本發(fā)明屬于醫(yī)療器械領(lǐng)域，具體涉及到一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒。

背景技術(shù)：

目前血清淀粉樣蛋白A(SAA)的檢測試劑盒不僅可以定性，也可以做到定量檢測。SAA的檢測方法主要有散射比濁法、膠體金法、酶聯(lián)免疫法。

散射比濁法是抗原抗體復合物微粒通過對入射光的折射和衍射形成散射光，其強度與抗原抗體復合物的量呈正相關(guān)，但由于檢測成本相對較高，需配套儀器等原因，該方法尚未在臨床中廣泛應(yīng)用。膠體金法以膠體金為標記物，利用抗原抗體反應(yīng)，對抗原抗體進行定性及半定量研究的技術(shù)，因其操作快速簡便、穩(wěn)定性強、價格低廉等優(yōu)點已在臨床檢驗中取得廣泛的應(yīng)用，但是只能進行定性或半定量檢測，容易漏檢弱陽性樣本。酶聯(lián)免疫法是讓抗體與酶復合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測，該方法檢測速度快、費用低廉、儀器簡單易攜、靈敏度高和選擇性強等優(yōu)點，可用于現(xiàn)場檢驗，但其特異性和重復性有待提高。

目前與本發(fā)明相近的熒光定量免疫層析技術(shù)，是免疫熒光技術(shù)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合發(fā)展創(chuàng)新的一種定量新型檢測技術(shù)。中國專利申請?zhí)?01610196332.0(申請日為2016.03.31)的《雙檢測線SAA免疫熒光層析定量檢測試劑及其制備方法》公開了一種SAA免疫熒光層析定量檢測試劑及其制備方法，采用雙檢測線形式檢測SAA，對不同濃度的SAA利用不同的測量數(shù)據(jù)計算SAA含量，操作比較復雜，且利用熒光微球進行標記的效率比較低。中國專利申請?zhí)?01510583004.1(申請日為2015.09.14)的《一種CRP/SAA定量聯(lián)合檢測免疫熒光層析試紙及其制備方法》公開了一種CRP/SAA定量聯(lián)合檢測免疫熒光層析試紙，該專利技術(shù)使用SAA單克隆抗體與樣品中的SAA特異性結(jié)合，特異性較低，且熒光微球標記抗體的效率比較低。熒光定量免疫層析技術(shù)保留了膠體金免疫層析技術(shù)操作簡便、檢測快速、便攜性強的優(yōu)點，但是使用傳統(tǒng)的試紙條進行反應(yīng)，樣品混合不完全，反應(yīng)活性低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒及其檢測方法，試劑盒內(nèi)的檢測緩沖液采用熒光染料標記SAA抗體或者用標記生物素-親和素法標記的SAA抗體，可準確高效的測定SAA含量，僅需3分鐘時間即可得到測量結(jié)果。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒，包括檢測緩沖液、檢測板和ID芯片，所述檢測緩沖液為熒光染料標記或者標記生物素-親和素法標記的SAA單克隆抗體；

所述ID芯片已確定好了線性，由該試劑盒配套的免疫熒光定量分析儀檢測系列質(zhì)控品得到；

所述檢測板包括外包裝板和試紙條，外包裝板包括上包裝板和下包裝板，試紙條放在上包裝板和下包裝板之間，下包裝板上設(shè)有放置試紙條的卡槽，上包裝板和下包裝板相扣合，上包裝板上設(shè)有加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸水區(qū)，所述試紙條包括底板，底板上與加樣區(qū)、反應(yīng)區(qū)和吸水區(qū)對應(yīng)位置并列設(shè)有玻璃纖維、固相抗體反應(yīng)膜和吸水紙。

所述檢測板和試紙條均為長條狀。

所述玻璃纖維、固相抗體反應(yīng)膜和吸水紙之間緊密相連并且有部分重疊。

所述固相抗體反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上包被有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被有與檢測緩沖液中標記的SAA單克隆抗體配對的SAA單克隆抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗體。

本發(fā)明還提供了一種血清淀粉樣蛋白A定量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)檢測緩沖液的制備：

方法一：熒光染料標記SAA單克隆抗體

制備步驟如下：

SAA單克隆抗體的制備：取SAA單克隆抗體，12000轉(zhuǎn)/分離心10min后，用超純水稀釋至濃度為1-3mg/mL，加入10μL的1mol/L NaHCO₃，混勻；

熒光染料的制備：取熒光染料，用無水DMSO稀釋至濃度為10mmol/L；

按照摩爾比為1:8-1:10的比例將SAA單克隆抗體和熒光染料混合，室溫標記1-2h；之后將標記好的SAA單克隆抗體裝入透析袋中，放入裝有PBS的燒杯中，置2-8℃冰箱中攪拌15h-24h，純化，然后加入標記物稀釋液稀釋至1000-1500倍；

方法二：標記生物素-親和素法標記SAA單克隆抗體

制備步驟如下：

SAA單克隆抗體的制備：取SAA單克隆抗體，使用PBS透析1-2天；

將生物素和SAA單克隆抗體按照體積比10:1的比例混合，室溫反應(yīng)2h，得到生物素化的SAA單克隆抗體；

使用超純水溶解親和素粉末，配置成5-8mg/ml的親和素溶液，將熒光染料和親和素溶液以體積比8:1的比例混合，室溫下反應(yīng)2h，得到熒光染料標記的親和素；

將熒光染料標記的親和素和生物素化的SAA單克隆抗體以體積比6:1的比例混合，室溫下透析48h；

(2)檢測板的制備：

將配制好的0.8-1.2mg/mL SAA單克隆抗體和1.0-1.5mg/mL羊抗鼠抗體包被于硝酸纖維素膜上，在35℃條件下干燥2h，按順序依次將玻璃纖維、固相抗體反應(yīng)膜、上端吸水紙組裝在底板上，得到試紙條，將試紙條裁切，放入下包裝板的卡槽內(nèi)，之后將上包裝板和下包裝板相扣合。

(3)ID芯片的制備

將購買的SAA抗原稀釋，濃度分別為3mg/L、6mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，經(jīng)標定合格后分裝，然后用免疫熒光定量分析儀檢測系列質(zhì)控品，以T/C值和理論濃度做擬合曲線，將確定好的線性寫入相應(yīng)批號的ID芯片。

本發(fā)明檢測試劑盒的檢測原理為：樣品加入到檢測緩沖液中形成混合樣本，檢測緩沖液中熒光染料標記或標記生物素-親和素法標記的SAA單克隆抗體和樣品中的SAA抗原結(jié)合形成抗原抗體復合物，通過上包裝板上的加樣區(qū)滴加混合樣本，混合樣本在擴散的過程中，抗原抗體復合物被檢測線上的SAA單克隆抗體所捕獲，因此，樣品中的SAA含量越多，在檢測線上抗原抗體復合物積累量越多，熒光抗體的信號強弱反映了被捕獲的SAA數(shù)量的多少。

有益效果：

(1)本發(fā)明采用熒光染料標記SAA單克隆抗體，特異性好，抗干擾能力強，可排除因檢測樣品中各種各樣的蛋白質(zhì)的非特異性吸附而產(chǎn)生的干擾，使熒光標記的抗體與其配對的抗體與樣品中的抗原緊密結(jié)合在一起，所形成的雙抗體夾心免疫復合物穩(wěn)定性好，具有靈敏度高，特異性強等優(yōu)點。

(2)本發(fā)明以液相反應(yīng)代替固相反應(yīng)，與傳統(tǒng)的試紙條檢測方法相比，液相反應(yīng)具有材料混合均勻，穩(wěn)定性好，反應(yīng)活性高等優(yōu)勢，提高了檢測結(jié)果的準確性。

(3)本發(fā)明采用標記生物素-親和素法標記SAA單克隆抗體，本方法具有多級放大作用，可極大的提高檢測結(jié)果的靈敏度和標記效果，同時降低了成本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明檢測板結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明下包裝板結(jié)構(gòu)示意圖。

其中，1玻璃纖維，2固相抗體反應(yīng)膜，3吸水紙，4底板，5檢測線，6質(zhì)控線，7試紙條，8加樣區(qū)，9反應(yīng)區(qū)，10吸水區(qū)，11上包裝板，12下包裝板，13卡槽。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明。

實施例1

一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒，包括檢測緩沖液、檢測板和ID芯片，所述檢測緩沖液為熒光染料標記或者標記生物素-親和素法標記的SAA單克隆抗體；

所述檢測板包括外包裝板和試紙條7，外包裝板包括上包裝板11和下包裝板12，試紙條放在上包裝板11和下包裝板12之間，下包裝板12上設(shè)有放置試紙條的卡槽13，上包裝板11和下包裝板12相扣合，上包裝板11上設(shè)有加樣區(qū)8、反應(yīng)區(qū)9和吸水區(qū)10，所述試紙條包括底板4，底板4上與加樣區(qū)8、反應(yīng)區(qū)9和吸水區(qū)10對應(yīng)位置并列設(shè)有玻璃纖維1、固相抗體反應(yīng)膜2和吸水紙3，所述ID芯片已經(jīng)確定好線性，由該試劑盒配套的免疫熒光定量分析儀檢測系列質(zhì)控品得到。

所述檢測板和試紙條7均為長條狀。

所述玻璃纖維1、固相抗體反應(yīng)膜2和吸水紙3之間緊密相連并且有部分重疊。

所述固相抗體反應(yīng)膜2為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上包被有檢測線5和質(zhì)控線6，所述檢測線5包被有與檢測緩沖液中標記的SAA單克隆抗體配對的SAA單克隆抗體，所述質(zhì)控線6包被有羊抗鼠抗體。

所述底板4為低熒光特性，承載膜結(jié)構(gòu)，根據(jù)試紙條7的形狀對應(yīng)裁剪而成，本實施例為長條狀。本實施例中玻璃纖維1為待檢樣品收集區(qū)，其前端搭接粘貼于底板4前端上，后端搭接覆蓋在硝酸纖維素膜上。

硝酸纖維素膜是一種低熒光特性膜，該膜上劃設(shè)有兩條相互平行的檢測線5和質(zhì)控線6，檢測線5和質(zhì)控線6與硝酸纖維素膜的縱軸線垂直，相互間隔一定距離。吸水紙3的前端覆蓋在硝酸纖維素膜上。

本發(fā)明檢測板是將試紙條7放置在下包裝板12的卡槽13內(nèi)，然后將上包裝板11和下包裝板12相扣合，包裝后，外包裝板上的加樣區(qū)8對應(yīng)于試紙條7的玻璃纖維1，反應(yīng)區(qū)9對應(yīng)于試紙條7的硝酸纖維素膜，吸水區(qū)10對應(yīng)于試紙條7的吸水紙3。

實施例2

一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)檢測緩沖液的制備：

SAA單克隆抗體的制備：取SAA單克隆抗體，12000轉(zhuǎn)/分離心10min后，用超純水稀釋至濃度為2mg/mL，加入10μL的1mol/L NaHCO₃，混勻；

熒光染料的制備：取熒光染料，用無水DMSO稀釋至濃度為10mmol/L；

按照摩爾比為1:9的比例將SAA單克隆抗體和熒光染料混合，室溫標記1h；之后將標記好的SAA單克隆抗體裝入透析袋中，放入裝有PBS的燒杯中，置2-8℃冰箱中攪拌20h，純化，然后加入標記物稀釋液稀釋至1000倍；

(2)檢測板的制備：

將配制好的1.0mg/mL SAA單克隆抗體和1.5mg/mL羊抗鼠抗體包被于硝酸纖維素膜上，在35℃條件下干燥2h，按順序依次將玻璃纖維1、固相抗體反應(yīng)膜2、上端吸水紙3組裝在底板4上，得到試紙條7，將試紙條7裁切，放入位于下包裝板12的卡槽13內(nèi)，之后將上包裝板11和下包裝板12相扣合。

(3)ID芯片的制備

將購買的SAA抗原稀釋，濃度分別為3mg/L、6mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，經(jīng)標定合格后分裝，然后用免疫熒光定量分析儀檢測系列質(zhì)控品，以T/C值和理論濃度做擬合曲線，將確定好的線性寫入相應(yīng)批號的ID芯片。

使用過程中將ID芯片插入到儀器中，用移液器吸取血清或血漿加入到檢測緩沖液中并充分混勻。吸取混合樣本液加入到檢測板的加樣區(qū)8孔內(nèi)，室溫放置3分鐘。將檢測板插入到免疫熒光分析儀的樣本槽中，按“檢測”鍵，從免疫熒光分析儀的顯示屏幕上可讀取數(shù)據(jù)。

本發(fā)明檢測試劑盒的檢測原理為：樣品加入到檢測緩沖液中形成混合樣本，檢測緩沖液中熒光染料標記的SAA單克隆抗體和樣品中的SAA抗原結(jié)合形成抗原抗體復合物，通過上包裝板11上的加樣區(qū)8滴加混合樣本，混合樣本在擴散的過程中，抗原抗體復合物被檢測線5上的SAA單克隆抗體所捕獲，因此，樣品中的SAA含量越多，在檢測線5上抗原抗體復合物積累量越多，熒光抗體的信號強弱反映了被捕獲的SAA數(shù)量的多少。

本實施例采用熒光染料標記SAA單克隆抗體，特異性好，抗干擾能力強，可排除因檢測樣品中各種各樣的蛋白質(zhì)的非特異性吸附而產(chǎn)生的干擾，使熒光標記的抗體與其配對的抗體與樣品中的抗原緊密結(jié)合在一起，所形成的雙抗體夾心免疫復合物穩(wěn)定性好，具有靈敏度高，特異性強等優(yōu)點。并且檢測緩沖液中以新型熒光染料替代傳統(tǒng)的膠體金、量子點和熒光顆粒，進一步提高了檢測的靈敏度和準確性。

實施例3

一種血清淀粉樣蛋白A的定量檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：

(1)檢測緩沖液的制備：

標記生物素-親和素法標記SAA單克隆抗體

制備步驟如下：

SAA單克隆抗體的制備：取SAA單克隆抗體，使用PBS透析1天；

將生物素和SAA單克隆抗體按照體積比10:1的比例混合，室溫反應(yīng)2h，得到生物素化的SAA單克隆抗體；

使用超純水溶解親和素粉末，配置成6mg/ml的親和素溶液，將熒光染料和親和素以體積比8:1的比例混合，室溫下反應(yīng)2h，得到熒光染料標記的親和素；

將熒光染料標記的親和素和生物素化的SAA單克隆抗體以體積比6:1的比例混合，室溫下透析48h；

(2)檢測板的制備：

將配制好的1.0mg/mL SAA單克隆抗體和1.5mg/mL羊抗鼠抗體包被于硝酸纖維素膜上，在35℃條件下干燥2h，按順序依次將玻璃纖維1、固相抗體反應(yīng)膜2、上端吸水紙3組裝在底板4上，得到試紙條7，將試紙條7裁切，放入位于下包裝板12的卡槽13內(nèi)，之后將上包裝板11和下包裝板12相扣合。

(3)ID芯片的制備

將購買的SAA抗原稀釋，濃度分別為3mg/L、6mg/L、10mg/L、20mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L，經(jīng)標定合格后分裝，然后用免疫熒光定量分析儀檢測系列質(zhì)控品，以T/C值和理論濃度做擬合曲線，將確定好的線性寫入相應(yīng)批號的ID芯片。

使用過程中將ID芯片插入到儀器中，用移液器吸取血清或血漿加入到檢測緩沖液中并充分混勻。吸取混合樣本液加入到檢測板的加樣區(qū)8孔內(nèi)，室溫放置3分鐘。將檢測板插入到免疫熒光分析儀的樣本槽中，按“檢測”鍵，從免疫熒光分析儀的顯示屏幕上可讀取數(shù)據(jù)。

本發(fā)明檢測試劑盒的檢測原理為：樣品加入到檢測緩沖液中形成混合樣本，檢測緩沖液中標記生物素-親和素法標記SAA單克隆抗體和樣品中的SAA抗原結(jié)合形成抗原抗體復合物，通過上包裝板上的加樣區(qū)滴加混合樣本，混合樣本在擴散的過程中，抗原抗體復合物被檢測線上的SAA單克隆抗體所捕獲，因此，樣品中的SAA含量越多，在檢測線上抗原抗體復合物積累量越多，熒光抗體的信號強弱反映了被捕獲的SAA數(shù)量的多少。

本發(fā)明采用標記生物素-親和素法標記SAA單克隆抗體，本方法具有多級放大作用，可極大的提高檢測結(jié)果的靈敏度和標記效果，同時降低了成本。

上述雖然結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。