS 溶液；
所述封閉液:含0.1 %明膠的pH 9.6,0.05M碳酸鹽緩沖溶液；
所述抗體稀釋液:含0.1%明膠的PBST溶液；
(3)配置顯色液
A液:配方為每IOOmL超純水中加入0.933g檸檬酸，3.68g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H2O2 ；
B液:配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于IOOmL乙二醇中；使用前將A液與B液以5: I體積比混合；
(4)加入顯色液100yL，37°C顯色15min;加入終止液2M硫酸溶液100 μ L/孔，酶標儀450nm測吸光值OD，根據(jù)不同濃度百菌清標準液的吸光值繪制百菌清濃度-吸光值標準曲線；
(5)樣品檢測:將待測樣品按步驟(1)~(4)進行操作，所得酶標儀450nm測吸光值OD與所作標準曲線對比算出待測樣品中的百菌清含量。
[0006]主要溶液配制
I)配制磷酸鹽0.01M PBS緩沖液:
Na2HPO4.12H20 3.62g KH2PO40.2g
NaCl0.2g
KCl8.0g
加超純水稀釋至lOOOmL。
[0007]2)配制碳酸鹽(CBS)緩沖溶液(0.05M)pH9.6 Na2CO31.59g
NaHCO32.93g
加超純水稀釋至lOOOmL。
[0008]3)配制 PBST 溶液:含 0.05% Tween-20 的 PBS 溶液。
[0009]4)配制封閉液:含0.1 %明膠的pH 9.6,0.05M碳酸鹽緩沖溶液。
[0010]5)配制抗體稀釋液:含0.1 %明膠的PBST溶液。
[0011]6)顯色液:
A 液:0.933g 檸檬酸，3.68g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30% H2O2 用超純水定容至 IOOmL0
[0012]B液:60mg 3，3，5，5_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶于IOOmL乙二醇中；使用前將A液與B液以5: I體積比混合。
[0013]7)終止液:2M 的 H2S04。
[0014]間接競爭ELISA實驗方法的步驟如下:
百菌清標準品母液為10(^8/1^，基質(zhì)為正己烷母液，在41:保存待用。標品稀釋液為15% 甲醇-PBS。
[0015]a、包被:用設(shè)定濃度的包被原包被酶聯(lián)反應(yīng)板，100 μ L/孔，4°C過夜； b、洗滌:用PBST洗滌反應(yīng)板三次，每次3min，200 μ L/孔，然后甩干反應(yīng)板；
C、封閉:含0.1%明膠的085，20(^17孔，37°C封閉2h ；
d、洗漆:同b;
e、競爭:用15%甲醇-PBS將百菌清母液稀釋成0.0185，0.039，0.156，0.3125，0.625，1.25，2.5 ng/mL系列濃度，另設(shè)一個15%甲醇-PBS空白對照，50 μ L/孔；然后每孔加入50 μ L稀釋4000倍的抗血清，于37°C溫育0.5h ；
f、洗漆:同b;
g、加酶標二抗(HRP-羊抗鼠IgG，l: 3000)，10(^17孔，37°〇反應(yīng)0.511;
h、洗漆:同b;
1、顯色:加TMB配制的顯色液100μ L/孔,顯色15min ； j、終止:加終止液100 μ L/孔。
[0016]k、測定:用酶標儀檢測OD 45_。
[0017]本發(fā)明的有益效果:以百菌清半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立了百菌清的間接ELISA方法，為百菌清的殘留檢測提供了快速高效的檢測手段。最低檢測限為
0.06ng/mL、半數(shù)抑制量(IC50)為0.3ng/mL。免疫反應(yīng)的高特異性與高親和性使ELISA具有極高的選擇性和靈敏度，從而樣品前處理過程簡單。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1百菌清的標準抑制曲線。
【具體實施方式】
[0019]以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。
[0020]一、儀器:
TGL-40B臺式低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠
KFLOff純水機凱佛隆公司
ZD-9556水平搖床太倉科教器材廠
Costar 96孔8X 12可拆酶標板上海吉泰生物科技有限公司
MuLtiska Mks 酶標儀Thermo Labsystems 公司
可調(diào)試移液器Thermo Labsystems公司
渦旋混合器上海滬西儀器分析。
[0021]二、試劑:
辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(HRP-1gG)康成生物工程公司 四甲基聯(lián)苯胺(TMB)華美生物工程公司
其他試劑均為分析純試劑。
[0022]三、步驟
1、免疫原和包被原的合成
免疫原用碳二亞胺法將百菌清半抗原與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)得到，用混合酸酐法將百菌清半抗原與卵清蛋白OVA偶聯(lián)合成包被原，具體步驟如下:
免疫原的制備
稱取百菌清半抗原35.8mg, EDC 56.9mg, NHS 35.6mg,用ImL無水DMF溶解(稱為A液)，室溫攪拌反應(yīng)8h。稱取BSA 112mg溶于20mL、pH 7.2的0.0lmol/L PBS中(稱為B液)，在室溫條件，逐滴將A液加入到B液中，室溫反應(yīng)過夜，即得免疫原混合液。
[0023]透析袋前處理:取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗3min，保存在4°C去離子水中備用；
將偶聯(lián)物免疫原混合液放入透析袋于0.0lmol/L的PBS中透析3天，每天三次換液。
[0024]包被原制備
稱取40mg半抗原，溶于ImL無水DMF，先后滴加32 μ L三正丁胺和17.5μ L的氯甲酸異丁酯(稱為A液)，4°C攪拌反應(yīng)lh。稱取OVA 166mg溶于30mL的PBS中(稱為B液)。在4°C下,逐滴將A液加入到B液中,4V反應(yīng)5h,即得包被原混合液。[0025]透析袋前處理:取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗3min，保存在4°C去離子水中備用；
將包被原混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次換液。
[0026]2、抗血清(單克隆抗體)的制備
1)實驗動物:選12只BALB/c小鼠，每4只為一個實驗組；
2)抗原配置:將免疫原用生理鹽水溶解，配成2mg/mL的溶液；
3)乳化:將上述溶液與等量完全或不完全弗氏佐劑用混合攪拌法將其乳化，直將一滴乳劑滴入水中，不散開漂在水面；
4)免疫方法:初次免疫將乳化好的試劑于小鼠背部多點注射，ImL/只；初次免疫后的免疫稱為加強免疫，加強免疫用弗氏不完全佐劑乳化，加強免疫于皮下注射，3周加強免疫一次，劑量與初次免疫的一半；
5)采血:4次加強免疫后從尾巴采血，采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價和抑制效果，待效價和抑制達到要求后，進行融合；
6)融合:通過聚乙二醇(PEG4000)法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接ELISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株；
7)抗體的制備:取8-10周齡BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油ImL ；7天后每只小鼠腹腔注射I X IO6雜交瘤細胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于_20°C保存。
[0027]3、ELISA 反應(yīng)過程
(1)包被:將包被原CTNH-OVA用0.05M pH9.6碳酸鹽緩沖液從2Pg/mL開始倍比稀釋，IOOyL/孔，37°C反應(yīng) 2h ；
(2)洗滌:將板內(nèi)溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
(3)封閉:拍干后，加入200μL /孔封閉液，37°C反應(yīng)2h，洗滌后烘干備用；
(4)加樣:將抗血清從1:1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，IOOyL/孔，37°C反應(yīng)Ih ;充分洗滌后，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，100 μ L /孔，37°C反應(yīng)Ih0
[0028](5)顯色:將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入IOOyL的TMB顯色液，37 °C避光反應(yīng)15min。
[0029](6)終止和測定:每孔加入50 μ L終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標儀測定各孔的OD450 值。
[0030]4、回收率及樣品提取方法的確定
稱取Ig粉碎的黃瓜樣品置入IOOmL三角瓶中，分別添加IOygUOyg和2.5yg百菌清。向樣品加入10 mL丙酮震蕩均勻后，超聲提取15 min，凈置后上清用N2吹干，再用甲醇溶解，采用間接競爭ELISA進行添加回收試驗。
[0031]回收率的計算:根據(jù)不同添加濃度的樣品OD值計算相應(yīng)的抑制率，再根據(jù)相應(yīng)的抑制率從標準曲線上查到各自的濃度，檢測濃度與真實濃度之比為對應(yīng)濃度的回收率。
[0032]試驗結(jié)果如下:標準曲線:本實驗所獲得的抗體的半抑制率(IC50)為0.3ng/mL，具體請見圖1。
[0033]靈敏度:靈敏度是所得90%最大吸光值所對應(yīng)的標準品的濃度，即IC 90為
0.06ng/mL。
[0034]交叉反應(yīng)率(CR%):利用百菌清結(jié)構(gòu)類似物和一些農(nóng)藥進行交叉反應(yīng)研究。CR=IC50 (交叉物質(zhì))/IC50 (百菌清)，由下表可知，此抗體特異性很好，符合多殘留ELISA方法檢測的要求。
[0035]表1交叉反應(yīng)率的測定
【權(quán)利要求】
1.一種百菌清酶聯(lián)免疫檢測方法，其特征在于利用合成的百菌清免疫原免疫BALB/c小鼠得到單克隆抗體，以百菌清為標準品，以百菌清半抗原與OVA的偶聯(lián)物作為包被原，建立百菌清的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法，步驟如下: (1)以0.05M的碳酸鹽緩沖溶液稀釋包被原，從2Pg/mL開始倍比稀釋，稀釋4個濃度，稀釋后加入酶標板中，每孔100yL;4°C孵育過夜，封閉、洗滌； (2)將4個濃度梯度的百菌清標準品加入酶標板中，每孔50μ L ;同時加入以抗體稀釋液稀釋為1: 1000~1: 8000的單克隆抗體，每孔50yL;37°C競爭30min，再用含吐溫的磷酸鹽緩沖液PBST洗滌3次，加入1:3000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，IOOyL/孔，37°C作用.0.5h，再用PBST洗滌3次； 所述 PBST 溶液:含 0.05% Tween-20 的 0.01M PBS 溶液； 所述封閉液:含0.1 %明膠的pH 9.6,0.05M碳酸鹽緩沖溶液； 所述抗體稀釋液:含0.1%明膠的PBST溶液； (3)配置顯色液 A液:配方為每IOOmL超純水中加入0.933g檸檬酸，3.68g Na2HPO4.12H20,18 μ L 30%H2O2 ； B液:配方為60mg四甲基聯(lián)苯胺溶于IOOmL乙二醇中；使用前將A液與B液以5:1體積比混合； (4)加入顯色液100yL，37°C顯色15min;加入終止液2M硫酸溶液100 μ L/孔，酶標儀450nm測吸光值0D，根據(jù)不同濃度百菌清標準液的吸光值繪制百菌清濃度-吸光值標準曲線； (5)樣品檢測:將待測樣品按步驟(1)~(4)進行操作，所得酶標儀450nm測吸光值OD與所作標準曲線對比算出待測樣品中的百菌清含量。
【文檔編號】G01N33/577GK104020290SQ201410291523
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】胥傳來, 嚴會娟, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學(xué)